专利名称：一种嗜热链球菌冻干保护剂及其制备方法
技术领域：
本发明属于嗜热链球菌保存技术领域，涉及一种嗜热链球菌冻干保护剂及其制备方法。
背景技术：
近年来，随着我国人民生活水平的提高和健康意识的增强，酸奶产量平均每年以25%的速度增长，这对酸奶发酵剂的品质、特性、种类提出了新的要求。嗜热链球菌是酸奶生产中制备发酵剂的常用乳酸菌种之一，酸奶的产品质量与发酵剂质量的优劣密切相关。目前嗜热链球菌菌粉的制备主要采用真空冷冻干燥技术。真空冷冻干燥是生产商品化乳酸菌发酵剂的一项关键技术。它是将欲保藏的微生物细胞在真空条件和冻结状态使 冰升华，最后达到干燥。在这些条件下，微生物的生命活动将处于休眠状态，它们的代谢是相对静止的，可以被长期保存。然而，冷冻干燥过程中不可避免会对乳酸菌细胞造成一定的损伤或死亡以及某些酶蛋白分子的钝化。如果保护剂的选择不当，则发酵剂活力会随之下降。因此，选择嗜热链球菌的合适的冻干保护剂具有重要意义。关于嗜热链球菌保护剂的报道有很多，主要集中于医学和生物学领域。蒲丽丽等研究了多种保护剂对嗜热链球菌的保护作用，发现海藻糖的保护效果最好，它能显著抑制冰晶生成的形态不稳定性。东北农业大学张英华通过单因素比较和正交试验设计，确定适合嗜热链球菌的最佳冻干保护剂配方为脱脂乳粉12%、海藻糖1%、甘油3%、谷氨酸钠1%。吕加平等用蔗糖、乳糖、海藻糖、麦芽糊精等13种材料对乳酸菌冻干保护效果进行了比较，结果表明，海藻糖、侧金盏花醇为最佳保护剂。于修鑑对半胱氨酸、脱脂乳粉、谷氨酸钠、壳聚糖等保护剂组成的复合冻干保护剂进行响应面优化实验，结果表明对乳酸菌影响最大的保护剂是半胱氨酸，经过优化取得的最优值分别为脱脂乳粉9. 7%，半胱氨酸0. 03M，谷氨酸钠3. 2%。东北林业大学赵敏等研究了影响嗜热链球菌活菌存活率的重要因素，结果表明可信度大于80%的因素为PVP、可溶性淀粉、硫代硫酸钠和麦芽糖。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种嗜热链球菌冻干保护剂及其制备方法，用于制备高活性菌粉，在制备菌粉的过程中加入冻干保护剂，可提高菌体的抗冷冻能力，从而提高菌粉的冻干存活率。本发明是通过以下技术方案来实现—种嗜热链球菌冻干保护剂，以质量份数计，包括以下组分脱脂乳粉10 20份、棉籽糖3 10份、大豆低聚糖4 10份、右旋糖苷D401. 5 5. 0份、三聚磷酸钠0. 3 0. 8份、没食子酸丙酯0. 005 0. 02份、蒸馏水100份。所述的嗜热链球菌冻干保护剂，以质量份数计，包括以下组分脱脂乳粉10 14份、棉籽糖3 5份、大豆低聚糖4 6份、右旋糖苷D401. 5 3. 0份、三聚磷酸钠0. 3 0. 6份、没食子酸丙酯0. 005 0. 01份、蒸馏水100份。
一种嗜热链球菌冻干保护剂的制备方法，包括以下步骤I)以质量份数计，在蒸馏水中添加10 20份的脱脂乳粉，加热溶解后用调节pH为6. 9 7. I，灭菌，冷却至室温；2)以质量份数计，将棉3 10份的籽糖、4 10份的大豆低聚糖和I. 5 5. 0份的右旋糖苷D40溶解于蒸馏水中，灭菌，冷却至室温；3)以质量份数计，将0. 3 0. 8份的三聚磷酸钠和0. 005 0. 02份的没食子酸丙
