专利名称：一种含有穿膜肽的提高玉米转基因效率的转化体系及方法
技术领域：
本发明属于植物转基因领域，具体涉及一种含有穿膜肽的提高玉米转基因效率的转化体系及方法；所述的转化 体系中，含有外源DNA和穿膜肽；所述的外源DNA和穿膜肽的质量比为1:1-3。该转化方法的步骤为选取自交授粉后的玉米的果穗的苞叶和花丝，将所述的转化体系滴在切口凹陷处。
背景技术：
在玉米的转基因方法研究中，已经报道了多种可行方法可以将外源基因导入玉米中并得以稳定遗传，这些方法包括基因枪法，PEG介导法，电激法，农杆菌介导法和花粉管通道法。在这些转化方法中大多依赖于玉米的组织培养技术，玉米的组织培养受基因型和受体范围的限制比较大，而花粉管通道转化法不依赖于植物的组织培养技术，无需昂贵的仪器设备，不受自交系品种和转化基因类型的限制，以及可进行规模化转化等优点，因此备受人们的青睐。花粉管通道转化法的主要原理是授粉后使外源DNA能沿着花粉管渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞。周光宇(1979)认为可以利用植物授粉后所形成的天然花粉管通道(花粉管引导组织)，经珠心通道将外源DNA携带进入胚囊，转化受体为受精卵或其前后的生殖细胞(精子或卵子)，由于它们仍处于未形成细胞壁的类似“原生质体”状态，并且正进行活跃的DNA复制、分离和重组，所以很容易将外源DNA片段整合到受体基因组中，以达到遗传转化的目的(《远缘杂交的分子基础-DNA片段杂交假说的一个论证》遗传学报，1979，6 (4) :405_413)。但目前玉米花粉管通道法还存在转化效率较低的问题，转化率为O. 36%-5. 2%不等(关淑艳，张健华，柴晓杰，马义勇，曲同宝，孙波，王丕武；《花粉管通道法将淀粉分支酶基因反义表达载体转入玉米自交系的研究》；玉米科学，2005，13 (4) 13-15),(王罡，张艳贞，魏松红，胡应刚，吴颖，季静；《花粉管通道法将Bt毒蛋白基因导入优良玉米自交系》；吉林农业大学学报，2002，24 (4):40-44)。细胞膜是生物大分子进出细胞的天然屏障，蛋白及核酸等生物大分子不能够自由进入细胞。细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides简称CPPs)是一类能够携带超出自身100倍的大分子物质包括蛋白质及核酸进入细胞的短肽，他们进入细胞的机制可能是利用短肽本身的带电特性而不依赖于胞吞作用(Chugh A. ,Eudes F. and Shim Y-S.Ce11-penetrating peptides:nanocarrier for macromolecule delivery in livingcells. IUBMB Life, 2010, 62 (3) : 183 - 193, )0近年来细胞穿膜肽用于动物细胞药物运输的研究成为热点，人们也开始利用穿膜肽在植物细胞中转运生物大分子的研究，发现它具有在动物细胞相似的功能，并且穿膜肽与DNA结合后具有保护DNA完整性防止DNA酶降角军的功倉泛(Chugh A. , Amundsen E. and Eudes F. Translocation of cell-penetratingpeptides and delivery of their cargoes in triticale microspores. Plant Cell Rep.(2009)28:801 - 810)。因此，在农业科研及生产中需要一种将细胞穿膜肽的特征与花粉管通道转化法相结合，转化效率高、操作简便、能将外源基因直接转入玉米的提高花粉管的转化体系及其转化方法。
发明内容
本发明提供一种含有穿膜肽的提高玉米转基因效率的转化体系及方法；所述的转化体系中，含有外源DNA和穿膜肽；所述的外源DNA和穿膜肽的质量比为1:1-3。该转化方法的步骤为选取自交授粉后的玉米的果穗的苞叶和花丝，将所述的转化体系滴在切口凹陷处。本发明的转化效率明显提高。本发明的目的是由以下技术方案实现的—种含有穿膜肽的提高玉米转基因效率的转化体系，所述的转化体系中，含有外源DNA和穿膜肽；所述的外源DNA和穿膜肽的质量比为1:1-3。进一步地，所述的穿膜肽的氨基酸序列为
Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg，如序列表中SEQ ID No 1所示。进一步地，所述的外源DNA为线性DNA、质粒DNA中的一种。进一步地，所述的质粒DNA为PGM-35SBar质粒载体；所述的线性DNA为通过PCR方法从PGM-35SBar质粒扩增去除骨架，核苷酸序列为序列表中如序列表中SEQ ID No :2所
/Jn ο进一步地,所述的质粒载体PGM_35SBar的构建方法包括以下步骤A、将基因35Sbar连接到PGreen0229质粒载体，得到35Sbar_PGreen0229质粒载体；B、将基因Nos连接到所述的35Sbar_PGreen0229质粒载体，得到Nos-35Sbar-PGreen0229 质粒载体；C、将基因UBQI连接到所述的Nos-35Sbar-PGreen0229质粒载体，得到UBQI-Nos-35Sbar-PGreen0229质粒载体，即为所述的质粒载体PGM_35SBar。本发明的目的是由以下另一技术方案实现的一种含有穿膜肽的提高玉米转基因效率的转化体系，所述的转化体系中，含有外源DNA、穿膜肽、Silwet L-77 ;所述的外源DNA和穿膜肽的质量比为1:1-3，所述的SilwetL-77占所述的转化体系的体积比为O. 01%-0. 05%。本发明的目的是由以下又一技术方案实现的一种含有穿膜肽的提高玉米转基因效率的转化方法，所述的转化体系中，含有外源DNA和穿膜肽；所述的外源DNA和穿膜肽的质量比为1:1-3 ;所述的转化方法的步骤为选取自交授粉后的玉米的果穗，剪去苞叶和花丝，将所述的转化体系滴在切口凹陷处。本发明与现有技术相比具有以下有益效果I、因为本发明在线性DNA或质粒DNA溶液中添加的穿膜肽，利用穿膜肽的特性将外源DNA顺利带进受精细胞，并进入细胞核，因此大大提高外源DNA片段整合到受体玉米基因组中的效率。2、因为本发明直接将含有目的基因的线性DNA或质粒DNA溶液转入玉米中，不依赖于玉米的组培再生体系，所以操作简便，无需昂贵仪器，生产成本低廉。
3、因为本发明不受玉米基因型(自交系品种)和转化基因种类的限制，所以适用范围广泛。4、因为本发明采用线性DNA方法直接将外源基因导入玉米基因组，可以去除质粒DNA骨架系列、特别是抗生素基因进入植物基因组，所以培育的转基因植物更加安全，具有更好的应用前景。
图I为实施例2中的质粒载体PGM_35SBar结构示意图。图2为实施例2的高抗除草剂的抗性植株的PCR扩增反应检测结果电泳图。图3为实施例2的Tl代转基因植株喷施除草剂7天后的照片。
具体实施例方式实施例I :一种含有穿膜肽的提高玉米转基因效率的转化体系，所述的转化体系中，含有外源DNA和穿膜肽；所述的外源DNA和穿膜肽的质量比为1:1-3。所述的穿膜肽的氨基酸序列如序列表中SEQ No 1所示。所述的外源DNA为线性DNA、质粒DNA中的一种。所述的线性DNA的核苷酸序列如序列表中SEQ No :2所示；所述的质粒DNA为质粒载体 PGM-35SBar。一种含有穿膜肽的提高玉米转基因效率的转化方法，所述的转化体系中，含有外源DNA和穿膜肽；所述的外源DNA和穿膜肽的质量比为1:1-3 ;所述的转化方法的步骤为选取自交授粉后的玉米的果穗，剪去苞叶和花丝，将所述的转化体系滴在切口凹陷处。本实施例在线性DNA或质粒DNA溶液中添加穿膜肽，利用穿膜肽的特性将外源DNA顺利带进受精细胞，并进入细胞核，因此大大提高外源DNA片段整合到受体玉米基因组中的效率。本实施例是直接将含有目的基因的线性DNA或质粒DNA溶液转入玉米中，不依赖于玉米的组培再生体系，所以操作简便，无需昂贵仪器，生产成本低廉。本实施例不受玉米基因型(自交系品种)和转化基因种类的限制，所以适用范围广泛。本实施例采用线性DNA方法为直接将外源基因导入玉米基因组，可以去除质粒DNA骨架系列、特别是抗生素基因进入植物基因组，所以培育的转基因植物更加安全，具有更好的应用前景。实施例2 本实施例是在实施例I基础上的优选方案，转化体系中的外源DNA为质粒DNA，该质粒DNA为质粒载体PGM-35SBar。一种含有穿膜肽的提高玉米转基因效率的转化体系，所述的转化体系中，含有外源DNA和穿膜肽；所述的外源DNA和穿膜肽的质量比为I: I ;所述的外源DNA为质粒DNA，具体为质粒载体PGM-35SBar ;所述的转化体系中，所述的质粒载体PGM_35SBar的浓度为30μ g / ml，所述的穿膜肽的浓度为30μ g / ml。
