专利名称：一种以淀粉为原料的麦芽三糖制备方法及其专用真菌α-淀粉酶的制作方法
一种以淀粉为原料的麦芽三糖制备方法及其专用真菌 α -淀粉酶技术领域
本发明一种以淀粉为原料的麦芽三糖制备方法及其专用真菌α -淀粉酶，涉及一种麦芽三糖的制备方法，属于淀粉糖制造和酶工程技术领域。
背景技术：
麦芽三糖是一种由葡萄糖单元主要通过α -1, 4-糖苷键连接形成的寡糖，在糕点等食品中添加麦芽三糖可以起到防止淀粉老化、保持水分等作用。麦芽三糖的制备方法主要分为两种，一种是以多聚麦芽三糖即普鲁兰多糖为原料，用普鲁兰酶分解获得 (ZL200910015419. 3)，由于目前普鲁兰多糖的生产成本较高，因此以此制备麦芽三糖的成本也较高；另一种是以淀粉为原料主要通过麦芽三糖淀粉酶分解而获得，由于麦芽三糖淀粉酶是一种外切型淀粉酶，因此在实际应用中，需要将淀粉用内切型淀粉酶(一般为细菌 α -淀粉酶)液化后，再用麦芽三糖淀粉酶水解[徐桂华，刘钟栋，陈肇锬.小麦淀粉制备麦芽三糖的研究.郑州工程学院学报，2002，23(3) : 1-4]。使用这一工艺必须准确控制细菌α -淀粉酶对淀粉的水解程度，如果水解程度过高获得的糊精分子量过小则会严重影响麦芽三糖的得率。由于细菌α-淀粉酶具有耐高温的特点因此在液化结束后必须以高温高压进行灭酶，生产过程需要配备相应的压力容器。麦芽三糖淀粉酶是一种外切酶其对淀粉的水解会被淀粉分子中的α -1, 6糖苷键阻挡，因此还需要使用普鲁兰酶等淀粉脱支酶以消除淀粉中α-1，6-糖苷键对麦芽三糖淀粉酶的水解作用的影响。扣囊复膜孢酵母具有分解淀粉的能力，Itoh等克隆了扣囊复膜孢酵母的α-淀粉酶基因[Itoh T, Yamashita I and Fukui S. Nucleotide sequence of the alpha-amylase gene (ALPl) in the yeast Saccharomycopsis fibuligera. FEBS Lett, 1987, 219(2): 339-342·]。以后人们对扣囊复膜孢酵母的α-淀粉酶基因(分^ )在细菌及酿酒酵母等宿主中的表达进行了研究，但未见利用重组巴斯德毕赤酵母表达5/ 基因以及重组酶水解淀粉所获得的产物中大量积累麦芽三糖的现象的报道。本发明首次以巴斯德毕赤酵母为宿主表达扣 囊复膜孢酵母的 α-淀粉酶基因，结果显示，所表达的重组酶在特定工艺条件下水解淀粉获得的糖浆中麦芽三糖含量可以达到总糖的46%_55%。这一重组酶可以直接用于淀粉的水解，水解过程不受 α-1，6-糖苷键的阻挡，只需要一种酶就可以实现淀粉到糖浆的转化。本发明公开以重组巴斯德毕赤酵母制备扣囊复膜孢酵母α-淀粉酶以及利用重组酶水解淀粉制备麦芽三糖的工艺方法。发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种以淀粉为原料制备麦芽三糖的方法，以达到简化麦芽三糖制备方法，降低生产成本的目的。
本发明提供的一种制备麦芽三糖的方法，是以多种淀粉质(玉米淀粉、红薯淀粉、 马铃薯淀粉、糯米淀粉、小麦淀粉等)为原料，经单一酶种液化并糖化，直接获得麦芽三糖含量46%-55%的糖浆，经纯化而获得。
本发明提供一种专用酶制剂SfA的制备方法。SfA是一种特殊的真菌α _淀粉酶， 是通过基因工程手段从扣囊复膜孢酵母CICIM Υ1037中获得真菌α-淀粉酶编码基因5/ , 并在酵母中实现过量表达而获得。