酯溶解于无菌生理盐水中，然后用滤膜过滤除菌；4)将步骤1)、2)、3)所制备的溶液混合，并调整水的总质量份数为100份，得到嗜热链球菌冻干保护剂。
所述的嗜热链球菌冻干保护剂的制备方法，包括以下步骤I)以质量份数计，在蒸馏水中添加10 14份的脱脂乳粉，加热溶解后用调节pH为6. 9 7. I，灭菌，冷却至室温；2)以质量份数计，将棉3 5份的籽糖、4 6份的大豆低聚糖和I. 5 3. 0份的右旋糖苷D40溶解于蒸馏水中，灭菌，冷却至室温；3)以质量份数计，将0. 3 0. 6份的三聚磷酸钠和0. 005 0. 01份的没食子酸丙
酯溶解于无菌生理盐水中，然后用滤膜过滤除菌；4)将步骤1)、2)、3)所制备的溶液混合，并调整水的总质量份数为100份，得到嗜热链球菌冻干保护剂。所述的步骤I)、步骤2)的灭菌是在100 115°C灭菌10 15min。将所述嗜热链球菌冻干保护剂与嗜热链球菌泥等体积混合均匀，于_40°C预冻3 12h，然后-50 -56°C冷冻干燥18 24h，得到嗜热链球菌菌粉。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果本发明提供的嗜热链球菌冻干保护剂，在制备菌粉的过程中加入冻干保护剂，可提高菌体的抗冷冻能力，从而提高菌粉的冻干存活率，且保藏期较长，存活率不易降低。本发明提供的嗜热链球菌冻干保护剂，在制备菌粉的过程中加入冻干保护剂后，所制备的嗜热链球菌菌粉中冻干存活率达到54. 48 62. 55%，菌粉活菌数为6. 32 X 101° 8. 2X1010cfu/go
具体实施例方式本发明提供一种嗜热链球菌冻干保护剂及其制备方法，用于制备高活性菌粉，在制备菌粉的过程中加入冻干保护剂，可提高菌体的抗冷冻能力，从而提高菌粉的冻干存活率。下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。实施例I嗜热链球菌冻干保护剂的组成为脱脂乳粉10g、棉籽糖3g、大豆低聚糖4g、右旋糖苷D401. 5g、三聚磷酸钠0. 3g、没食子酸丙酯0. 006g、蒸馏水100ml。其中大豆低聚糖于罗森博科技有限公司商购可得，为淡黄色粉末，易溶于水；右旋糖苷D40于罗森博科技有限公司商购可得，为白色粉末，易溶于水。其制备方法
I)按量将脱脂乳粉加热溶解，并用NaOH溶液调节pH 7. 0，然后经110°C灭菌15min,冷却至室温；2)按量将棉籽糖、大豆低聚糖和右旋糖苷D40溶解于蒸馏水中，然后于112°C灭菌12min,冷却至室温；3)按量分别称取三聚磷酸钠和没食子酸丙酯溶解于无菌生理盐水中，然后用0. 22um滤膜过滤除菌；将湿热灭菌的溶液与上述过滤除菌的溶液按量混合，即得嗜热链球菌冻干保护剂。将嗜热链球菌接种于M17培养基中，活化三次，镜检无杂菌且形态无异常后，将其按5% (v/v)的接种量接入含M17培养基中培养18h后，5000r/min离心lOmin，获得嗜热链球菌菌泥；将菌泥等体积加入上述嗜热链球菌冻干保护剂，在低温冰箱中于_40°C预冻8h，然后放入冻干机进行冷冻干燥18h，即得嗜热链球菌菌粉。经检测嗜热链球菌菌粉中冻干存 活率为54. 48%，菌粉活菌数为6. 32X 101QCfu/g。实施例2嗜热链球菌冻干保护剂的组成为脱脂乳粉13g、棉籽糖5g、大豆低聚糖5g、右旋糖苷D402. Og、三聚磷酸钠0. 