所述的转化体系的制备方法包括以下步骤I、质粒载体PGM_35SBar溶液的制备第一步构建质粒载体PGM_35SBar A、将基因35Sbar连接到PGreen0229质粒载体，得到35Sbar_PGreen0229质粒载体；a.将puc57_35Sbar质粒用SacI内切酶进行酶切反应，得到带有SacI酶切位点的基因 35Sbar ；所述的基因35Sbar的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No 3所示；所述的基因35Sbar由生工生物有限公司合成并连接在puc57质粒上，以puc57_35Sbar质粒的形式购买得到； 所述的酶切反应中，酶切体系为IOXbuffer 2μ I ；SacI :2 μ 1，质粒10 μ 1，ddH20 ;6μ I ;于 37°C 反应 3 小时；b.将PGreen0229质粒载体用SacI内切酶进行酶切反应，得到大小约为4451bp的片段B;所述的酶切反应中，酶切体系为IOXbuffer 2μ I ；SacI :2 μ 1，质粒10 μ 1，ddH20 ;6μ I ;于 37°C 反应 3 小时；c.对上述带有SacI酶切位点的基因35Sbar、大小约为4451bp的片段B进行回收处理，再进行连接反应，得到35Sbar-PGreen0229质粒载体；上述连接反应中，连接体系为10Xbuffer :1 μ 1，片段A :7 μ 1，片段B :1 μ 1，T4DNA连接酶1 μ I ;16°C连接过夜；B、将基因Nos连接到所述的35Sbar_PGreen0229质粒载体，得到Nos-35Sbar-PGreen0229 质粒载体；a.将puc57_Nos质粒用Hind III、cspl内切酶进行酶切反应,得到带有Hindll、cspl酶切位点的基因Nos ；所述的带有HindIII、cspI酶切位点基因Nos的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No:4所示；所述的基因Nos由生工生物有限公司合成并连接在puc57质粒上，以puc57-Nos质粒的形式购买得到；所述的酶切反应中，酶切体系为IOXbuffer 2μ I ；Hind III :1 μ 1，cspl :1 μ 1，质粒10 μ 1，ddH20 ；6μ I ;于37。〇反应3小时；b.将所述的35Sbar_PGreen0229质粒载体用Hind III、cspI内切酶进行酶切反应，得到大小约为5804bp的大片段C和70bp左右的小片段D ；所述的酶切反应中，酶切体系为IOXbuffer 2μ I ；Hind III :1 μ 1，cspl :1 μ 1，质粒:10 μ 1，ddH20 ；6μ I ;于37。。反应3小时；c.对所述的大小约为5804bp的大片段C进行回收处理，再与所述的带有Hindll、cspl酶切位点的基因Nos进行连接反应，得到所述的Nos-35Sbar-PGreen0229质粒载体；上述连接反应中，连接体系为10Xbuffer 1 μ I,所述的带有Hindll、cspl酶切位点的基因Nos :7μ 1，大片段C :1μ 1，T4DNA连接酶1μ I ;16°C连接过夜；
C、将基因UBQI连接到所述的Nos-35Sbar_PGreen0229质粒载体，得到UBQI-Nos-35Sbar-PGreen0229质粒载体，即为所述的质粒载体PGM_35SBar ；a.将puc57-UBQI质粒用HindIII内切酶进行酶切反应，得到带有HindIII酶切位点的基因UBQI，即大小约为2000bp的片段E ；所述的酶切反应中，酶切体系为IOXbuffer 2μ I ；Hind III :2 μ 1，质粒:10 μ 1，ddH20 ；6μ I ;于371反应 3 小时；所述的基因UBQI的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No 5所示；所述的基因UBQI由生工生物有限公司合成并连接在puc57质粒上，以UBQI-puc57质粒的形式购买得到；b.将所述的35Sbar_PGreen0229质粒载体用HindIII内切酶进行酶切反应，得到大小约为5695bp的大片段F ;