本发明的技术方案一种以淀粉为原料利用真菌α -淀粉酶SfA制备麦芽三糖的方法，以植物淀粉质为原料，利用真菌α -淀粉酶SfA，进行液化和糖化，获得麦芽三糖占总糖比例46%_55%的糖浆；通过活性炭吸附和酒精洗脱获得麦芽三糖占总糖比例不低于90 % 的糖浆。其具体工艺为I)淀粉的液化与糖化配制质量浓度不高于5%的淀粉乳，加热至温度80-85°C，保温10 min。上述淀粉醪液冷却至45 V，用质量浓度2%_5%的盐酸溶液调整pH至4_5，加入SfA， 加量为O. 1-0. 2 U/g干淀粉,液化与糖化同时进行,于45°C反应4-8h。得到麦芽三糖质量浓度2 %以上，麦芽三糖占总糖浓度46%-55%的糖浆。
2)麦牙二糖的提取(I)将所得麦芽三糖占总糖含量46%-55%的糖浆装入活性炭柱顶端，用水洗脱收集葡萄糖在层析玻璃柱中装入活性炭，从上部加入普通自来水至淹没活性炭。从上部流加步骤 I)获得的糖浆，·收集层析柱下方流出的液体，检测流出液体中还原糖含量，至液体中还原糖含量达到O. 2 %则说明活性炭吸附能力已经达到饱和，停止流加糖液。将活性炭柱中的液体放空。此前流出的液体中主要含葡萄糖。
(2)用4. 5%-5· O %酒精溶液洗脱收集麦芽糖关闭活性炭柱下方出口，从活性炭柱上部加入4. 5%-5. 0%的酒精溶液，至酒精溶液淹没活性炭，平衡30 min。将活性炭柱下方出口打开，将酒精溶液放出，此溶液中主要含麦芽糖。重复上述操作一次。
(3)用6. 5%-7. 5%酒精溶液洗脱收集麦芽三糖关闭活性炭柱下方出口，从活性炭柱上部加入6. 5%-7. 5%的酒精溶液，至酒精溶液淹没活性炭，平衡60 min。将活性炭柱下方出口打开，将酒精溶液放出，此溶液中含麦芽三糖， 麦芽三糖占总糖含量一般在90%以上。
(4)最后用12%的酒精溶液洗脱收集麦芽四糖及其他短链糊精关闭活性炭柱下方出口，从活性炭柱上部加入12%的酒精溶液，至酒精溶液淹没活性炭，平衡30 min。将活性炭柱下方出口打开，将酒精溶液放出，此溶液为麦芽四糖及其他短链糊精。
本发明提供的一种专用酶制剂真菌α -淀粉酶SfA的制备方法包括以下步骤 (I)以扣囊复膜孢酵母CICIM Υ1037染色体DNA为模版用PCR方法扩增获得真菌α-淀粉酶基因SfA。上述扩增片段与表达载体pPIC9K连接，获得重组质粒pPIC9K-SfA。重组质粒送上海生工生物工程公司测序，获得真菌α -淀粉酶SfA编码基因序列SEQ ID NO :1。
(2)重组质粒pPIC9K_SfA电转化表达宿主菌巴斯德毕赤酵母GS115，筛选获得重组菌/7ZcAia pas tor is GS115/pPIC9K_SfA。其分类命名为/7ZcAia pas tor is GS115/ pPIC9K-SfA，已保藏在中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号CCTCC NO M 2012440。
(3)重组菌细胞发酵，发酵液用离心等方法除去菌体，上清液即为专用酶制剂真菌 α -淀粉酶SfA0
材料和方法普通分子生物学方法除非提及，DNA操作和转化按照标准的分子生物学方法进行(Sambix)Ok等分子克隆实验手册，1989) ο
除非另外提及，PCR操作使用标准方法和PCR反应数据进行，可参见(Samtoook等分子克隆实验手册，1989)。
DNA操作所使用的酶根据供应商的说明书使用。
引物均为本专利发明人设计并由上海生工生物工程有限公司合成。