4g、没食子酸丙酯0. 005g、蒸馏水100ml。其制备方法I)按量将脱脂乳粉加热溶解，并用NaOH溶液调节pH 6. 9，然后经100°C灭菌14min,冷却至室温；2)按量将棉籽糖、大豆低聚糖和右旋糖苷D40溶解于蒸馏水中，然后于100°C灭菌14min,冷却至室温；3)按量分别称取三聚磷酸钠和没食子酸丙酯溶解于无菌生理盐水中，然后用0. 22um滤膜过滤除菌；将湿热灭菌的溶液与上述过滤除菌的溶液按量混合，即得嗜热链球菌冻干保护剂。将嗜热链球菌接种于M17培养基中，活化三次，镜检无杂菌且形态无异常后，将其按5% (v/v)的接种量接入含M17培养基中培养18h后，5000r/min离心lOmin，即得嗜热链球菌菌泥，再等体积加入上述复合冻干保护剂，在低温冰箱中于-40°C预冻6h，然后放入冻干机进行冷冻干燥16h，即得嗜热链球菌菌粉，冻干存活率达到57. 48%，菌粉活菌数为
7.lX1010cfu/go实施例3嗜热链球菌冻干保护剂的组成为脱脂乳粉14g、棉籽糖4g、大豆低聚糖6g、右旋糖苷D402. 6g、三聚磷酸钠0. 6g、没食子酸丙酯0. (Hg、蒸馏水100ml。其制备方法I)按量将脱脂乳粉加热溶解，并用NaOH溶液调节pH 6. 9，然后经115 °C灭菌IOmin,冷却至室温；2)按量将棉籽糖、大豆低聚糖和右旋糖苷D40溶解于蒸馏水中，然后于115°C灭菌IOmin,冷却至室温；3)按量分别称取三聚磷酸钠和没食子酸丙酯溶解于无菌生理盐水中，然后用0. 22um滤膜过滤除菌；将湿热灭菌的溶液与上述过滤除菌的溶液按量混合，即得嗜热链球菌冻干保护剂。
将嗜热链球菌接种于M17培养基中，活化三次，镜检无杂菌且形态无异常后，将其按5% (v/v)的接种量接入含M17培养基中培养18h后，5000r/min离心lOmin，即得嗜热链球菌菌泥，再等体积加入上述复合冻干保护剂，在低温冰箱中于-40°C预冻7h，然后放入冻干机进行冷冻干燥20h，即得嗜热链球菌菌粉，冻干存活率达到60. 74%，菌粉活菌数为
7.96X10lclcfu/g。
实施例4嗜热链球菌冻干保护剂的组成为脱脂乳粉12g、棉籽糖4g、大豆低聚糖5g、右旋糖苷D402. 4g、三聚磷酸钠0. 5g、没食子酸丙酯0. 008g、蒸馏水100ml。其制备方法I)按量将脱脂乳粉加热溶解，并用NaOH溶液调节pH 6. 9，然后经110°C灭菌15min,冷却至室温；2)按量将棉籽糖、大豆低聚糖和右旋糖苷D40溶解于蒸馏水中，然后于115°C灭菌15min,冷却至室温；3)按量分别称取三聚磷酸钠和没食子酸丙酯溶解于无菌生理盐水中，然后用
0.22um滤膜过滤除菌；将湿热灭菌的溶液与上述过滤除菌的溶液按量混合，即得嗜热链球菌冻干保护剂。将嗜热链球菌接种于M17培养基中，活化三次，镜检无杂菌且形态无异常后，将其按5% (v/v)的接种量接入含M17培养基中培养18h后，5000r/min离心lOmin，即得嗜热链球菌菌泥，再等体积加入上述复合冻干保护剂，在低温冰箱中于-40°C预冻10h，然后放入冻干机进行冷冻干燥20h，即得嗜热链球菌菌粉，冻干存活率达到62. 55%，菌粉活菌数为
8.2X1010cfu/go
权利要求