所述的酶切反应中，酶切体系为IOXbuffer 2μ I ；Hind III :2 μ 1，质粒:10 μ 1，ddH20 ；6μ I ;于37。〇反应 3 小时；c.对大小约为5695bp的大片段F进行回收处理，再与所述的片段E进行连接反应，得到所述的UBQI-Nos-35Sbar-PGreen0229质粒载体，即为所述的质粒载体PGM-35SBar ；上述连接反应中，连接体系为10Xbuffer :1 μ 1，片段E :7 μ 1，大片段F :1 μ 1，T4DNA连接酶1 μ I ;16°C连接过夜；d.将所述的质粒载体PGM_35SBar通过热激法转化至所述的大肠杆菌E. coliDH5a感受态细胞中，再进行振荡培养处理、涂板处理，得到转化平板；再将该转化平板中的单菌落进行菌液PCR反应检测并制备得到含有质粒载体PGM-35SBar的甘油菌，置于-20°C冻存。具体的操作为取100 μ I的E. coli感受态细胞置于冰上自然融化；将6 μ I的质粒载体PGM-35SBar分别加入感受态细胞中，轻轻混匀后，冰浴静置30分钟。于42°C水浴，90s热激，再置于冰上放置I 2分钟；得到转化后的感受态细胞；无菌环境下，向转化后的感受态细胞中，加入800 μ I LB液体培养基，37°C 150rpm振荡培养lh，得到振荡培养物；取200 μ I上述振荡培养物涂布于含有卡那(100mg/L)的LB琼脂平板上；涂布均匀，置于室温直至液体被完全吸收，得到转化平板；从上述转化平板上挑取若干生长状况良好的单菌落进行菌落PCR验证，同时将挑取的单菌落于4ml含有Kan (100mg/L)的LB培养基中进行培养，经验证正确的为阳性克隆菌落培养物，吸取Iml过夜培养物，加入0. 5ml 50%甘油于I. 5ml离心管中，作为含有质粒载体PGM-35SBar的甘油菌，置于_20°C冻存。第二步、菌体活化挑取所述的含有UBQI-Nos-35Sbar-PGreen0229质粒载体的甘油菌，在含有卡那(100mg/L)的LB琼脂平板上划线，于37°C过夜培养；再挑取生长状况良好的单菌落，在7ml含有卡那(100mg/L)的LB液体培养基中(胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L,酵母提取物(Yeast extract) 5g/L,氯化钠(NaCl) 10g/L),于37°C、200-250rpm摇床培养过夜(12 16h)，得到菌液A ;
第三步扩大培养然后将所述的菌液A稀释到经37°C温育过350ml LB (含50mg/L卡那)液体培养基中，200rpm振荡培养约10h，得到菌液B ;第四步质粒DNA的提取和纯化
将所述的菌液B在室温下8000rpm离心IOmin,收集菌体后利用高纯度质粒大提试剂盒(NEW INDUSTRY,北京通宝达公司代理)按照说明书进行质粒DNA的提取和纯化，最后用灭菌后的ddH20溶解，得到溶液A ；第六步、质粒DNA溶液的制备再将所述的溶液A倍比稀释后在O. 8%的琼脂糖胶上电泳，分析其纯度和浓度；最后将溶液中的DNA浓度调整为30 μ g/ml，得到所述的质粒DNA溶液；即质粒载体PGM-35SBar 溶液；II、转化体系的配制所述的穿膜肽Tat2根据报道(Chugh 2010)，氨基酸序列如序列表SEQ ID No : I所示，由上海生物工程公司合成，呈固态粉末状；将固态粉末状的所述的穿膜肽用无菌水小配置成30mg / ml母液，按I :1000的体积比加入所述的质粒载体PGM-35SBar溶液中，所述的穿膜肽的终浓度为30 μ g/ml。所述的转化方法包括以下步骤选择玉米受体材料，在开花期从受体自交系群体中选择发育较好的植株进行套袋授粉自交。选取自交授粉后18 20h的玉米的果穗，先将雌穗上的纸袋摘下，用剪刀剪去距离穗轴顶端I 2厘米的花丝和苞叶，保持花丝切面平齐，加以修剪并使苞叶内的花丝略低于苞叶；然后用移液枪在切口处滴注200-300ul所述的反应体系，之后立即重新套上纸袋，记载导入时间及质粒名称，待其吸收后(约I小时)重复滴注I次，每种处理做3-5个果穗。待玉米果穗成熟时，将其分别晒干脱粒，备用；所述的玉米受体材料为自交系178、京24。本实施例中，所述的转化地点为海南崖城，转化时间为2011年冬季(2011月12至2012年3月)。