专利名称：Pcr法检测蚕卵中家蚕微粒子虫的样本处理方法及检测方法
技术领域：
本发明属于微生物检测技术领域，涉及一种PCR法检测蚕卵中家蚕微粒子虫的样本处理方法及检测方法。
背景技术：
家蚕微粒子虫(Nosema bombycis Naegeli 1857)是家蚕微粒子病的病原。家蚕微粒子虫是一种原生动物，当其在家蚕体内寄生时，以孢子形态出现最多，孢子为单细胞构造，通常为椭圆形，外包裹O. 5微米厚的孢子壁，孢子壁很坚韧，能耐弱酸和碱，对外界的抵抗力很强。家蚕微粒子病是一种全身性感染的慢性蚕病，病程较长，且在家蚕的各个发育阶段都有不同的病征和病变，是毁灭性蚕病之一，被世界各养蚕国家确定为强制检疫对象。1865 1970年,法国科学家巴斯德(Louis Pasteur)对家蚕微粒子病害进行了一系列的研究，发现微粒子原虫是该病害的病原，并可通过食下和胚种两个途径感染家蚕。巴斯德建立了母蛾单蛾光学显微镜检疫的技术方法，但随着蚕种生产量的扩大，检疫工作量大幅上升，单蛾光学显微镜检疫技术无法适应生产需求。上世纪60年代，日本科学家建立了母蛾集团光学显微镜检疫技术，我国在80年代的主要蚕区开始推广应用至今。母蛾集团检疫在一定程度上节省了检疫时间和成本，但仍存在一些问题，其一是母蛾检疫是一种产品的间接检疫，在检疫结果与产品的对应性上存在明显缺陷；其二是光学显微镜在鉴别不同种类微孢子虫或类似物时的能力十分有限。分子生物学技术的高速发展，为家蚕微粒子虫的检测提供了新的技术方法和手段，也使直接针对蚕卵进行检疫成为了可能，科学家针对免疫学检测技术和PCR检测技术在家蚕微粒子虫检测中的应用进行了广泛研究。现有免疫学技术特别是酶标技术和胶体金技术在技术上具备良好的商业化平台，但由于家蚕微粒子虫的大个体和高比重等特性，使其检测的稳定性和灵敏度等方面存在缺陷，难于在生产上应用。PCR检测技术在家蚕微粒子虫的检测中可以避免免疫学技术所存在的上述问题，操作也较为容易，成本相对较低，但在实际应用过程中还存在着一定的缺陷。一般在PCR检测过程中，都需要先提取待测样本的核苷酸，而该过程因耗时较长，不适合生产中大批量样本的检测；通过对样本进行煮沸的处理后直接进行LAMP技术，节省了核苷酸提取过程，简单易行，但其过高的假阳性，特异性不佳，因而其只能应用于一般性病原虫检查而无法应用于检疫性病原虫；荧光定量PCR方法虽然具有很好的特异性和批量检测的优点，但仍然避免不了核苷酸的制备过程，检疫成本相对较高。
发明内容
本发明提供了一种蚕卵样本的处理方法，解决了现有PCR法检测家蚕微粒子虫需提取蚕卵样本的核苷酸，耗时较长的问题。
一种蚕卵样本的处理方法，包括将蚕卵样本加入前处理液中，放置30min以上，捣碎蚕卵并调节溶液PH值为中性，制得PCR模板；所述前处理液为碱性且包含I IOmol/L的甜菜碱。所述蚕卵样本可以是即时浸酸的蚕卵、或冷藏浸酸后的蚕卵、多化性蚕卵或自然越年蚕卵。碱性环境可以诱导家蚕微粒子虫孢子发芽，弹出极丝，释放孢原质及核酸，但强碱性环境不利于PCR的进行，因此需要将溶液pH值调节至中性；另外，加入甜菜碱可以一定程度上消除蚕卵成分会对PCR反应造成的干扰，优选的，甜菜碱的浓度为5 8mol/L,最优选的，甜菜碱的浓度为5mol/L。优选的，所述前处理液包含O. 5 2mol/L的NaOH。由于蚕卵具有坚硬的外壳，家蚕微粒子虫的孢子也有坚硬的孢子壁，两者都不易破裂，氢氧化钠可以软化和崩解蚕卵外壳，更优选的，所述NaOH的浓度为lmol/L。蚕卵在前处理液中的放置时间影响蚕卵的崩解率、微粒子虫孢子的发芽率以及释放核酸的量，所述放置时间优选为30 120min,在这个时间范围内，PCR结果差异不大。