克隆载体pPIC9K和巴斯德毕赤酵母ZYcAia pas tori s GS115为Invitrogen公司女口广叩ο
大肠杆菌JM109由中国高校工业微生物资源与信息中心(http://www. cicim-cu. jiangnan. edu. cn)提供。
扣囊复膜抱酵母fibuligera")CICIM Y1037 由中国高校工业微生物资源与信息中心公开。
DNA操作使用的酶和试剂盒除非另外提及，所有DNA操作使用的酶，例如限制性内切酶，连接酶等均为大连宝生物工程有限公司产品。PCR反应使用的DNA聚合酶为大连宝生物工程有限公司产品Ex Taq,产品编号为DRR006A。所有DNA操作使用的酶、在反应时所使用的缓冲液均为购买酶时附赠， 缓冲液浓度均为反应所需浓度的10倍。柱式DNA片段回收试剂盒以及从电泳凝胶中回收 DNA片段的试剂盒均为大连宝生物工程有限公司产品，产品编号分别为DV807A和DV805A。
其他试剂马铃薯淀粉、红薯淀粉、糯米淀粉、小麦淀粉和玉米淀粉均为浙江菱湖淀粉厂产品。酵母氮基(YNB)为Difco公司0/0型酵母氮基，该产品不含碳源和氨基酸。活性炭为无锡志康环保设备有限公司生产的净水专用活性炭。
培养基LB在“Samtoook等分子克隆实验手册，1989”中描述。
酵母YEro培养基蛋白胨2%，酵母膏1%，葡萄糖2%，用盐酸调整pH至5. 5-6. O。
MD培养基酵母氮基1-2 g/L，葡萄糖2%，1. 5%琼脂粉。
MD-G418 :在MD培养基中加入抗生素G418至终浓度为5 mg/mL。
MMS-G418培养基1. 38%酵母氮基，O. 5 %甲醇，2%可溶性淀粉，G418 5 mg/mL,1. 5%琼脂粉。
碘溶液 按文献[姜锡瑞等.新编酶制剂实用技术手册.2002，北京轻工业出版社]中第398 页“稀碘液”配制。
摇瓶发酵种子培养基1%酵母浸出物，2%蛋白胨，100 mmol/L磷酸钾pH 6.0，1. 34% YNB, 4X 105% 生物素，1% 甘油。
摇瓶发酵培养基1%酵母浸出物，2%蛋白胨，100 mmol/L磷酸钾pH 6. O,1. 34%YNB，4X 105%生物素，1%甲醇。
发酵罐发酵相关培养基I)发酵基础培养基磷酸(含量85%) 2. 67% (体积比)，硫酸钙O. 93g/L，硫酸钾18.2 g/L，七水合硫酸镁14.9 g/L，氢氧化钾4.13 g/L，甘油40 g/L。用自来水定容，灭菌。
2)微量盐溶液五水合硫酸铜6.0 g/L，碘化钠0.08 g/L，一水硫酸锰3.0 g/L, 钥酸钠0.2 g/L，硼酸0.02 g/L，氯化钴0.5 g/L，硫酸锌20.0 g/L，七水硫酸亚铁65. O g/L，生物素0.2 g/L，硫酸0.5% (体积比)。用自来水定容。
3)补料培养基50% (w/v)甘油，每1000 mL中加入12 mL微量盐溶液。
4)诱导培养基100%甲醇，每升加入12 mL微量盐溶液。
淀粉酶活力测定按文献[姜锡瑞等.新编酶制剂实用技术手册.2002，北京轻工业出版社]中α-淀粉酶测定方法进行。酶活定义为一小时液化Ig淀粉所需要的酶量为一个酶活单位，表述为 I U/mL。
淀粉酶解产物HPLC分析以3%-5%淀粉为底物，按O. 1-0. 2 U/g干淀粉的量加入重组酶，45°C反应6小时。标准品为葡萄糖，麦芽糖，麦芽三糖，麦芽四糖，麦芽五糖。