选择玉米受体材料，在开花期从受体自交系群体中选择发育较好的植株进行套袋授粉自交。选取自交授粉后18 20h的玉米的果穗，先将雌穗上的纸袋摘下，用剪刀剪去距离穗轴顶端I 2厘米的花丝和苞叶，保持花丝切面平齐，加以修剪并使苞叶内的花丝略低于荀叶；然后用移液枪在切口处滴注200-300 μ I所述的反应体系,之后立即重新套上纸袋，记载导入时间及质粒名称，待其吸收后(约I小时)重复滴注I次，每种处理做10-15个果穗。待玉米果穗成熟时，将其分别晒干脱粒，备用。本实施例的检测方法和结果如下一、除草剂筛选检测在北京地区4月下旬到5月上旬将玉米种子播种在普通温室土壤中，适当浇水保持土壤达到一定的湿度，待种子萌发后长到3-4叶期，统计发芽率，此时喷施除草剂草铵膦(商品名百速顿，浙江永农公司生产)400mg/L (百速顿原液稀释500倍)，7天后统计不收除草剂影响的绿苗数，此时存活苗统计为高抗除草剂的抗性苗。二、PCR分子检测参照张森燕等(2008)方法进行，该方法记载于《ZmPtil基因正义和RNAi表达载体的构建及其转化玉米的研究》(张森燕，吴忠义，张秀海，刘占磊，王永勤，黄丛林;华北农学报，2008,23 (5) 1-5)图2中为对高抗除草剂的抗性植株的PCR分子检测结果。泳道I :水，泳道2 :非转基因植株；泳道3 :质粒DNA ;泳道4-泳道13 :除草剂抗性转基因植株。三、转基因植株性状检测图3为Tl代转基因植株喷施除草剂7天后的照片，箭头指示为2株不受除草剂影响的抗性苗，说明该方法转化的转基因株系能够稳定遗传到下一代。本实施例中,转化后得到的玉米籽粒数、出苗数、除草剂高抗苗数、PCR检测呈阳性数、转化率(按检测阳性数与出苗数计算)的统计详见表I。
实施例3 本实施例是在实施例I基础上的优选方案，转化体系中的外源DNA为质粒DNA，该质粒DNA为实施例2中的质粒载体PGM-35SBar。一种含有穿膜肽的提高玉米转基因效率的转化体系，所述的转化体系中，含有外源DNA和穿膜肽；所述的外源DNA和穿膜肽的质量比为1:2 ;所述的外源DNA为质粒DNA，具体为质粒载体PGM-35SBar ;所述的转化体系中，所述的质粒载体PGM_35SBar的浓度为30 μ g / ml,所述的穿膜肽的浓度为60 μ g / ml。所述的转化体系的制备方法、转化方法参见实施例2 ;本实施例的玉米受体材料为自交系178、京24。本实施例中，所述的检测方法参见实施例2 ;转化后得到的玉米籽粒数、出苗数、除草剂高抗苗数、PCR检测呈阳性数、转化率(按检测阳性数与出苗数计算)的统计详见表I。实施例4:本实施例是在实施例I基础上的优选方案，转化体系中的外源DNA为质粒DNA，该质粒DNA为实施例2中的质粒载体PGM-35SBar。一种含有穿膜肽的提高玉米转基因效率的转化体系，所述的转化体系中，含有外源DNA和穿膜肽；所述的外源DNA和穿膜肽的质量比为1:3 ;所述的外源DNA为质粒DNA，具体为质粒载体PGM-35SBar ;所述的转化体系中，所述的质粒载体PGM_35SBar的浓度为30 yg / ml，所述的穿膜肽的浓度为90yg / ml。所述的转化体系的制备方法、转化方法参见实施例2 ;本实施例的玉米受体材料为自交系178、京24。本实施例中，所述的检测方法参见实施例2 ;转化后得到的玉米籽粒数、出苗数、除草剂高抗苗数、PCR检测呈阳性数、转化率(按检测阳性数与出苗数计算)的统计详见表I。实施例5:本实施例是在实施例I基础上的优选方案，转化体系中的外源DNA为线性DNA。一种含有穿膜肽的提高玉米转基因效率的转化体系，所述的转化体系中，含有外源DNA和穿膜肽；所述的外源DNA和穿膜肽的质量比为1:1 ;所述的外源DNA为线性DNA，具体为DNA片段A;所述的转化体系中，所述的DNA片段A的浓度为30 μ g / ml，所述的穿膜肽的浓度为30yg / ml。所述的转化体系的制备方法包括以下步骤I、DNA片段A溶液的制备通过以实施例2中的质粒载体PGM_35Sbar为模板进行PCR扩增反应，获得所述的DNA片段A ;该DNA片段A删除了质粒骨架上的抗生素基因；该DNA片段A的核苷酸序列如序列表SEQ ID No 2所不；所述的PCR扩增反应的引物为上游引物(LacZ-Fl): GTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGT,下游引物(RB-R):GTTTACCCGCCAATATATCCTGTCA ；所述的PCR扩增反应的体系(50 μ I)为模板1μ 1，10XPCR Buffer :2. 