专利名称：阳离子型咪唑Gemini表面活性剂[Cn-s-Cnim]Br<sub>2</sub>在基因转染中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及阳离子型咪唑Gemini表面活性剂[Cn-s_Cnim]Br2在基因转染中的应用，属于生物医药技术领域。
背景技术：
分子生物学的发展使疾病在分子水平上的基因治疗成为可能。基因疗法的整个过程为目的基因在载体的携带下进入细胞内部并实现基因修正和基因置换等，以纠正或补偿基因缺陷和异常引起的疾病，或者通过干扰特定基因的表达实现治疗的目的等(参见 Qasba, P. K.等人，DNA and Gene Therapy: Transfer of Mouse DNA to Humanand Mouse Embryonic Cells byPolyoma Pseudovirions, Proc. Natl. Acad. Sci. USA1971，68，2345-2349 ;以及Xia, Η. B.等人，siRNA-mediated gene silencing in vitro an·din vivo, Nat. Biotechnol. 2002，20，1006-1010)，基因疗法的关键问题之一便是如何将目的基因导入细胞内部，若单独采用裸基因进行转染，基因片段难于被细胞摄取，而且即便裸基因能够进入细胞内，也会被胞内的核酸酶所降解。因此，寻找理想的基因载体是基因疗法所面临的一大难题。目前应用的基因载体可分为两大类病毒载体和非病毒载体。病毒载体，主要包括反转录病毒、腺病毒和腺相关病毒等，它们转染效率较高，但由于受到免疫原性、承载DNA能力、细胞靶向性和成本等因素的影响，限制了其应用，参见Luo，D.等人，Synthetic DNAdelivery systems, Nat. Biotechnol. 2000，18，33-37。非病毒载体，主要是阳离子载体通过其带正电荷的基团与DNA带负电荷的磷酸根发生静电作用，从而减弱DNA链上磷酸根负电荷之间的排斥作用，导致DNA弯曲、凝聚，甚至将DNA包载成一定大小的复合物进行传输，有关一些合成类物质用于基因转染的研究已引起人们的广泛关注。其中，非病毒载体研究较多的几类为脂类(参见Feigner, P. L.等，Lipofection:Ahighly efficient, Iipid—mediated DNA-transfectionprocedure, Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 1987，84，7413-7417)、聚电解质(polyethylenimine 聚乙烯亚胺，参见Boussif, 0.等人，A versatile vector for gene and oligo-nucleotide transferinto celIsin culture and in vivo:Polyethyenimine,Proc. Natl.Acad. Sci.USA, 1995, 92:7297-7301; dendrimers 树枝状聚合物，参见 Nylander, Τ·等人，DNAcondensation using cationicdendrimers-morphology and supramolecular structureof formed aggregates, Soft Matter 2011,7,4577-4594)、高价阳离子物质(参见Leroux,J. C. Gene delivery with bisphosphonate-stabilized calcium phosphatenanoparticles, J. Control. Release 2011, 150, 87-93)等。尽管有关非病毒基因载体与DNA相互作用的研究受到了重视，但目前常用的阳离子型聚合物作为基因载体的一个很大局限性在于聚合物分子的大小和价态的非均一性，这种非均一性直接导致所制备的载体/DNA结构不同，给生物体内的释放研究带来巨大困难。因此，随着基因疗法的不断发展，需要发展新型的非病毒基因载体，提闻载体/DNA结构的均一性，提闻基因转染的效率，最终提闻基因治疗的效果。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种阳离子型咪唑Gemini表面活性剂[Cn-s-Cnim]Br2在基因转染中的应用。本发明的另一目的在于提出一种[Cn-s_Cnim]Br2作为非病毒基因载体负载DNA的技术方案，即[C12-4-C12im]Br2/DNA纳米复合物、制备方法及其在基因转染中的应用。为了有助于理解本发明，下面定义了一些术语。本文定义的术语具有本发明相关领域的普通技术人员通常所理解的含义。除非另外说明，本文中的[Cn-s-Cnim]Br2(n=10, 12，14 ；s=2, 4, 6)是指阳离子型咪唑Gemini表面活性剂，是由双头部和双尾部构成，中间由桥连基团(短链饱和脂肪链)连接， 所述头部由咪唑杂环构成，所述尾部由疏水饱和脂肪链构成。除非另外说明，本文中的DNA是指质粒DNA。除非另外说明，本文中的复合物是指由两种或两种以上的不同的物质所形成的结合体。纳米复合物是指结合体的大小尺寸在纳米级别。例如[C12-4-C12im]Br2/DNA纳米复合物是指由DNA通过相互结合而形成的结合体，复合物的尺寸大小在纳米级别。除非另外说明，本文中的Z+/-是指表面活性剂中咪唑基团所带正电荷与DNA分子中磷酸基团所带负电荷的摩尔比。尽管经由理论计算得出每个咪唑基团所带正电荷为O. 74(参见Xu, G. Y.等人，Comparison of Aggregation Behaviors between Ionic Liquid-TypeImidazolium GeminiSurfactant[C12-4-C12im]Br2 and Its Monomer[C12mim]Br onSilicon Wafer, Langmuir, 2009, 25, 9721-9727),为简化计算，本文中每个Gemini 表面活性剂所带正电荷以整数2进行计算。为了实现以上发明目的，本发明提供以下技术方案—种阳离子型咪唑Gemini表面活性剂[Cn-s_Cnim]Br2在基因转染中的应用,所述阳离子型咪唑Gemini表面活性剂，通式为[Cn-S_Cnim]Br2，n=10, 12，14 ；s=2,4,6,作为非病毒基因载体在基因转染中的应用时，先将[Cn-s-Cnim]Br2溶解于pH6. 