分析条件色谱柱安捷伦H1-Plex Pb色谱柱流动相0. 05% (v/v)硫酸柱温 70 °C、柱压 16O. 5 mL/min，进样体积10 μ L0
本发明的有益效果本发明与已报道的制备麦芽三糖的技术相比具有以下特点1、本发明以廉价的淀粉质为原料，淀粉液化和糖化一步完成，糖化获得的糖浆中麦芽三糖在总糖中的含量达到46%-55%。从淀粉到麦芽三糖的整个制备过程具有工艺简单、生产成本低的特点。
2、本发明提供了一种扣囊复膜孢酵母来源的真菌α -淀粉酶SfA的制备方法，以淀粉为原料只使用通过该方法获得的单一酶制剂进行催化即可获得麦芽三糖占总糖含量在46%-55%的糖浆。淀粉液化和糖化只使用一种酶，不需要淀粉液化酶和脱支酶等其他酶制剂配合。
生物材料样品保藏实现真菌α -淀粉酶SfA过量表达的重组菌/7ZcAia pas tor is GSl 15/pPIC9K-SfA，其分类命名为 PicAia pas tor is GS115/pPIC9K_SfA，已保藏在中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉武汉大学，简称CCTCC，保藏编号CCTCC NO M 2012440， 保藏日期2012年11月I日。
图1 :糖标准品的HPLC分析。1、麦芽五糖；2、麦芽四糖；3、麦芽三糖；4、麦芽糖； 5、葡萄糖。
图2:真菌α -淀粉酶降解淀粉获得的糖液的HPLC分析。1、麦芽三糖；2、麦芽糖； 3、葡萄糖。
图3 :真菌α -淀粉酶降解淀粉获得的糖液的主要组分。
图4 :表达真菌α -淀粉酶SfA的重组载体pPIC9K_SfA。
图5 :重组菌PicAia pastor is GS115/pPIC9K_SfA表达SfA的蛋白电泳图谱；皿为蛋白质标准分子量，I为重组菌PicAia pas tor is GS115/pPIC9K_SfA发酵上清液，2和3均为含空质粒的重组菌Z7ZcAia pas tor is GS115/pPIC9K的发酵上清液。
具体实施方式
通过实施例对本发明作进一步说明，实施例将不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1 :麦芽三糖糖浆的制备称取10 g玉米淀粉，用自来水配置成浓度不高于5%的淀粉乳，加热至80°C，保温 IOmin0上述淀粉醪液冷却至45 V，加入浓度为5%的盐酸溶液调整pH至4. 5，加入SfA，加量为O. 15 U/g干淀粉，保温6h。如图f 3所示为所获得的淀粉水解液中糖的分析结果，其中得到的麦芽三糖约占总糖浓度52%，麦芽糖约占39%。以马铃薯淀粉、红薯淀粉、糯米淀粉和小麦淀粉为原料均获得相似结果，所获得的水解液中麦芽三糖占总糖含量在46%至55% 之间。
实施例2 :麦牙二糖的提取(I)层析玻璃柱中装入活性炭，从上部加入普通自来水至淹没活性炭。从层析柱上部流加实施例1获得的糖浆，收集层析柱下方流出的液体，检测流出液体中还原糖含量，至液体中还原糖含量达到O. 2 %则说明活性炭吸附能力已经达到饱和，停止流加糖液。将活性炭柱中的液体放空。流出溶液中主要为葡萄糖。
(2)关闭活性炭柱下方出口，从活性炭柱上部加入4. 5%-5. 0%的酒精溶液，至酒精溶液淹没活性炭，平衡30 min。将活性炭柱下方出口打开，将酒精溶液放出，此溶液中主要是葡萄糖和麦芽糖。
