专利名称：具杀线虫活力的球毛壳菌及其产生的代谢物和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物农药技术领域。具体涉及一株具有杀线虫活性的球毛壳菌，以及应用其真菌代谢物生物防治根结线虫的方法。
背景技术：
全世界严重危害植物的线虫有根结线虫、胞囊线虫、滑刃线虫、茎线虫、粒线虫及短体(根腐)线虫等(刘维志，2002)。其中，根结线虫(Meloidogyne spp.)作为危害农作物的重要病原生物之一，给世界各地大面积的农作物带来了极大的危害(赵鸿等，2003)。根结线虫寄主范围很广，超过3000种植物，分属于114个科。茄科、葫芦科和十字花科等植物，根结线虫病较普遍。根结线虫的生活史比较简单，从卵发育成幼虫，经四次蜕 皮，最后变成成虫。大多数线虫生活周期大约为3 — 4周。根结线虫产卵后，卵在卵壳内发育成一龄幼虫，并在卵壳内脱皮一次，孵化后为二龄幼虫，二龄幼虫栖息在土壤内，伺机侵染，通常从根尖侵入根内，并在根内定居和生长，再经两次脱皮变成四龄幼虫，在第四次脱皮前，雄幼虫变为细长形，雌幼虫膨大为长梨形，最后一次脱皮后，分别成为雌、雄成虫。雄虫离开根在土壤中活动，雌虫留在根内，可以不经交配而产卵，卵产在胶质的卵囊内。在所有的根结线虫中，南方根结线虫(Meloidogyne incognita,或Μ· incognita)的危害最为严重。每年由根结线虫造成的农作物减产损失大于1000亿美元。现有的杀虫剂不能有效的抑制不断增长的线虫数量。而大量使用溴甲烷或呋喃丹等剧毒农药杀死根结线虫的传统方法，由于存在环境和食品安全风险，已经逐步被禁止使用。因此，寻找它们的替代物，如生物制剂和天然产物，以有效防治根结线虫的危害已经成为国内外的研究热点。研究发现许多真菌具有潜在的抗线虫活性。最近,子囊真菌球毛壳菌Chaetomium globosum (或C. globosum)已开始应用于农业生物防治，例如，作为植物病原微生物和蚜虫的生防制剂。也有一些报道称此菌具有杀线虫活性。C. globosum的粗制培养液能够抑制M. incognita和大豆孢囊线虫(Heteroderaglycines)的卵孵化(Meyer等,2004)。球毛壳属Chaetomium ChlOOl菌株的发酵液不仅对M. incognita 二龄幼虫具有显著的致死作用，还能够明显降低根结的形成数量(Yan等，2011)。但是,从C. globosum中分离鉴定杀线虫活性的天然产物的研究极少。食线虫真菌可以产生次生代谢物以侵染或者杀死线虫，这些天然化合物是具有潜力的用以控制线虫的化学杀虫剂和熏蒸剂的替代品。另外，考虑到普遍存在于土壤中，而且可以作为防治病原微生物和害虫如蚜虫的生物制剂，探索c. globosum的杀线虫活力并提取生物制剂将成为今后商业和农业应用的重点研究。国内外文献检索表明，目前还没有将球毛壳菌的次生代谢产物作为线虫防治药剂的报道。因此利用C. globosum的发酵产物制备杀线虫剂是一条值得探索的途径。
发明内容
本发明的目的是选择对根结线虫具有高杀虫活性的真菌菌株，并将菌株按常规液体发酵培养后，从代谢产物中提取具有杀线虫活性物质的有效成分，开发杀线虫生物农药，其中，所述的根结线虫优选是南方根结线虫。本发明正是基于上述理论，以根结线虫为靶标，从真菌次生代谢产物中寻找高效杀线虫活性物质，拟为研究开发新型生物杀线虫剂寻找新的资源。在寻找具有潜力的生物杀线虫剂的过程中，我们分离得到一株球毛壳菌C. globosum NK106,并且从其发酵液中分离纯化出一种次生代谢产物球毛壳菌素chaetoglobosin A(ChA)0进一步深入研究发现该菌株的发酵液和分离纯化的ChA对M. incognita具有很强的杀灭活性。