专利名称：特异促进肝细胞cyp3a4基因高表达的慢病毒表达载体及其构建方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体及其构建方法与应用。
背景技术：
细胞色素P450酶(Cytochrome P450，CYP450)是一类重要的混合功能氧化酶系统，主要分布在生物体的内质网上和线粒体中，参与许多内源性和外源性物质的生物转化过程。CYP3A4属于CYP450家族中的CYP3A亚族，由CYP3A4基因编码，主要存在于肝脏中，约占肝脏CYP酶总量的30-40%，是肝脏中含量最丰富的CYP，也是最重要的人类药物代谢酶。CYP3A4参与代谢大约38类多于150种的临床治疗药物，包括抗生素、抗真菌药物、安定 药物、抗组胺剂、抗抑郁药物、激素以及钙拮抗剂等等，此外，CYP3A4还参与一些前体致癌物的激活过程。因为其广泛的代谢底物谱，许多药物不良反应是由药物相互作用导致CYP3A4的代谢活性改变所引起的。现有技术中，阮昊和徐田雪分别将CYP3A4基因cDNA片段连接到了 pFastBac载体上，并将其包装成杆状病毒后感染sf9细胞，得到了能表达CYP3A4基因的sf9细胞，该细胞能够用于体外研究药物代谢，但因不是人源细胞不适用于外源物质对人毒理的相关研究；李敏将CYP3A4基因cDNA片段连接到了 pYES2/CT_PCR载体上并将其导入到酿酒酵母BJ5628中实现CYP3A4的稳定表达，但因非人源细胞也不适用于外源物质对人毒理的相关研究。现有技术中尚无可在人源细胞中持续、稳定且高效表达CYP3A4基因的载体。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，发明人在载体的选择、重组构建方法等方面进行了大量的探索研究，预料不到地发现，将包含Xho I酶切位点和Xma I酶切位点的CYP3A4基因cDNA序列插入pLVX-AcGFPl-Cl表达载体的多克隆位点中可成功构建特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体，从而完成本发明。本发明提供一种特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体，包括pLVX-AcGFP-Cl表达载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和CYP3A4基因cDNA序列；所述多克隆位点包括Xho I酶切位点和Xma I酶切位点，所述CYP3A4基因cDNA序列包括Xho I酶切位点、CYP3A4基因编码序列和Xma I酶切位点，所述CYP3A4基因cDNA序列正向插入所述多克隆位点序列中。采用上述技术方案，本发明提供的CYP3A4基因cDNA序列插入pLVX-AcGFPl_Cl表达载体构建得到的慢病毒表达载体具有转染效率高，用量少，可持续、高效、稳定地提高CYP3A4基因表达的优点，可作为有力工具应用于制备治疗CYP3A4基因表达异常相关疾病药物的研究和开发中。作为本发明的进一步改进，所述CYP3A4基因编码序列通过PCR扩增获得，PCR引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列为5’ -CCGCTCGAGACATGGCTCTCATCCCAGACTT-3’，即 SEQ ID NO :1，所述下游引物的序列为5’ -ACCCGGGTCAGGCTCCACTTACGGTGCCATCC-3’JPSEQ ID NO 20采用上述PCR引物序列，通过PCR可以扩增出CYP3A4基因编码序列，并可成功插入至pLVX-AcGFPl-Cl表达载体中持续表达CYP3A4基因，减少了序列合成费用，成本较低。相应的，本发明还提供特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体的构建方法，包括如下步骤
A)CYP3A4基因引物设计根据CYP3A4基因编码序列，使用Oligo 7分析后选取5’ -CCGCTCGAGACATGGCTCTCATCCCAGACTT-3’，即 SEQ ID NO : I 作为上游引物，选取 5’_ACCCGGGTCAGGCTCCACTTACGGTGCCATCC -3’，即SEQ ID NO :2作为下游引物，然后合成所述上游引物和所述下游引物；所述上游引物和所述下游引物无引物二聚体，且退火温度差距较小；