(3)关闭活性炭柱下方出口，从活性炭柱上部加入6. 5%-7. 5%的酒精溶液，至酒精溶液淹没活性炭，平衡60 min。将活性炭柱下方出口打开，将酒精溶液放出，此溶液中含麦芽三糖，麦芽三糖占总糖含量在90%以上。
(4)关闭活性炭柱下方出口，从活性炭柱上部加入12%的酒精溶液，至酒精溶液淹没活性炭，平衡30 min。将活性炭柱下方出口打开，将酒精溶液放出，此溶液为麦芽四糖及其他短链糊精。
实施例3表达专用真菌α -淀粉酶SfA重组酵母的构建按照文献介绍的方法[周小玲，沈微，饶志明，王正祥，诸葛健.一种快速提取真菌染色体DNA的方法.微生物学通报，2004，31(4) : 89-92]提取扣囊复膜孢酵母 (Saccharomycopsis fibuligera ) CICIM Y1037 染色体 DNA。
根据Itoh等公布的扣囊复膜孢酵母真菌α-淀粉酶基因序列[Itoh Τ, Yamashita I and Fukui S. Nucleotide sequence of the alpha-amylase gene (ALPl) in the yeast Saccharomycopsis fibuligera. FEBS Lett, 1987, 219(2): 339-342.]设计引物5’ -AATTACCGTC TAGACAACCA GTGACTCTAT TC-3’ (SEQ ID NO 2),5’ -AATTACCGTC TAGATTATGA ACAAATGTCA GAAG-3’ (SEQ ID NO :3)以上述提取的扣囊复膜孢酵母染色体DNA为模板，利用上述引物，用Ex Taq酶进行PCR 扩增得到扣囊复膜孢酵母的α-淀粉酶基因的成熟肽编码区。其中PCR扩增条件为95 V5 min ；95 V 30 S，57 V 30 S，72 V 30 s (30 个循环)；72 V 10 min。
质粒pPIC9K用Jkt II酶切，纯化，目的基因PCR产物用油a I酶切，纯化。将酶切纯化的质粒与PCR产物连接Ukt II与油a I为同尾酶)，连接物转化大肠杆菌JM109。在含氨苄青霉素的平板上筛选转化子，任选4个转化子，提取质粒后送上海生工生物工程公司测序，结果显示，其中一个转化子所含质粒为5/ 基因正确插入PPIC9K获得的重组质粒， 命名为pPIC9K-SfA。本发明获得的分^基因序列列于SEQ ID N0:1。该序列与Itoh等报道的扣囊复膜孢酵母α -淀粉酶基因有3个碱基差异，其中成熟肽编码区序列中第1135个喊基在本专利所获得的SfA基因中为G,而Itoh等提交的序列中为Α,这一差异使序列中第 379位氨基酸由Itoh报道的丝氨酸转变为甘氨酸。其他位置的碱基差异均不改变氨基酸序列。重组质粒结构如图4所示。
将上述重组质粒以核酸内切酶/^711线性化后转化表达宿主菌巴斯德毕赤酵母 GSl 15。转化方法如下接种巴斯德毕赤酵母PicAia pastor is GS115于100 mL YEI3D培养基中，培养至 0D600=1. 5，离心收集菌体并使用预冷的无菌水洗涤两次，再使用冰预冷的I M山梨醇洗涤两次。离心后使用O. 3 mL冰预冷的I M山梨醇悬浮置于冰上，作为感受态细胞备用。