8-7. 5的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液中，取100 μ L加入到培养的细胞中，孵育24小时，利用酶标仪测试细胞样品的吸光度值来测试细胞的存活率，通过细胞存活率判定[(^-『(^!!!扣^细胞毒性；所述的细胞包括人胚肾细胞(ΗΕΚ293细胞)、人宫颈癌细胞(HeLa细胞)、人非小细胞肺癌细胞(Α549Υ-10细胞)或人口腔表皮样癌细胞(KB细胞)。细胞存活率(％)=A570 (样品)/A57tl (对照)X 100% (I)其中A57tl (样品)为加入[Cn-s-Cnim]Br2后的细胞的吸光度，A570 (对照)为空白对照的细胞的吸光度。根据本发明优选地，非病毒基因载体选自[C1Q-4-C1Qim]Br2、[C12-4_C12im]Br2、[C14-4-C14im]Br2、[C12-2_C12im]Br2 和[C12-6_C12im]Br2。进一步优选地，非病毒基因载体选自[C12-2-C12im]Br2、[C12-4-C12im]Br2 和[C12-6_C12im]Br2。其中，非病毒基因载体以[C12-4_C12im]Br2为例说明，其有效诱导DNA凝聚，高效转染基因。[C12-4-C12im]Br2可根据相关文献制备,例如可参见Xu, G. Y.等人，SynthesisandProperties of Ionic Liquid-Type Gemini Imidazolim Surfactants, J. ColloidInterface Sci. 2008，326490-495;Aggregation and Thermodynamic Propertiesof Ionic Liquid-Type Gemini ImidazoliumSurfactants with Different SpacerLength, Colloid Polym Sci. 2009，287，395-402 文献提供的方法制备。[C12-4_C12im]Br2 结
构式如下
权利要求
1.一种阳离子型咪唑Gemini表面活性剂[Cn-s-Cnim]Br2在基因转染中的应用,所述阳离子型咪唑Gemini表面活性剂，通式为[Cn-S_Cnim]Br2，n=10，12，14 ；s=2,4,6,作为非病毒基因载体直接应用于基因转染时，先将[Cn-s-Cnim]Br2溶解于pH 6. 8-7. 5的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液中，取100 μ L加入到培养的细胞中，孵育24小时，利用酶标仪测试细胞样品的吸光度值来测试细胞的存活率，通过细胞存活率判定[Cn-s-Cnim]Br2细胞毒性；所述的细胞包括人胚肾细胞(HEK293细胞)、人宫颈癌细胞(HeLa细胞)、人非小细胞肺癌细胞(A549Y-10细胞)或人口腔表皮样癌细胞(KB细胞)。
2.根据权利要求I所述的应用，其特征在于所述阳离子型咪唑Gemini表面活性剂选自[C12-2-C 12im]Br2、[C12-4_C12im]Br2 和[C12-6-C12im]Br2 ;其中，优选[C12-4_C12im]Br2。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于阳离子型咪唑Gemini表面活性剂[C12-4-C12im]Br2有效诱导DNA凝聚形成[C12-4_C12im]Br2/DNA纳米复合物,包括步骤如下 分别用缓冲液配制[C12-4-C12im]Br2溶液和DNA溶液，[C12-4-C12im]Br2与DNA按照冗+/_为(1 50) : (I(Tl)的摩尔比制备混合溶液，使DNA溶液的终浓度为I X 10_6mOl/L I X 10_4mOl/L，再将该混合溶液室温下孵育15 40分钟，得到[C12-4_C12im]Br2/DNA纳米复合物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述[C12-4-C12im]Br2与DNA按照Z+/_为(Γ2): (I(Tl)的摩尔比；优选地，所述[(12-4-(12址]81'2与0嫩按照Z+/-为(I 2): (2 I)的摩尔比。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于制备DNA溶液和[C12-4-C12im]Br2溶液的混合溶液时，将两种溶液混匀并漩涡震荡15 40秒；优选地，漩涡震荡30秒；混合溶液中DNA溶液的终浓度保持在I X 10_5mOl/L。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于用[C12-4-C12im]Br2/DNA纳米复合物进行基因转染的方法为取制备的[(12-4-(121111]81'2/1)嫩纳米复合物200^加入到培养的细胞中，所述的细胞选自人胚肾细胞HEK293细胞或人宫颈癌细胞HeLa细胞；经过24小时的孵育，用荧光倒置显微镜测定质粒DNA上的绿色荧光蛋白(GFP)基因的表达。
全文摘要
本发明涉及一种阳离子型咪唑Gemini表面活性剂[Cn-s-Cnim]Br2在基因转染中的应用。本发明中非病毒基因载体为阳离子型咪唑Gemini表面活性剂([C12-4-C12im]Br2)，缓冲液配制的[C12-4-C12im]Br2溶液可直接应用于基因转染。本发明还提供了[C12-4-C12im]Br2有效诱导DNA凝聚形成[C12-4-C12im]Br2/DNA纳米复合物的方法；向受体细胞添加[C12-4-C12im]Br2/DNA的纳米复合物的缓冲液溶液，可以实现基因在细胞内的高效率转染。本发明中[Cn-s-Cnim]Br2及[C12-4-C12im]Br2/DNA纳米复合物对不同的细胞均具有较高的基因转染效率，且对于转染细胞的细胞毒性较低。
文档编号C12N15/63GK102943086SQ201210404508
公开日2013年2月27日 申请日期2012年10月22日 优先权日2012年10月22日
发明者徐桂英, 周亭, 杨延莲, 敖明祺, 李平, 王琛 申请人:山东大学