B)CYP3A4基因cDNA序列的获得用所述上游引物和所述下游引物进行PCR扩增，获 得大量CYP3A4基因编码序列，然后将该序列进行加A尾反应后，用T4 DNA连接酶连接到pGM-T载体上得到连接产物，将该连接产物转化到感受态大肠杆菌DH5 α中，均匀涂布到含氨苄青霉素LB培养基平板上，挑取阳性单克隆菌落培养保存菌液并进行PCR初步鉴定，将初步鉴定结果说明CYP3A4基因cDNA序列插入成功的菌液进行测序鉴定；用液体LB培养基培养测序鉴定正确的大肠杆菌，并抽提其中带CYP3A4基因cDNA序列的pGM_T载体，用限制性内切酶Xho I酶切回收后再用Xma I酶切，电泳、切胶回收1526 bp大小的片段，此片段即为CYP3A4基因cDNA序列；
C)特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒载体的构建和鉴定提取质粒pLVX-AcGFPl-Cl，用限制性内切酶Xho I酶切回收后再用Xma I酶切，电泳、切胶回收载体，再用T4 DNA Iigase将所述CYP3A4基因cDNA序列连接到pLVX-AcGFPl-Cl表达载体中，得到连接产物，将该连接产物转化到感受态大肠杆菌DH5 α中，均匀涂布到含氨苄青霉素LB培养基平板上，挑取阳性单克隆菌落培养保存菌液并进行PCR初步鉴定，将初步鉴定结果说明CYP3A4基因cDNA序列插入成功的菌液进行测序鉴定；
D)特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒载体的抽提将测序结果证实CYP3A4基因cDNA序列插入成功的菌液扩增培养，对重组质粒进行抽提，得到特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体。本发明利用基因工程技术构建特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体，经鉴定构建成功后，包装成病毒转导入L-02肝细胞，嘌呤霉素筛选细胞后，使用实时荧光定量PCR和Western Blot技术分别从mRNA和蛋白水平验证CYP3A4基因表达的变化，实验结果证明本发明提供的CYP3A4基因cDNA序列成功插入至pLVX-AcGFPl-Cl表达载体中，能特异、持续、高效、稳定地促进CYP3A4基因高表达。本发明还提供特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体在制备治疗CYP3A4基因表达异常相关疾病的药物中的用途。与现有技术相比，本发明的有益效果如下本发明提供的特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体具有转染效率高，用量少，能特异、持续、高效、稳定地促进CYP3A4基因高表达的优点，可作为有力工具应用于与CYP3A4相关的药物研究和开发中；本发明还提供了特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体的构建方法，操作效果好，减少了序列合成费用，成本较低。
图I为pLVX-AcGFPl-Cl表达载体的质粒图谱。图2为3A4-T载体菌液PCR的结果示意图。图3为pLVX-CYP3A4载体菌液PCR的结果示意图。图4为pLVX-CYP3A4载体测序结果示意图。图5为嘌呤霉素筛选细胞后荧光定量PCR检测结果示意图。图6为嘌呤霉素筛选细胞后Western blot检测结果示意图。
图7为嘌呤霉素筛选细胞连续培养20代后Western blot检测结果示意图。
具体实施例方式下面结合附图与具体实施例对本发明做进一步的说明。L-02肝细胞购自上海生命科学院细胞资源中心，293FT细胞购自Invitrogen公司，Premix PrimeSTAR HS酶、慢病毒表达载体pLVX-AcGFPl-Cl、病毒包装辅助试剂盒、Lenti-X GoStix 试剂盒均购自 Takara 公司，RNeasy Mini Kit 购自 Qiagen 公司，pGM_T载体购自天根公司，Endo-Free Plasmid Mini Kit II 购自 Omega bio-tek 公司。实施例一 CYP3A4基因引物的设计。根据CYP3A4基因编码序列(GenBank ΝΜ_001202855. 2)，使用01igo7对其进行分析，寻找上游引物和下游引物(要求尽可能无引物二聚体且退火温度差距较小)，然后在上游引物和下游引物的5’端分别加入保护碱基与酶切位点Xho I和Xma I，设计得到的引物序列如表I所示。设计的PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
权利要求
1.ー种特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体，其特征在于包括pLVX-AcGFP-CI表达载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和CYP3A4基因cDNA序列；所述多克隆位点包括Xho I酶切位点和Xma I酶切位点，所述CYP3A4基因cDNA序列包括Xho I酶切位点、CYP3A4基因编码序列和Xma I酶切位点，所述CYP3A4基因cDNA序列正向插入所述多克隆位点序列中。