本发明还提供了一种检测蚕卵中家蚕微粒子虫的方法，包括(I)取蚕卵样本，利用所述的处理方法对蚕卵样本进行处理，获得PCR模板；(2)设计特异性引物，利用步骤(I)获得的PCR模板进行PCR扩增；(3)将PCR扩增产物电泳分离，染色成像，根据成像结果判定蚕卵样本中是否含有家蚕微粒子虫。扩增参数的选择也有可能影响最终的检测结果，本发明PCR扩增的参数优选为预变性95°C，5min ;变性95°C，0. 5min，退火48. 3°C,O. 5min，延伸 72°C，lmin，循环 35 次;延伸 72°C，5min。本发明又提供一组检测家蚕微粒子虫的特异性引物，具体为正向引物5'-ATAAATCGGAGGGCAAAT-3'；反向引物5'-TAAGCCGCACAATCCAC-3'。该组引物根据家蚕微粒子虫的高度保守的小亚基核糖体RNA基因设计。扩增片段长度为408bp，因此如果凝胶图谱中出现408bp的条带，则说明蚕卵样本中携带家蚕微粒子虫。本发明方法操作简单，成本低，使整个检测流程时间缩短40% (3小时)，可用于一般性的家蚕微粒子虫检测，更适合于样本量较大的蚕卵(或蚕种、蚕蛹、蛾)家蚕微粒子虫检疫。
图I为本发明实施例I中的PCR扩增产物电泳图；其中，M为核酸分子量标记；1为健康家蚕所产的蚕卵样本；2、3、4、5和6分别为感染孢子浓度为103、104、IO5UO6和IO7个/mL家蚕微粒子虫的家蚕所产的蚕卵样本；图2为本发明实施例2中的PCR扩增产物电泳图；其中，M为核酸分子量标记；0和I为健康蚕卵中混入I. O μ L孢子浓度为IO9个/mL家蚕微粒子虫的2个样本；3和5为健康蚕卵中混入I. O μ L孢子浓度为IO7个/mL家蚕微粒子虫的2个样本；7和9为健康蚕卵中混入I. O μ L孢子浓度为IO5个/mL家蚕微粒子虫的2个样本；图3为本发明实施例3中的PCR扩增产物电泳图；其中，M为核酸分子量标记；1、2、3、4、5、6、7、8、9和10均为感染孢子浓度为IO4个/mL家蚕微粒子虫的家蚕所产蚕卵中的死卵样本； 图4为本发明实施例4和实施例5中的PCR扩增产物电泳图；其中，M为核酸分子量标记；1、2、3和4为感染孢子浓度为IO4个/mL家蚕微粒子虫的家蚕的幼虫中肠样本；A1、A2、A3和A4为感染孢子浓度为IO8个/mL家蚕微粒子虫的家蚕蚕蛹样本；B1、B2、B3和B4为感染孢子浓度为IO8个/mL家蚕微粒子虫的家蚕母蛾样本；C1、C2、C3和C4是4个健康母蛾样本。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明作进一步阐释。实施例I感染家蚕微粒子虫的蚕卵检测(I)引物设计针对家蚕微粒子虫的小亚基核糖体RNA基因(N bombycis SSU rRNAFJ854546. I)为靶向，设计特异性引物，扩增片段的长度为408bp，其中正向引物(NB-SSU599F)5/ -ATAAATCGGAGGGCAAAT-3'；反向引物(NB-SSU599R)5/ -TAAGCCGCACAATCCAC-3'。(2)样本准备及处理感染家蚕微粒子虫的次代蚕卵的准备常规饲养蚕种，5龄起蚕后，按照每头家蚕100 μ L家蚕微粒子虫孢子液的剂量，进行不同家蚕微粒子虫孢子浓度(孢子浓度分别为