5 μ 1，上下游引物:各 1μ l，dNTP (2. 5mM)ly I,Taq 酶(5υ/μ I) 1μ I, ddH20 :补至 50 μ I ；所述的PCR扩增反应的程序为 第一步热变性98°C，10分钟；第二步热变性98°C，10秒；第三步退火56°C，15秒；第四步延伸72°C，7分钟；第五步延伸72°C，10分钟。第二步到第四步之间设置30个循环，PCR反应结束之后进行电泳检测，再进行回收处理，得到目的片段；所述的回收处理采用回收试剂盒(QIAGEN)，操作方法按照试剂盒提供的说明书进行；再将所述的目的片段倍比稀释后在O. 8%的琼脂糖胶上电泳，分析其纯度和浓度；最后将溶液中的DNA浓度调整为30 μ g/ml，得到所述的DNA溶液，即DNA片段A溶液；II、转化体系的配制所述的穿膜肽Tat2根据报道(Chugh 2010)，氨基酸序列如序列表SEQ ID No : I所示，由上海生物工程公司合成，呈固态粉末状；将固态粉末状的所述的穿膜肽用无菌水小配置成30mg / ml母液，按I :1000的体积比加入所述的DNA片段A溶液中，所述的穿膜肽的终浓度为30 μ g/ml。本实施例的转化体系的转化方法参见实施例I ;本实施例的玉米受体材料为自交系 178、京 24。本实施例中，所述的检测方法参见实施例2 ;转化后得到的玉米籽粒数、出苗数、除草剂高抗苗数、PCR检测呈阳性数、转化率(按检测阳性数与出苗数计算)的统计详见表I。实施例6:本实施例是在实施例I基础上的优选方案，转化体系中的外源DNA为DNA为线性DNA,该DNA为线性DNA为实施例5中的DNA片段A。一种含有穿膜肽的提高玉米转基因效率的转化体系，所述的转化体系中，含有外源DNA和穿膜肽；所述的外源DNA和穿膜肽的质量比为1:2 ;所述的外源DNA为质粒DNA，具体为DNA片段A;所述的转化体系中，所述的DNA片段A的浓度为30 μ g / ml，所述的穿膜肽的浓度为60 μ g / ml ο所述的转化体系的制备方法参见实施例5，转化方法参见实施例2 ;本实施例的玉米受体材料为自交系178、京24。本实施例中，所述的检测方法参见实施例2 ;转化后得到的玉米籽粒数、出苗数、除草剂高抗苗数、PCR检测呈阳性数、转化率(按检测阳性数与出苗数计算)的统计详见表I。实施例7:本实施例是在实施例I基础上的优选方案，转化体系中的外源DNA为DNA为线性DNA,该DNA为线性DNA为实施例5中的DNA片段A。一种含有穿膜肽的提高玉米转基因效率的转化体系，所述的转化体系中，含有外源DNA和穿膜肽；所述的外源DNA和穿膜肽的质量比为1:3 ;所述的外源DNA为质粒DNA，具体为DNA片段A;所述的转化体系中，所述的DNA片段A的浓度为30 μ g / ml，所述的穿膜肽的浓度为90yg / ml。所述的转化体系的制备方法参见实施例5，转化方法参见实施例2 ;本实施例的玉米受体材料为自交系178、京24。本实施例中，所述的检测方法参见实施例2 ;转化后得到的玉米籽粒数、出苗数、除草剂高抗苗数、PCR检测呈阳性数、转化率(按检测阳性数与出苗数计算)的统计详见表I。
fl交系线性DNA是否加人I ZE米籽I出苗除草剂PCR检转化率(按 品种或质粒DNA穿膜肽粒数数 高抗苗测呈阳检测阳性数
Tat2性数与出苗数il- _________m_
实施例 178 质粒 DNA 否__9530 8880 I__I__0.01%
2178 质粒 DNA 是__3680 3320 6__6__0.18%
京 24 质粒 DNA 否__12673 10235 I__I__0.01%
__京 24质粒 DNA是__236021893__3__0.14%
实施例 178质粒 DNA否__107859697I__I__0.01%
3178质粒 DNA是33863211660.19%
京 24质粒 DNA否__12230 11089 I__I__0.01%
_ 京 24质粒 DNA—是 2564223933__0.13%
实施例 178质粒 DNA 否__1193810497I__I__0.01%