本发明首先提供了一株具有杀线虫活性的真菌菌株，即子囊真菌球毛壳菌Chaetomium globosum NK106,已于2012年10月29日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，菌种保藏号CGMCC6716。C. globosum NK106是从大量真菌菌株中筛选出的一株对南方根结线虫具有良好杀线虫活性的真菌菌株。本发明同时从球毛壳菌C. globosum NK106的发酵液中分离纯化出一种次生代谢产物球毛壳菌素chaetoglobosin A (ChA)0该代谢产物ChA能够用于防治植物寄生线虫，特别是对M. incognita具有很强的杀灭活性。该代谢物是由本发明的真菌菌株经过常规的液体发酵培养后提取制备的。本发明的优点和积极效果本发明提供了一株具有杀线虫活性的球毛壳菌C. globosum NK106。本发明提供的真菌代谢物ChA是国内外首次发现具有杀线虫活性的物质。本发明的生物杀线虫剂为纯生物制剂，可用于对根结线虫等植物寄生线虫的生物防治。本发明的杀线虫剂对于环境及植物、人、动物等所有生物无不良影响，而且生产成本低，生产过程简单，不污染环境。微生物杀线虫剂在试验浓度范围内对黄瓜没有药害，反而可以促进和剌激作物的生长，安全性好。本发明对于植物线虫的生物防治、微生物杀线剂的开发应用和农产品的无公害生产，将具有极其重要的意义。
图I是球毛壳菌Chaetomium globosum NK106的菌体形态。A是固体PDA上培养2周的菌体形态，B是液体PDA中培养9天的菌体形态。图2是高效液相色谱(HPLC)分析方法纯化和鉴定NK106发酵产物中所含球毛壳菌素ChA。A是ChA标准样品，出峰时间14. 490min，B是NK106发酵产物，出峰时间14. 480min。图3是不同浓度真菌发酵滤液和提纯ChA对J2死亡率的影响。A是不同浓度的发酵液处理，B是不同浓度的ChA处理。·图4是不同浓度真菌发酵滤液和提纯ChA处理线虫后对其侵染根部的影响。A是不同浓度的发酵液处理，B是不同浓度的ChA处理。本发明提供的具有杀线虫活性的菌株是一株腐生子囊真菌，已于2012年10月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号CGMCC6716,分类命名Chaetomium globosumNK106。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例I、本发明所述的球毛壳菌C. globosum NK106的培养特征本发明C. globosum NK106菌株分离自东北某地的松柏(Cupressns sp.)树皮上。菌株在PDA平板上28°C培养2周后，菌体呈现棕褐色(如图IA所示)，用无菌水收集孢子得到孢子悬浮液。将孢子悬浮液转接于含有200ml PDA 土豆培养基的500ml烧瓶中，于28°C，180rpm震荡培养9天(如图IB所示)。每个烧瓶接种I X IO5个孢子。PDA培养基配方(g/L):马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g (固体培养基中添加)。实施例2、本发明提供的C. globosum NK106发酵产物处理过程，产物的分析和鉴
定将实施例I中在PDA中培养的发酵液进行抽滤，使得菌丝同发酵液分离开来；将抽滤后所得发酵上清液与等体积二氯甲烷混合，萃取过夜；使用旋转蒸发器对上步所得有机相滤液浓缩后得到粗提产物，进行高效液相色谱(HPLC)分析鉴定和收集。HPLC选择分析型C-180DS色谱柱(4. 6X250mm, Kromasil),色谱条件检测波长227nm，流速lmL/min，柱温是室温，流动相为甲醇水=7 :3。通过实验表明，发酵产物中含有与ChA标准品保留时间相同的物质(实验结果见图2)。(A. ChA标准品，14. 490min ；B. NK106发酵产物，14.480min)。