专利名称：一株产葡萄糖氧化酶的基因工程菌及其构建与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株产葡萄糖氧化酶的基因工程菌及其构建与应用，特别是一株诱导表达葡萄糖氧化酶基因的工程菌及其构建方法和应用。
背景技术：
葡萄糖氧化酶是生物领域中最主要的工具酶之一。自1967年Updike和Hicks将 GOD固定在Clark氧电极表面，将其应用于血糖测定以来，GOD被广泛应用于食品、饲料、医药等许多相关领域。
在食品工业中，由于氧的存在，引起许多不利于产品质量的化学反应，并为许多微生物生长创造了条件。目前，许多国家已将GOD作为工人的安全抗氧剂而广泛应用于各种食品和食品加工工艺中。虽然用途多样，GOD的作用主要在于除葡萄糖、除氧、形成过氧化氢、形成葡萄糖酸四个方面。利用其专一氧化酶的原理，制成葡萄糖氧化酶分析仪，能快速准确简易地测定各种食品中的葡萄糖含量，指导生产。
在医药工业中，GOD作为试剂盒、酶电极等用于血清(浆)、尿液及脑脊液中葡萄糖的体外定量分析；G0D制成的酶制剂还可用于除去或缓解牙斑、牙垢和龋齿的形成防止口腔疾病和牙病的发生。此外，由于可以催化生成H2O2，还可用于对H2O2敏感的淋巴瘤的导向目标的治疗。
GOD还是一种新型的酶饲料添加剂，能够改善动物肠道环境，调节饲粮消化，促进动物生长。含葡萄糖氧化酶、乳酸过氧化物和乳铁蛋白的混合饲料添加剂，可用于预防牲畜胃肠道感染、腹泻，并有促进动物生长作用。
从动植物组织中提取GOD有一定的局限，酶量亦不丰富；细菌GOD产酶量少；一般采用黑曲霉(具有GRAS资格)和青霉属菌株作为GOD生产菌。我国及美国均采用点青霉及产黄青霉生产G0D,日本常用尼崎青霉,俄罗斯用生机青霉,近年报道胶霉属(Clioctadium)、 拟青霉 属(Paecilomyces)和帚霉属(Scopulariopsis)也能生产G0D。
产量低、酶活低、检测方法复杂是GOD产业化的限制性因素，国内外为此做了大量工作并取得了明显进展。目前国外生产的GOD厂家主要是德国的Boehringer和日本的 TOYOBO0规模化生产高活性的GOD还有困难。发酵生产GOD的同时产生大量杂蛋白，分离提取复杂，成本闻。发明内容
本发明提供了一株产葡萄糖氧化酶的基因工程菌，已于2012年7月I日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉、武汉大学，保藏编号为CCTCC Ν0:Μ 2012266，分类学命名为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-pPIC9K_G0D。
本发明还提供了一株产葡萄糖氧化酶基因工程菌的构建方法，包括如下步骤
I)根据本实验室筛选保藏的黑曲霉CCTCC NO M2011291的基因为模版设计引物， 获得GOD基因；
2)将GOD基因连接到毕氏酵母表达载体PPIC9K，得到重组质粒pPIC9K_G0D ；
3)重组载体转化 Pichia pastoris GS115。
葡萄糖氧化酶酶活测定方法G0D活性测定一般采用邻-联(二)茴香胺分光光度法。在有氧条件下，GOD催化葡萄糖脱氢产生H2O2，在过氧化物酶(POD)作用下，氧供体邻-联(二)茴香胺(DH2)被氧化成棕色产物。测540nm处吸光度的变化，根据标准曲线的结果，计算葡萄糖氧化酶活力单位。
本发明的有益效果该菌株表达的葡萄糖氧化酶在摇瓶中的酶活为52U/mL，比野生菌的酶活提高了近24倍，大大降低了生产成本，这为葡萄糖氧化酶的大规模生产奠定了良好的基础。
生物材料保藏
一株产葡萄糖氧化酶的基因工程菌，该菌株为巴斯德毕赤酵母，命名为Pichia pastorisGS115-pPIC9K-G0D,已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO M2012266，保藏日期为2012年7月I日。
图1 :摇瓶中不同甲醇诱导浓度下的随时 间产葡萄糖氧化酶的能力。
图3 :重组GOD的最适温度及温度稳定性。
图3 :重组GOD的最适pH及pH稳定性。
具体实施方式
实施例1重组菌的构建及鉴定
根据本实验室筛选保藏的黑曲霉CCTCC NO M2011291的基因为模版设计引物，获得GOD基因，用限制性内切酶SnaB I和Not I双酶切消化纯化后的GOD基因和载体pPIC9K， 用T4DNA连接酶于16°C过夜连接，连接产物用化学转化法转化宿主菌JM109，转化菌液涂布在含有卡那霉素(30mg/mL)的LB平板上，37°C过夜培养，以GOD-F和GOD-R为引物进行菌落PCR的方法鉴定阳性克隆子，最终获得含有GOD基因的重组表达质粒pPIC9K-G0D，用双酶切进行验证。
将重组质粒pPIC9K-G0D电击转化Pichia pastoris GS115感受态细胞，得到基因工程菌，并经过鉴定命名为Pichia pastoris GS115_pPIC9K_G0D。