103、104、IO5UO6和IO7个/mL)的舔食，4小时内食尽，接着进行常规饲养、上蔟、羽化、交配(交配时用的雄蛾为健康个体)和产卵，交配后产下的卵即为次代蚕卵，将蚕卵即时浸酸。将即时浸酸的蚕卵置于25°C和相对湿度为80%的培养箱内放置10天，取转青的蚕卵，放入PCR管，加入5 μ L的样本前处理液(含I. OmoI/L氢氧化钠和5. OmoI/L甜菜碱)，加盖，25°C放置120min,用50 μ L枪头捣碎蚕卵，加入5 μ L lmol/L盐酸，加盖放置，用于PCR扩增，当天用毕即可。
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(3) PCR扩增
在步骤(2)中得到的含处理过的蚕卵样本的PCR管内中，加入下列试剂IOXbuffer5 μ L
(含Tris-HCl，100mmol/L ；KC1, 500mmol/L ；MgCl2,15mmol/L)
dNTP2 μ L
(dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP 分别为 2. 5mmol/L
权利要求
1.一种蚕卵样本的处理方法，其特征在于，包括将蚕卵样本加入前处理液中，放置30min以上，捣碎蚕卵并调节溶液pH值为中性，制得PCR模板；所述前处理液为碱性且包含I 10mol/L的甜菜碱。
2.如权利要求I所述的处理方法，其特征在于，所述甜菜碱浓度为5 8mol/L。
3.如权利要求2所述的处理方法，其特征在于，所述甜菜碱浓度为5mol/L。
4.如权利要求I所述的处理方法，其特征在于，所述放置的时间为30 120min。
5.如权利要求I所述的处理方法，其特征在于，所述前处理液包含O.5 2mol/L的NaOH。
6.如权利要求5所述的处理方法，其特征在于，所述前处理液包含lmol/L的NaOH。
7.如权利要求I所述的处理方法，其特征在于，所述调节溶液pH值的试剂为盐酸。
8.一种蚕卵中家蚕微粒子虫的检测方法,包括 (1)取蚕卵样本，利用权利要求I 5任一所述的处理方法对蚕卵样本进行处理，获得PCR模板； (2)设计特异性引物，利用步骤(I)获得的PCR模板进行PCR扩增； (3)将PCR扩增产物电泳分离，染色成像，根据成像结果判定蚕卵样本中是否含有家蚕微粒子虫。
9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述特异性引物为 正向引物5' -ATAAATCGGAGGGCAAAT-3'； 反向引物5' -TAAGCCGCACAATCCAC-3'。
10.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的参数为预变性95°C，5min ;变性 95。。，O. 5min,退火 48. 3 °C, O. 5min,延伸 72°C，lmin，循环 35 次；延伸 72。。，5min。
全文摘要
本发明公开了一种PCR法检测蚕卵中家蚕微粒子虫的样本处理方法，包括将蚕卵样本加入前处理液中，放置30min以上，捣碎蚕卵并调节溶液pH值为中性，制得PCR模板；所述前处理液为碱性且包含1～10mol/L的甜菜碱。另外，本发明还提供了一种运用上述的样本处理方法检测蚕卵中家蚕微粒子虫的方法。本发明方法操作简单，成本低，使整个检测流程时间缩短40％，可用于一般性的家蚕微粒子虫检测，更适合于样本量较大的蚕卵(或蚕种、蚕蛹、蛾)家蚕微粒子虫检疫。
文档编号C12Q1/68GK102925583SQ20121046568
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月16日 优先权日2012年11月16日
发明者鲁兴萌, 蔡顺风, 李明乾, 马焕艳, 何永强, 李光才 申请人:浙江大学