2.根据权利要求I所述的特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体，其特征在于所述CYP3A4基因编码序列通过PCR扩增获得，PCR引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列为5’ -CCGCTCGAGACATGGCTCTCATCCCAGACTT-3’，即 SEQ ID NO 1,所述下游引物的序列为5’ -ACCCGGGTCAGGCTCCACTTACGGTGCCATCC-3’，即 SEQ ID NO :2。
3.根据权利要求2所述的特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤 A)CYP3A4基因引物设计根据CYP3A4基因编码序列，使用Oligo7分析后选取5’-CCGCTCGAGACATGGCTCTCATCCCAGACTT -3’，即 SEQ ID NO :1 作为上游引物，选取 5’_ACCCGGGTCAGGCTCCACTTACGGTGCCATCC -3’，即SEQ ID NO :2作为下游引物，然后合成所述上游引物和所述下游引物； B)CYP3A4基因cDNA序列的获得用所述上游引物和所述下游引物进行PCR扩增，获得大量CYP3A4基因编码序列，然后将该序列进行加A尾反应后，用T4 DNA连接酶连接到pGM-T载体上得到连接产物，将该连接产物转化到感受态大肠杆菌DH5 α中，均匀涂布到含氨苄青霉素LB培养基平板上，挑取阳性单克隆菌落培养保存菌液并进行PCR初步鉴定，将初步鉴定结果说明CYP3A4基因cDNA序列插入成功的菌液进行测序鉴定；用液体LB培养基培养测序鉴定正确的大肠杆菌，并抽提其中带CYP3A4基因cDNA序列的pGM_T载体，用限制性内切酶Xho I酶切回收后再用Xma I酶切，电泳、切胶回收1526 bp大小的片段，此片段即为CYP3A4基因cDNA序列； C)特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒载体的构建和鉴定提取质粒pLVX-AcGFPl-Cl，用限制性内切酶Xho I酶切回收后再用Xma I酶切，电泳、切胶回收载体，再用T4 DNA Iigase将所述CYP3A4基因cDNA序列连接到pLVX_AcGFPl_Cl表达载体中，得到连接产物，将该连接产物转化到感受态大肠杆菌DH5 α中，均匀涂布到含氨苄青霉素LB培养基平板上，挑取阳性单克隆菌落培养保存菌液并进行PCR初歩鉴定，将初步鉴定结果说明CYP3A4基因cDNA序列插入成功的菌液进行测序鉴定； D)特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒载体的抽提将测序结果证实CYP3A4基因cDNA序列插入成功的菌液扩增培养，对重组质粒进行抽提，得到特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体。
4.根据权利要求I至3中任ー项所述的特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体在制备治疗CYP3A4基因表达异常相关疾病的药物中的用途。
全文摘要
本发明提供一种特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体，包括pLVX-AcGFP-C1表达载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和CYP3A4基因cDNA序列；所述多克隆位点包括XhoI酶切位点和XmaI酶切位点，所述CYP3A4基因cDNA序列包括XhoI酶切位点、CYP3A4基因编码序列和XmaI酶切位点，所述CYP3A4基因cDNA序列正向插入所述多克隆位点序列中。本发明提供的慢病毒表达载体具有转染效率高、用量少、可特异、持续、高效、稳定地表达CYP3A4基因的优点，可作为有力工具应用于与CYP3A4相关的药物研究与开发。
文档编号C12N15/867GK102864171SQ20121036679
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月28日 优先权日2012年9月28日
发明者徐新云, 毛侃琅, 何晓阳, 毛吉炎, 应明 申请人:深圳市疾病预防控制中心