提取重组质粒pPIC9K_SfA，使用汝711酶切线性化，使用DNA片段纯化试剂盒纯化酶切产物。取2-10 μ L纯化后的线性化质粒加入50 μ L感受态细胞中，冰上放置5-10min 后，使用BXT电转化仪电击，条件为7. 5 Kv, 25 mF, 10 ms。电击后立即加入I mL预冷的I M山梨醇，取200 μ L涂布MD培养基，30 °C培养至转化子出现。进行多次转化获得约2000 个以上的转化子。挑取转化子2000个并点种至MD-G418培养基，30°C培养48h，大约获得 400个可以在MD-G418培养基上生长并形成菌落的转化子。将上述转化子再分别点种到丽S-G418培养基，培养48h后在培养基上喷洒碘液，IOmin后，菌落周围出现透明圈，选取透明圈较大的100个转化子进行产真菌α-淀粉酶的摇瓶发酵试验。重组菌摇瓶发酵条件如下挑取单菌落于 30 mL的摇瓶发酵种子培养基中，200 r/min,30 °C条件下培养至 0D600 ^ 12，于5000 rpm离心5 min，收集菌体，并全部转接到30 mL的摇瓶发酵培养基中进行淀粉酶的诱导表达，期间每24 h补加O. 5%甲醇以维持诱导。并每隔I天取样检测淀粉酶酶活。其中一株在发酵5天后酶活最高，达到4. 6 U/mL。该菌株的分类命名为pas tor is GS115/pPIC9K_SfA，已保藏在中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号 CCTCC NO M 2012440。将重组菌 PicAia pas tor is GS115/pPIC9K_SfA 与含空质粒的重组 MPichia pas tor is GSl 15/pPIC9K分别进行摇瓶发酵，取上清液进行SDS-PAGE电泳检测， 结果列于图5。由图5可见，/7ZcAiaGS115/pPIC9K_SfA发酵上清液中出现一条新的分子量约为61 kDa左右的条带，相比按基因序列推测的理论分子量50 kDa偏大，这是用毕赤酵母分泌表达外源基因时经常出现的情况，一般是宿主细胞对表达的目的蛋白在分泌过程中进行了糖基化修饰的结果。SDS-PAGE电泳证明，扣囊复膜孢酵母的淀粉酶基因 SfA 在 Pichia pas tor is GS115/pP I C9K_Sf A 中得到了 高效表达。
实施例4重组真菌α -淀粉酶SfA的制备在发酵罐(德国Braun公司15L发酵罐)中装入含有4%甘油的发酵基础培养基6 L，灭菌。将灭菌后的培养基冷却至30°C，用28%氨水(未稀释的氨水)调整培养基pH至5. O。在无菌条件下每升培养基添加4. 35 mL微量盐溶液。
接种一个重组菌ZYcAia pastor is GS115/pPIC9K_SfA的单菌落于摇瓶发酵种子培养基中，于30°C，200 r/min培养24h。在无菌条件下转移O. 5 L培养液至发酵罐中。以 30°C, 200 r/min条件进行菌体培养。在O. 1-1 wm范围内调整通风量，保证溶氧在20 %以上。培养24h后以100 mL/h的速度补加补料培养基，连续补料2h。
补料培养基补加结束后再过2h开始补加诱导培养基进行诱导培养，补加速度为 20 mL/h，维持4h。随后以5-10 mL/h的速度补加诱导培养基，注意观察溶氧情况，如溶氧下降到20 %以下则应该降低补料速度。
按照上述方法进行诱导培养到72h后每隔6h取样检测淀粉酶酶活，如出现酶活下降则立即停止发酵，在所叙述的条件下，酶活最高峰一般出现在诱导培养开始后的72-120h 之间。我们一共进行了 20次试验,发酵酶活最高的一次为61 U/mL,最低的一次为50 U/ mL。按上述方法进行一次发酵大约可以获得酶液10升，总酶活在5X105 U以上，可以实现2.5-5吨淀粉的液化和糖化。