4178质粒 DNA 是__378435465__5__0.14%
京 24质粒 DNA 否__1136810024I__I__0.01%
__京 24质粒 DNA 是__293626354__4__0.15%
实施例 178线性 DNA 否__762067212__2__0.03%
5178线性 DNA 是__279123242424 1.03%
京 24线性 DNA 否__38353620I__I__0.03%
__京 24线性 DNA 是__14431287 11__11 0.85%
实施例 178线性 DNA 否__95488760 4__4__0.05%
6178线性 DNA 是__2945267528 28 1.05%
京 24线性 DNA 否__68356620 3__3__0.05%
__京 24线性 DNA 是__2548230719 19 0.82%
实施例 178线性 DNA 否__9296 8767 5__5__0.06%
7178线性 DNA是 2563239526 26 1.09%
京 24线性 DNA 否__49884762 2__2__0.04%
__京 24 线性 DNA 是__2457 2328 2121 0.90%表I :实施例1-7中的转化体系转化玉米后转基因植株的各个参数统计表。实施例8:本实施例是在实施例I基础上的优选方案，转化体系中的外源DNA为质粒DNA，该质粒DNA为实施例2中的质粒载体PGM-35SBar ;该转化体系中还含有Silwet L-77。一种含有穿膜肽的提高玉米转基因效率的转化体系，所述的转化体系中，含有外源DNA、穿膜肽、Silwet L-77 ;所述的外源DNA和穿膜肽的质量比为1:1_3 ;所述的外源DNA为质粒DNA，具体为质粒载体PGM-35SBar ;所述的转化体系中，所述的质粒载体PGM_35SBar的浓度为30μ g / ml，所述的穿膜肽的浓度为30-90 μ g / ml，所述的Silwet L-77占所述的转化体系的体积比为O. 01%-0. 05%。所述的转化体系的制备方法包括以下步骤I、质粒载体PGM_35SBar溶液的制备参见实施例2 ；II、转化体系的配制在所述的质粒载体PGM_35SBar溶液加入所述的穿膜肽，所述的穿膜肽的浓度为30-90 μ g/ml ;再加入所述的Silwet L-77，所述的Silwet L-77在所述的转化体系中的浓度为O. 01%-0. 05%。本实施例的转化体系的转化方法参见实施例2，所述的玉米受体材料为自交系178、京24。本实施例中，所述的检测方法参见实施例2。实施例9: 本实施例是在实施例I基础上的优选方案，转化体系中的外源DNA为线性DNA，该线性DNA为实施例5中的DNA片段A ;该转化体系中还含有Silwet L-77。一种含有穿膜肽的提高玉米转基因效率的转化体系，所述的转化体系中，含有外源DNA、穿膜肽、Silwet L-77 ;所述的外源DNA和穿膜肽的质量比为1:1_3 ;所述的外源DNA为质粒DNA，具体为DNA片段A ;所述的转化体系中，所述的DNA片段A的浓度为30 μ g /ml,所述的穿膜肽的浓度为30-90 μ g / ml,所述的Silwet L-77占所述的转化体系的体积比为 O. 01%-0. 05%。所述的转化体系的制备方法包括以下步骤I、DNA片段A溶液的制备参见实施例5 ；II、转化体系的配制在所述的DNA片段A溶液加入所述的穿膜肽，所述的穿膜肽的浓度为30-90 μ g/ml ;再加入所述的Silwet L-77,所述的SilwetL_77在所述的转化体系中的浓度为O. 01%-0. 05%。本实施例的转化体系的转化方法参见实施例2，所述的玉米受体材料为自交系178、京24。本实施例中，所述的检测方法参见实施例2。实施例I至实施例9中，PCR引物由北京三博远志生物技术有限公司合成；DNA测序工作由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。实施例I至实施例9中，所述的PCR反应使用PTC-100 Peltier ThermalCycler基因扩增仪,购自MJ Research Inc公司；所述的琼脂糖凝胶电泳使用UVP GelDocumentation凝胶分析系统,购自基因公司；所述的琼脂糖凝胶电泳使用DYCP-31DN电泳仪，购自北京六一仪器公司。实施例I至实施例9中，所采用的PCR、酶切、连接、转化等基因工程基本操作方法记载于《分子克隆实验指南第三版》中((美〕J.萨姆布鲁克等著，科学出版社，2002年出版)，和《植物基因工程原理与技术》中(王关林，方宏筠著，科学出版社，1998)。显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所做的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
权利要求