1.一种嗜热链球菌冻干保护剂，其特征在于，以质量份数计，包括以下组分 脱脂乳粉10 20份、棉籽糖3 10份、大豆低聚糖4 10份、右旋糖苷D401. 5 5.0份、三聚磷酸钠0. 3 0. 8份、没食子酸丙酯0. 005 0. 02份和蒸馏水100份。
2.如权利要求I所述的嗜热链球菌冻干保护剂，其特征在于，以质量份数计，包括以下组分 脱脂乳粉10 14份、棉籽糖3 5份、大豆低聚糖4 6份、右旋糖苷D401. 5 3. 0份、三聚磷酸钠0. 3 0. 6份、没食子酸丙酯0. 005 0. 01份和蒸馏水100份。
3.一种嗜热链球菌冻干保护剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 1)以质量份数计，在蒸馏水中添加10 20份的脱脂乳粉，加热溶解后用调节pH为·6.9 7. I，灭菌，冷却至室温； 2)以质量份数计，将3 10份的棉籽糖、4 10份的大豆低聚糖和I.5 5. 0份的右旋糖苷D40溶解于蒸馏水中，灭菌，冷却至室温； 3)以质量份数计，将0.3 0. 8份的三聚磷酸钠和0. 005 0. 02份的没食子酸丙酯溶解于无菌生理盐水中，然后用滤膜过滤除菌； 4)将步骤1)、2)、3)所制备的溶液混合，并调整水的总质量份数为100份，得到嗜热链球菌冻干保护剂。
4.如权利要求3所述的嗜热链球菌冻干保护剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 1)以质量份数计，在蒸馏水中添加10 14份的脱脂乳粉，加热溶解后用调节pH为·6.9 7.1，灭菌，冷却至室温； 2)以质量份数计，将棉3 5份的籽糖、4 6份的大豆低聚糖和I.5 3. 0份的右旋糖苷D40溶解于蒸馏水中，灭菌，冷却至室温； 3)以质量份数计，将0.3 0. 6份的三聚磷酸钠和0. 005 0. 01份的没食子酸丙酯溶解于无菌生理盐水中，然后用滤膜过滤除菌； 4)将步骤1)、2)、3)所制备的溶液混合，并调整水的总质量份数为100份，得到嗜热链球菌冻干保护剂。
5.如权利要求3所述的嗜热链球菌冻干保护剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤I)、步骤2)的灭菌是在100 115°C灭菌10 15min。
6.如权利要求3所述的嗜热链球菌冻干保护剂的制备方法，其特征在于，将嗜热链球菌冻干保护剂与嗜热链球菌泥等体积混合均匀，于_40°C预冻3 12h，然后-50 -56°C冷冻干燥18 24h，得到嗜热链球菌菌粉。
全文摘要
本发明公开了一种嗜热链球菌冻干保护剂及其制备方法，以质量份数计，包括以下组分脱脂乳粉10～20份、棉籽糖3～10份、大豆低聚糖4～10份、右旋糖苷D40 1.5～5.0份、三聚磷酸钠0.3～0.8份、没食子酸丙酯0.005～0.02份、蒸馏水100份。其中大豆低聚糖和右旋糖苷D40均在罗森博科技有限公司购买。在制备菌粉的过程中加入冻干保护剂，可提高菌体的抗冷冻能力，从而提高菌粉的冻干存活率，且保藏期较长，存活率不易降低。
文档编号C12N1/20GK102952771SQ20121047049
公开日2013年3月6日 申请日期2012年11月19日 优先权日2012年11月19日
发明者陈合, 李串娜, 舒国伟, 王勇 申请人:陕西科技大学