毕赤酵母的转化采用电转化法GS115于500mL YPD中培养至0D_=1. 2-1. 5， 1500g离心收集细胞；依次用400mL冰冷的无菌水洗两次细胞，再用40mL冰冷的lmol/L山梨醇洗一次细胞，重悬细胞于ImL lmol/L山梨醇。100 μ L原生质体与5_10 μ g线性化质粒 DNA (Bgl II切)混合，转入冰冷的电转杯，放置5分钟；电击细胞与DNA的混合物(1. 5kv, 4. 2-4. 9ms);加入ImL冰冷的lmol/L山梨醇，继续放置30min ;再加入0. 5mL SOS, 30° C放置2小时，偶尔摇动志菌体不易沉淀；用lmol/L山梨醇稀释菌体后涂布于固体MD培养基。 30° C培养4-6天后挑取单克隆。
实施例2重组菌的酶活测定和蛋白电泳
以实施例1获得的酵母工程菌为生产菌株，活化后，将30°C、200rpm下培养到0D_ 在1. 6-1. 7之间的种子以2%的接种量转入基本发酵培养基，于30°C、200rpm条件下培养；当OD值为1. 2-1. 5时，将酵母细胞转入BMMY培养基中诱导蛋白的产生。
培养基种子和斜面培养基为YPD培养基(IL):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，葡萄糖20g ;斜面培养基添加琼脂20g ;基本发酵培养基为BMGY培养基(1L):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甘油10mL，YNB 13. 4g，IOOmM磷酸缓冲液(pH 6. O);诱导培养基为BMMY培养基(1L):胰蛋白胨20g，酵母抽提物IOg,甲醇8mL，YNB 13. 4g，IOOmM磷酸缓冲液(pH 6.0)；
通过蛋白电泳(SDS-PAGE)得到一条分子量大小约为68kDa的蛋白条带，同时在摇瓶中验证不同甲醇诱导浓度下的随时间产葡萄糖氧化酶的能力，最高酶活为52U/mL比野生菌的酶活(2. 2U/mL)提高了近24倍(图1)。
实施例3重组蛋白的酶学性质研究
测定了重组GOD葡萄糖氧化酶在不同温度下的酶活性和在20-80° C梯度温度下的热稳定性。结果表明，重组GOD的最适温度为40° C，在20-60° C下均具有良好的热稳定性，重组GOD在60 ° C下保温3h，酶活仍可达80%，40 ° C下保温3h，酶活残留98%以上， 超过80° C后，酶活性损失严重(图2)。
P H主要通过改变酶的空间结构，影响酶分子活性中心基团的解离而影响酶的活性。重组GOD葡萄糖氧化酶分别在其最适温度下、pH2. 0-10. O的缓冲体系中测定活性，以确定其最适pH。结果表明重组GOD的最适pH为6. O。同时，将重组GOD在pH2. 0-10. O的缓冲体系中40° C保温24h后，在pH6. O下测定残留酶活，重组GOD的pH稳定范围均为 4. 0-8. 0，在此pH范围内保温24h，酶活基本保持在90%以上，pH小于4. O或大于8. O时，酶稳定性急剧下降(图3)。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。·
权利要求
1.一株产葡萄糖氧化酶的基因工程菌，于2012年7月I日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO M 2012266。
2.权利要求1所述基因工程菌，其特征在于可诱导表达外源葡萄糖氧化酶。
3.—种权利要求1所述基因工程菌的构建方法，包括如下步骤1)根据本实验室筛选保藏的黑曲霉CCTCCNO M2011291的基因为模版设计引物，获得 GOD基因；2)将葡萄糖氧化酶基因连接到毕赤酵母表达载体PPIC9K，得到重组质粒pPIC9K-G0D；3)重组载体转化Pichiapastoris GS115得到基因工程菌CCTCC NO M 2012266。
4.权利要求1所述菌株生产葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于以权利要求1所述酵母工程菌为生产菌株，活化后，将30°C、200rpm下培养到OD6tltl在1. 6-1. 7之间的种子以2% 的接种量转入基本发酵培养基，于30°C、200rpm条件下培养；当( 值为1. 2-1. 5时，将酵母细胞转入BMMY培养基中诱导蛋白的产生；种子培养基采用YPD培养基；；基本发酵培养基采用BMGY培养基；诱导培养基为BMMY 培养基中添加O. 8%的甲醇。
全文摘要
本发明公开了一种产葡萄糖氧化酶的基因工程菌及其建方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明采用重组DNA技术将黑曲霉葡萄糖氧化酶(GOD)基因克隆连接到毕赤酵母表达载体pPIC9K，并转化Pichia pastoris GS115，经筛选鉴定得到一株可以产较高活性葡萄糖氧化酶的重组毕赤酵母Pichia pastoris GS115-pPIC9K-GOD，保藏编号为CCTCC NOM2012266。该菌株表达的葡萄糖氧化酶在摇瓶中的酶活为52U/mL，比野生菌的酶活提高了近24倍，为葡萄糖氧化酶的大规模生产奠定了良好的基础。
文档编号C12N9/04GK102994406SQ201210349289
公开日2013年3月27日 申请日期2012年9月19日 优先权日2012年9月19日
发明者陈坚, 顾磊, 张娟, 堵国成, 沈依娜, 李梦洁, 李婷, 王丹, 丁雪, 殷政 申请人:江南大学