1.一种含有穿膜肽的提高玉米转基因效率的转化体系，其特征在于所述的转化体系中，含有外源DNA和穿膜肽；所述的外源DNA和穿膜肽的质量比为1:1-3。
2.根据权利要求I所述的含有穿膜肽的提高玉米转基因效率的转化体系，其特征在于所述的穿膜肽的氨基酸序如序列表中SEQ ID No 1所示。
3.根据权利要求I或2所述的含有穿膜肽的提高玉米转基因效率的转化体系，其特征在于所述的外源DNA为线性DNA、质粒DNA中的一种。
4.根据权利要求3所述的含有穿膜肽的提高玉米转基因效率的转化体系，其特征在于所述的线性DNA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No :2所示，所述的质粒DNA为质粒载体 PGM-35SBar。
5.根据权利要求4所述的含有穿膜肽的提高玉米转基因效率的转化体系，其特征在于所述的质粒载体PGM-35SBar的构建方法包括以下步骤 A、将基因35Sbar连接到PGreen0229质粒载体，得到35Sbar_PGreen0229质粒载体； B、将基因Nos连接到所述的35Sbar-PGreen0229质粒载体，得到Nos-35Sbar-PGreen0229 质粒载体； C、将基因UBQI连接到所述的Nos-35Sbar-PGreen0229质粒载体，得到UBQI-Nos-35Sbar-PGreen0229质粒载体，即为所述的质粒载体PGM_35SBar。
6.根据权利要求1、2、4、5中任一项所述的含有穿膜肽的提高玉米转基因效率的转化体系，其特征在于所述的转化体系中含有的原料的质量比为 外源DNA I，穿膜肽I。
7.根据权利要求1、2、4、5中任一项所述的含有穿膜肽的提高玉米转基因效率的转化体系，其特征在于所述的转化体系中含有的原料的质量比为 外源DNA I，穿膜肽2。
8.根据权利要求1、2、4、5中任一项所述的含有穿膜肽的提高玉米转基因效率的转化体系，其特征在于所述的转化体系中含有的原料的质量比为 外源DNA I，穿膜肽3。
9.一种含有穿膜肽的提高玉米转基因效率的转化方法，其特征在于所述的转化体系中，含有外源DNA和穿膜肽；所述的外源DNA和穿膜肽的质量比为1:1-3 ;所述的转化方法的步骤为选取自交授粉后的玉米的果穗，剪去苞叶和花丝，将所述的转化体系滴在切口凹陷处。
10.一种含有穿膜肽的提高玉米转基因效率的转化体系，其特征在于所述的转化体系中，含有外源DNA、穿膜肽、Silwet L-77 ;所述的外源DNA和穿膜肽的质量比为1:1_3，所述的Silwet L-77占所述的转化体系的体积比为O. 01%-0. 05%。
全文摘要
本发明提供一种含有穿膜肽的提高玉米转基因效率的转化体系及方法；所述的转化体系中，含有外源DNA和穿膜肽；所述的外源DNA和穿膜肽的质量比为1:1-3。该转化方法的步骤为选取自交授粉后的玉米的果穗的苞叶和花丝，将所述的转化体系滴在切口凹陷处。本发明在线性DNA或质粒DNA溶液中添加的穿膜肽，利用穿膜肽的特性将提高外源DNA片段整合到受体玉米基因组中的效率；本发明操作简便，无需昂贵仪器，生产成本低廉。本发明不受玉米基因型(自交系品种)和转化基因种类的限制，所以适用范围广泛；本发明采用线性DNA方法直接将外源基因导入玉米基因组，可去除质粒DNA骨架系列、特别是抗生素基因进入植物基因组，培育的转基因植物更安全，具有更好的应用前景。
文档编号C12N15/82GK102839196SQ20121036695
公开日2012年12月26日 申请日期2012年9月28日 优先权日2012年9月28日
发明者吴忠义, 黄丛林, 张秀海, 罗昌, 程曦, 梁宏霞, 李春华, 翟亦倩 申请人:北京农业生物技术研究中心