上述发酵液离心后取上清液即为重组酶SfA。
权利要求
1. 一种以淀粉为原料利用真菌α-淀粉酶SfA制备麦芽三糖的方法，其特征在于以植物淀粉质为原料，利用真菌α -淀粉酶SfA进行液化和糖化，获得麦芽三糖占总糖比例46%-55%的糖浆；通过活性炭吸附和酒精洗脱获得麦芽三糖占总糖比例不低于90 %的糖浆；其工艺为 (1)淀粉的液化和糖化配制质量浓度不超过5%的淀粉乳，加热至80-85°C，保温10min,淀粉醪液冷却至45°C，用质量浓度为2%_5 %的盐酸溶液调整pH至4_5，加入SfA，加量为O. 1-0.2 U/g干淀粉，液化与糖化同时进行，于45°C反应Γ8 h，制得麦芽三糖占总糖含量46%-55%的糖浆； (2)麦芽三糖的提取 1、将所得麦芽三糖占总糖含量46%-55%的糖浆装入活性炭柱顶端，用水洗脱收集葡萄糖在层析玻璃柱中装入活性炭，从上部加入普通自来水至淹没活性炭，从上部流加步骤(I)获得的糖浆，收集层析柱下方流出的洗脱液，检测流出的洗脱液中还原糖含量，至流出的洗脱液中还原糖含量达到O. 2 %则说明活性炭吸附能力已经达到饱和，停止流加糖浆；将活性炭柱中的液体放空，此前流出的洗脱液中主要含葡萄糖； 、用4. 5%-5. O %酒精溶液洗脱收集麦芽糖关闭活性炭柱下方出口，从活性炭柱上部加入4. 5%-5. 0%的酒精溶液，至酒精溶液淹没活性炭，平衡30min，将活性炭柱下方出口打开，将酒精溶液放出，此溶液中主要含麦芽糖，重复上述操作一次； ii1、用6.5%-7. 5%酒精溶液洗脱收集麦芽三糖关闭活性炭柱下方出口，从活性炭柱上部加入6. 5%-7. 5%的酒精溶液，至酒精溶液淹没活性炭，平衡60min，将活性炭柱下方出口打开，将酒精溶液放出，此溶液中含麦芽三糖，得麦芽三糖占总糖含量不低于90 %的糖浆； iv、最后用12%的酒精溶液洗脱收集麦芽四糖及其他短链糊精关闭活性炭柱下方出口，从活性炭柱上部加入12%的酒精溶液，至酒精溶液淹没活性炭，平衡30min，将活性炭柱下方出口打开，将酒精溶液放出，此溶液含麦芽四糖及其他短链糊精。
2.权利要求1所述方法中所用的真菌α-淀粉酶SfA的表达重组菌，其分类命名为Pichia pastor I s GS115/pPIC9K_SfA，已保藏在中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号 CCTCC NO M 2012440。
全文摘要
一种以淀粉为原料的麦芽三糖制备方法及其专用真菌α-淀粉酶，属于淀粉糖制造和酶工程技术领域。本发明以各种植物淀粉质为原料，利用真菌α-淀粉酶SfA进行液化和糖化，获得麦芽三糖占总糖比例46%-55%的糖浆；通过活性炭吸附和酒精洗脱获得麦芽三糖占总糖比例不低于90%的糖浆；本发明还提供真菌α-淀粉酶SfA的高效制备方法。真菌α-淀粉酶SfA基因来源于扣囊复膜孢酵母CICIMY2037，通过基因重组手段获得重组巴斯德毕赤酵母，用重组菌进行SfA的高效制备。用真菌α-淀粉酶SfA制备麦芽三糖的方法与现有的方法相比具有原料成本低、不依赖于淀粉液化酶和淀粉脱支酶以及工艺简单、易于放大的优点。
文档编号C12N9/30GK103014097SQ20121047118
公开日2013年4月3日 申请日期2012年11月20日 优先权日2012年11月20日
发明者沈微, 郭玉婉, 黄雯雯, 樊游, 陈献忠 申请人:江南大学