专利名称：一种检测镉生物可利用度的微生物细胞传感器的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测水体及土壤中镉生物可利用度的微生物细胞传感器的搭建及使用。
背景技术：
镉(Cd)是危及人类健康的有毒物质之一，在美国毒物管理委员会(ATSDR)黑名单上名列第六，国际癌症研究署(IARC)把镉门类为第一类人类致癌物。镉污染主要是由于人类长期进行污水灌溉、污泥及含镉磷肥的大量施用、冶炼等行为造成的。镉进入环境后即可影响水体和土壤质量，对生态系统造成风险，影响农产品安全质量，进而被传递进入食物链的顶端而输胁人体健康。镉进入人体后，主要累积在肝、肾、胰腺、甲状腺和骨骼中，可使肾脏器官等发生病变，并影响人体的正常活动，造成贫血、高血压、神经痛、骨质松软、肾炎和分泌失调等病症。我国土壤存在严重的重金属污染问题，其中土壤镉污染面积约为13300hm2，土壤镉含量在在I 5mg · kg_\镉污染治理工作迫在眉睫，对污染环境的镉进行合理、准确的监测是开展污染防治工作的重要前提。目前监测和检测重金属污染物主要有两种方法一种是物理化学分析法，如电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)等，其优点是具备高检测灵敏度和高特异性，但也存在一些不足，如仪器设备昂贵，操作复杂，检测周期长，最重要的一点是，传统的物理化学方法主要是对环境重金属总量进行测定，不能检测重金属的生物可利用度；另一种方法是基于生物有机体的生物传感器，其优势是可以直接反映污染物对生物有机体的毒性及影响。微生物细胞具有易操作，繁殖及生存能力强，易储存和稳定性高的特点，以微生物细胞为生物学感应元件的微生物细胞传感器可以极大简化传感器的制作过程，提高传感器的检测效率。微生物细胞传感器的微生物细胞含有一个由特异调控蛋白基因和报告基因组成的重组质粒。当宿主细胞的生长环境中有重金属离子存在时，宿主细胞通过不同的机制吸收重金属离子。当重金属离子进入到胞内后，重组质粒或宿主染色体DNA编码的转录调控蛋白被重金属离子特异激活，与启动子绑定或从启动子上脱落，激活(“turn on”)或抑制(“turn off”)启动子的启动，进而调控下游报告基因表达，产生可检测的信号，这种信号的变化强度与重金属诱导物的浓度密切相关，转录调控蛋白对重金属离子的识别能力和绑定能力决定着微生物全细胞传感器的检测特异性和灵敏度。微生物细胞传感器已成为重金属生物可利用度监测和风险污染评价的重要工具。
发明内容
本发明的目的在于针对现有的化学检测方法不能反映镉的生物可利用度且存在操作复杂、仪器价格昂贵等问题，利用金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureu pl258质粒镉抗性操纵子cad的启动子序列、调控蛋白基因cadC和商业化质粒pEGMluc的荧光素酶报告基因(Iuc)，构建了一种微生物细胞传感器，从而提供了一种具有高灵敏度、低成本等特点的镉生物可利用度检测方法。构建该细胞传感器的具体操作步骤为1、T7启动子和报告基因的拼接以商业化质粒载体pRSET A. B. C为模板，PCR扩增得到T7启动子片段fl ;以商业化质粒载体pGEM-luc为模板，PCR扩增得到荧光素酶报告基因Iuc片段f2 ;将片段Π和f2按一定比例混合，以混合液为模板，PCR扩增得到T7启动子和报告基因Iuc的拼接片段f3 ；
2、包含T7启动子的报告基因导入PUC18质粒对pUC18质粒用SacI与BamHI进行双酶切处理，纯化后得到载体vl ;对拼接序列f3用SacI与BamHI进行双酶切处理，纯化后得到片段f4 ;将片段f4连入载体vl，利用大肠杆菌E. coli作为宿主进行转化，得到含有T7启动子和报告基因Iuc的载体v2 ；3、载体v2中Iac启动子的去除以pUC18为模板，扩增得到不含Iac启动子的pUC18部分序列f5 ;对f5用SacI和HindIII进行双酶切处理后纯化得到片段fV ;对载体v2用SacI和HindIII进行双酶切处理，纯化后得到载体v3 ;将片段fV连入载体v3，利用大肠杆菌作为宿主进行转化，得到含有T7启动子和报告基因Iuc且去除Iac启动子的载体v4 ；4、载体v4与T7终止子的拼接以pET30a为模板，扩增得到T7终止子片段f6 ;对片段f6用BamHI和HindIII进行双酶切处理，纯化后得到片段f6';对载体v4用BamHI和HindIII进行双酶切处理，纯化后得到载体v5 ;将片段f6'连入载体v5，利用大肠杆菌E. coli作为宿主进行转化，得到受IPTG诱导表达的基础型传感器细胞；5、基础型传感器的表达能力验证用2mM的IPTG诱导基础型传感器细胞，采用Varioskan Flash全波长扫描多功能酶标仪检测其发射光谱以验证基础型传感器细胞对报告基因的表达能力。6、目标质粒的构建以金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureu pl258质粒为模板,扩增得到包含cad启动子和调控蛋白基因cadC的片度f7 ;对片段f7用SacI和XhoI进行双酶切处理，纯化后得到片段f7';对基础型传感器细胞质粒v6用SacI和XhoI进行双酶切处理，纯化后得到片段W ;将片段fT连入载体ν6'，利用大肠杆菌E. coli作为宿主进行转化，得到目标质粒v7 ；7、目标传感器细胞的搭建完成利用商业化宿主感受态细胞大肠杆菌E. coli DH5a为宿主，将目标质粒v7转入宿主细胞得到可检测镉生物可利用度的微生物细胞传感器。