根据出峰面积，使用标准曲线回归的方法可以计算出发酵产物中ChA的含量。ChA在培养至第9天时达到最大值50. 5mg/L。NK106在PDA培养基中能够稳定生产ChA。实施例3、NK106菌株发酵液和提纯ChA的杀线虫活性发酵液实验设有100%、50%、25%、12. 5%真菌滤液(Filtrates)和PDA培养基(Medium,对照)5 个处理，ChA 实验设有 3 μ g/mL、30 μ g/mL、300 μ g/mL 和 10% 甲醇(MeOH,对照)4个处理。两组处理均已无菌蒸馏水(SDW)作为空白对照。每个处理包括6次重复。以下实验方法(2)、(3)均使用这两组处理进行实验。I.实验方法(I)线虫和卵的准备实验所用的虫卵，是从南方根结线虫侵染的彩椒(Capsicum annuum L.)的根上得到的。将根上的土洗净后放在1%的次氯酸钠中用搅拌器搅拌使卵块中的卵释放出来，然后过200目和500目筛，500目的筛子上收集卵。二龄幼虫J2则由卵孵化2-3天获得。 (2)真菌发酵滤液和提纯ChA对J2的影响用24孔板研究NK106发酵滤液和ChA对南方根结线虫J2的致死率。将线虫悬浮液(0. ImL中包括大约100条J2)放入含有不同浓度滤液和ChA的24孔板的小孔中，均以无菌水作为负对照。接种线虫后，将24孔板放在25°C的培养箱中。为了研究真菌滤液对线虫的致死率，将线虫在内生真菌滤液中处理24h、48h和72h后记录线虫的死亡数和总数，并计算校正死亡率。通过观察NaOH刺激后线虫的反应来确定线虫是否死亡。(3)真菌发酵滤液和提纯ChA处理线虫后对其侵染根部的影响试验在南开大学网室中进行。热处理的土(其中干土中包括0.74g K2SO4,
0.74gC0 (NH2)27O. 48g NH4H2PO4)与蛭石等体积混合后，放入直径9cm的花盆中。苗盆中种植黄瓜，一周后移栽到花盆中。4天后，南方根结线虫用不同浓度真菌发酵滤液和提纯ChA处理4h后，接种到每个花盆中1000条，每天按需给植物浇水。接种9天后收获植物，用淋浴喷头缓慢冲洗根上的土后，置于50ml离心管中，在离心管中放上水淹没植物根部并在_20°C的冰箱中放置24h。分离时，从冰箱中取出结冰的根，在室温下溶化后将植物根部放在组织粉碎机中搅拌30s以释放根组织内的线虫并给线虫计数。(4)提纯ChA对线虫繁殖的影响用与(3)相同处理过的土壤种植黄瓜苗，一周后移栽到花盆中。4天后，在花盆中加入浓度为O. 3、3、30mg/kg 土的提纯ChA。2天后将卵接种到土壤中，每个花盆1000个。自然生长35天后，收获植物测量植物的株高和鲜重，然后在烘箱中105°C下O. 5h，然后在80°C下烘10h。根部卵的获得方法，将收获的根用剪刀剪成l_2cm的小段，然后放在浓度为1%的次氯酸钠中，用A-88组织捣碎匀浆机搅拌12min后过筛(上边的筛为200目，下边的筛为500目)，用水喷头将200目筛上的根冲洗干净后收集起来测根的干重。卵则留在500目 筛上。将卵收集在50ml的离心管中，最后定容到40ml，然后用倒置显微镜观察计数。2.实验结果(I) NK106菌株发酵液和提纯ChA对J2的影响在对J2处理24h后，12. 5%浓度的发酵液仍然具有杀线虫效果(图3A)。100%浓度的发酵液处理72h时致死率达到最大值81. 3%。浓度为300 μ g/mL的ChA处理J248h后死亡率达到90. 2% (LC50=126. 5 μ g/ml)(图3B)，并且几乎所有线虫在72h处理后均死亡。不同浓度处理的死亡率之间具有显著性差异。(3) NK106菌株发酵液和提纯ChA对线虫侵染的影响与无菌水和没有接种菌种的PDA培养基相比，C. globosum NK106发酵液能够显著性降低线虫的侵染(图4A)。发酵液和ChA对线虫的侵染都表现出依赖浓度的规律。与负对照无菌水相比，ChA能够显著性抑制线虫侵染黄瓜，抑制率分别为300 μ g/mL浓度时的59. 