具体实施例方式以下实施例将对本发明作进一步的说明实施例I :第一步按种传感器细胞单菌落于50mL三角瓶中，添加氨苄青霉素到终浓度为100 μ g/mL, 37°C，200r · mirT1 过夜培养；
第二步取O. 5mL的上述菌液到14. 5mL的新鲜LB培养基中，37°C，200r ·ιιι η_1培养至 OD600 = 1.2 ；第三步将菌液用新鲜LB培养基稀释至OD6tltl = 0.4 ；第四步取50 μ L稀释后的菌液分别与镉标准溶液、待测样品等体积混合，30°C静置诱导；第五步将40 μ L空载体细胞与50 μ L诱导培养液混合，加入IOyL IM K2HPO4 (pH
7.8)和20mM EDTA的裂解缓冲液，_70°C条件下快速冷冻混合物lOmin，然后23°C水浴细胞3min,最后加入300 μ L新鲜配制的裂解混合物(见附录)，混勻后室温孵育IOmin ；第六步每个96孔板中加入20 μ L的裂解液，再加入100 μ L荧光素酶检测液后， 用荧光检测仪立刻检测；第七步根据标准样品诱导下传感器细胞的荧光值，制作荧光强度和诱导物镉浓度的标准曲线，利用标准曲线计算待测样品的中镉的相对浓度。附录 IOmL裂解混合物配方5. 5mL 水2mL 5 X CCLR25mg BSA2. 5mL 溶菌酶混合液(5mL 配方0. 5mL IM K2HPO4 (pH 7· 8)与 20mM EDTA 的混合液，4. 5mL无菌水，25mg溶菌酶，混匀)T7启动子序列CGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAIuc 序列ATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGGCCCGGCGCCATTCTATCCTCTAGAGGATGGAACCGCTGGAGAGCAACTGCATAAGGCTATGAAGAGATACGCCCTGGTTCCTGGAACAATTGCTTTTACAGATGCACATATCGAGGTGAACATCACGTACGCGGAATACTTCGAAATGTCCGTTCGGTTGGCAGAAGCTATGAAACGATATGGGCTGAATACAAATCACAGAATCGTCGTATGCAGTGAAAACTCTCTTCAATTCTTTATGCCGGTGTTGGGCGCGTTATTTATCGGAGTTGCAGTTGCGC CCGCGAACGA CATTTATAAT GAACGTGAATTGCTCAACAGTATGAACATTTCGCAGCCTACCGTAGTGTTTGTTTCCAAAAAGGGGTTGCAAAAAATTTTGAACGTGCAAAAAAAATTACCAATAATCCAGAAAATTATTATCATGGATTCTAAAACGGATTACCAGGGATTTCAGTCGATGTACACGTTCGTCACATCTCATCTACCTCCCGGTTTTAATGAATACGATTTTGTACCAGAGTCCTTTGATCGTGACAAAACAATTGCACTGATAATGAATTCCTCTGGATCTACTGGGTTACCTAAGGGTGTGGCCCTTCCGCATAGAACTGCCTGCGTCAGATTCTCGCATGCCAGAGATCCTATTTTTGGCAATCAAATCATTCCGGATACTGCGATTTTAAGTGTTGTTCCATTCCATCACGGTTTTGGAATGTTTACTACACTCGGATATTTGATATGTGGATTTCGAGTCGTCTTAATGTATAGATTTGAAGAAGAGCTGTTTTTACGATCCCTTCAGGATTACAAAATTCAAAGTGCGTTGCTAGTACCAACCCTATTTTCATTCTTCGCCAAAAGCACTCTGATTGACAAATACGATTTATCTAATTTACACGAAATTGCTTCTGGGGGCGCACCTCTTTCGAAAGAAGTCGGGGAAGCGGTTGCAAAACGCTTCCATCTTCCAGGGATACGACAAGGATATGGGCTCACTGAGACTACATCAGCTATTCTGATTACACCCGAGGGGGATGATAAACCGGGCGCGGTCGGTAAAGTTGTTCCATTTTTTGAAGCGAAGGTTGTGGATCTGGATACCGGGAAAACGCTGGGCGTTAATCAGAGAGGCGAATTATGTGTCAGAGGACCTATGATTATGTCCGGTTATGTAAACAATCCGGAAGCGACCAACGCCTTGATTGACAAGGATGGATGGCTACATTCTGGAGACATAGCTTACTGGGACGAAGACGAACACTTCTTCATAGTTGACCGCTTGAAGTCTTTAATTAAATACAAAGGATATCAGGTGGCCCCCGCTGAATTGGAATCGATATTGTTACAACACCCCAACATCTTCGACGCGGGCGTGGCAGGTCTTCCCGACGATGACGCCGGTGAACTTCCCGCCGCCGTTGTTGTTTTGGAGCACGGAAAGACGATGACGGAAAAAGAGATCGTGGATTACGTCGCCAGTCAAGTAACAACCGCGAAAAAGTTGCGCGGAGGAGTTGTGTTTGTGGACGAAGTACCGAAAGGTCTTACCGGAAAACTCGACGCAAGAAAAATCAGAGAGATCCTCATAAAGGCCAAGAAGGGCGGAAA GTCCAAATTGTAAT7终止子序列ATAGTTCCTCCTTTCAGCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGGTGGCAGCAGCCAACTCAGCTTCCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCcdd启动子序列·GTGTATTTTTTAATAAATTATTTTACTTATTGAAATGTATTATTTTCTAATGTCATACCCTGGTCAAAACCGTTCGTTTTTGAGACTAGAATTTTATGCCCTACTTACTTCTTTTATTTTCATTCAAATATTTGCTTGCATGATGAGTCGAAAATGGTTATAATACACTCAAATAAATATTTGAATGAAGATGGGATGATAATcadC 序列ATGAGTTATGAAAATACTTGTGATGTGATCTGTGTACATGAGGATAAAGTTAACAATGCTTTAAGTTTTTTAGAAGATGATAAATCTAAGAAATTACTTAACATTTTAGAAAAAATTTGTGATGAGAAGAAATTGAAAATCATATTATCTTTGATTAAAGAAGATGAGTTGTGTGTTTGTGATATTTCTTTGATATTGAAAATGAGTATTGCTTCAACTTCACATCATTTAAGGCTTTTATATAAAAATGAGGTACTTGATTTTTATAAAGATGGAAAGATGGCATATTATTTTATTAAAGACGATGAAATAAGAGAGTTTTTCTCTAAAAATCATGAGGGTTTTTGA
权利要求
1.一种微生物细胞传感器，由细菌作基本材料，通过基因工程手段构建，用来检测水体和土壤中镉的生物可利用度。
2.根据权利要求I所述的微生物细胞传感器，其特征在于大肠杆菌为宿主细胞。
3.根据权利要求I所述的微生物细胞传感器，其特征在于高灵敏度的萤火虫荧光素酶Iuc为报告基因。
4.根据权利要求I所述的微生物细胞传感器，其使用方法 第一步接种传感器细胞单菌落于50mL三角瓶中，添加氨苄青霉素到终浓度为100 μ g/mL, 37 °C，200r · mirT1 过夜培养； 第二步取O. 5mL的上述菌液到14. 5mL的新鲜LB培养基中，37°C，200r -min^1培养至OD6OO =1.2; 第三步将菌液用新鲜LB培养基稀释至OD6tltl = 0.4 ； 第四步取50 μ L稀释后的菌液分别与镉标准溶液、待测样品等体积混合，30°C静置诱导； 第五步将40yL空载体细胞与50yL诱导培养液混合，加入IOyL IM K2HPO4 (pH 7.8)和20mM EDTA的裂解缓冲液，_70°C条件下快速冷冻混合物lOmin，然后23°C水浴细胞3min，最后加入300 μ L新鲜配制的裂解混合物(见附录)，混匀后室温孵育IOmin ； 第六步每个96孔板中加入20 μ L的裂解液,再加入100 μ L荧光素酶检测液后,用荧光检测仪立刻检测； 第七步根据标准样品诱导下传感器细胞的荧光值，制作荧光强度随诱导物镉浓度变化的标准曲线，利用标准曲线计算待测样品的中镉的相对浓度。
5.根据权利要求4所述的微生物细胞传感器的使用方法，其特征在于微生物细胞传感器的培养温度为37°C，微生物细胞传感器的诱导温度为30°C，荧光强度值运用荧光检测仪进行采集和检测。
全文摘要
本发明涉及一种镉生物可利用度检测的微生物细胞传感器，适用于水体和土壤中镉的生物可利用度的检测。所述细胞传感器包括大肠杆菌E.coli，大肠杆菌E.coli作为宿主细胞承载重组质粒。重组质粒，重组质粒为含有镉抗性系统cad启动子、镉抗性系统调控基因cadC、荧光素酶基因luc和T7终止子串联序列的pUC18质粒。本传感器对镉的最短响应时间为5分钟，对镉的最低检测浓度为0.01微摩尔/升，最高检测浓度为50微摩尔/升，具有灵敏度高，响应速度快，成本低，操作简单的特点，可广泛运用于污染环境镉的检测和风险评价。
文档编号C12R1/19GK102911906SQ201210465178
公开日2013年2月6日 申请日期2012年11月19日 优先权日2012年11月19日
发明者庄国强, 侯启会, 马安周, 崔萌萌, 王艳娟 申请人:中国科学院生态环境研究中心