4%和30μ g/mL浓度时的31. 7%(图4B)。与此结果相同，发酵液处理也都降低了线虫的侵染数量。与无菌水相比，MeOH和PDA培养基对侵染都没有影响。侵染是M. incognita生活史中关键阶段之一，阻断线虫的侵染能力可以说明ChA的抗线虫活性。(4) NK106菌株发酵液和提纯ChA对线虫繁殖和黄瓜苗生长的影响在处理35天后，30mg/kg的ChA显著性降低线虫卵的繁殖，与对照相比降低了63%，与此对应，30mg/kg浓度处理时，植物生长量显著提高，根部生物量提高3. 4倍，茎的生物量提高I. 9倍(表I)。结果表明ChA确实具有杀线虫活性。表I不同浓度ChA对线虫繁殖和黄瓜苗生长的影响
ChA浓度
根干重(g)茎干重(g)株高(cm)根部卵数量
(mg/kg)
O0.32 士 0.05c3.49±0.76b25.28士 2.53b530.5±50.24b
0.30.31 士 0.04c3.61 士 0.43b23·95 士 2.80b507.8士 62.13b
30.63±0.07b2.81±0.38b24.13±2.64b461.0±84.79b
301.09±0.13a6.54i0,60a39.73i4,09a194.0±46.31a本发明阐明了 C. globosumNK106的发酵培养液具有抗南方根结线虫(Μ.incognita)的特性。对J2存活、侵染、繁殖等一系列的抑制效果证实此真菌产物ChA具有强烈的杀线虫活性。据我们所知，这是首次发现ChA具有杀线虫效果。这项研究确定了 ChA可以与其他植物病原线虫管理技术结合用作一种线虫防治剂。未来实际应用还需要田间实 验和对其他植物病原线虫的效果评价。同时，NK106是一株极具有应用价值的真菌，特别是对南方根结线虫的杀线虫作用，显示出其良好的应用开发前景。
权利要求
1.一株具有杀线虫活性的真菌菌株，子囊真菌球毛壳菌Chaetomium globosum NK106,菌种保藏号CGMCC6716,分类命名为Chaetomium globosum。
2.根据权利要求I所述的菌株，其特征是该菌株生产具有杀线虫作用的次生代谢物球毛壳菌素 chaetoglobosin A (ChA)。
3.一种杀线虫制剂，其特征在于，包含有效量的权利要求I所述的真菌或权利要求2所述的真菌代谢物作为活性成分。
4.权利要求I所述的真菌或权利要求2所述的真菌代谢物或权利要求3所述的杀线虫制剂在植物寄生线虫生物防治中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的植物寄生线虫为根结线虫(Meloidogyne spp.)。
全文摘要
一株具杀线虫活力的球毛壳菌及其产生的代谢物和应用，属微生物农药技术领域。本发明所述球毛壳菌ChaetomiumglobosumNK106，保藏号为CGMCC6716。本发明包括所述菌株生产的球毛壳菌素chaetoglobosinA(ChA)防治植物寄生线虫的应用。ChA对南方根结线虫(Meloidogyneincognita)具有毒力高、杀线虫效果明显的突出特点。本发明测定了本菌株发酵液和提纯ChA对南方根结线虫二龄幼虫(J2)的影响。不同稀释浓度发酵液的处理和对照处理有显著差异。发酵液和ChA对J2有致死效果，ChA浓度为300μg/mL时，致死率为90.2%。所有稀释浓度的发酵液都抑制J2的侵染。黄瓜根部加入30mg/kgChA，寄生卵的数量降低了63%。这表明ChA具有杀线虫活性，是具良好的应用开发前景的生物杀线剂。
文档编号C12R1/645GK102925369SQ201210465068
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月16日 优先权日2012年11月16日
发明者朱旭东, 胡阳, 毕建男, 阮维斌 申请人:南开大学