专利名称：用于生物样本核酸检测的分子内标质控方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生化检测技术及临床分子诊断领域，特别涉及一种用于生物样本核酸检测的分子内标质控方法。
背景技术：
分子生物学诞生以来，一直在分子水平上研究生物大分子的结构和功能，以揭示生命的本质。借助探索技术手段不断升级提高，分子生物学研究所取得的成果已经为人类了解生命起源、遗传进化、掌握遗传规律做出了卓越贡献。核酸作为一类生物大分子在生物遗传进化中起着举足轻重的作用，也倍受科学研究者关注。如今围绕核酸展开的研究种类繁多，所用到的研究技术手段也是日新月异，相关的核酸检测应用也已经在医疗、科研领域广泛铺开。目前，核酸相的检测在医疗领域中以疾病的临床分子诊断最具代表性，其检测快速高效、结果准确率高等优点显而易见，但由于样本量大导致操作步骤易出错、对检测本身的质控手段单一等缺点也逐渐突显出来。
医疗科学技术迅速发展，各种诊断、诊疗的方法不断推陈出新，使得临床诊断技术正在向着个体化、数字化、自动化、微量微创、准确度提升等方向发展。为了保证大批量快速检测结果的真实准确性，必须在整个临床检测过程中做好质控措施，以及时的发现并解决问题；避免因为缺少相应质控体系，得出错误的检测结果引起医疗事故。
分子诊断技术不同于以往诊疗机构所做的生化检测项目，它代表了未来医学诊断检测领域的发展方向，现阶段简单的质量控制措施很难满足分子诊断要求，诊断检测结果的真实、准确性无法得到全面保证，从而限制了分子诊断技术在临床诊断领域全面铺开和发展。
目前，国内生物相关科研机构及医院的临床诊断都具有样本量大、检测程序繁琐， 如果没有购买程控模块化自动检测仪器，则可能在核酸检测实验过程中存在较多影响结果准确率的因素，例如较为常见的影响因素有样本混淆或样本相互污染等问题。为了排除整个检测过程中的人为因素干扰等情况，现在较大型的临床诊断检测机构都已经参照美国临床和实验室标准化研究院(CLSI)MM1-A2文件中所述的步骤将质控以检测过程划分，即分析前质控、分析中质控、分析后质控，根据不同阶段的要求建立起从样本采集、分配、检测、 结果分析等较完整的质控体系；例如分析前质控步骤中对样本采集识别和验收，国内医院普遍采用的识别质控方法是条形码标识区别，即在收集样本时，针对每个个体样本分配一个条形码并做好对应记录，在检测过程中样本始终保证对应此条形码。然而，此种质控是宏观的外部质控方法，面对如今越来越多的分子层级的检测项目，仍然可能在检测过程中发生混淆污染等情况，针对样本相互区分的问题缺乏微观分子化手段，大大降低了分析前质量控制的效力，影响了整个检测过程的准确性。由此可，新的质量控制方法对于新兴的核酸检测应用及分子诊断技术重要性显而易见。
经过调查发现在样本质控过程中采用构建质控分子内标对样本进行识别的质控体系，在国内外与核酸检测相关领域尚处空白阶段。在现有的临床诊断检测领域也尚无利用分子内标对样本进行标记，通过后续实验检测内标物来区分样本及样本相互污染的质控方法。本发明为所面临的实际问题提供了一条有效的解决途径。发明内容
本发明所要解决的第一方面技术问题是克服现有与核酸检测相关领域的空白，提供一种在核酸检测样本质控过程中的，以对样本进行识别、质量监控的生物样本核酸检测的分子内标质控方法。
本发明的所要解决的第二方面技术问题，提供一种试剂盒，其含有上述分子内标序列。
为了解决现有技术中的这些问题，本发明第一方面提供的技术方案是用于生物样本核酸检测的分子内标质控方法，其特征在于，包括如下步骤(1)采集待测生物样本备用；(2)制备一条或多条有别于待测样本核酸序列的特异外源核酸序列，所述的特异外源核酸序列与待测样本的同源性不高于99%，同一批处理的不同待测样本分别与不同的特异外源核酸序列混合；(3)将上述的特异外源核酸序列加入采集后未处理的待测样本并混合均匀，做好对应记录并一起进行后续处理，完成待测样本的核酸检测分析；(4)在需要质控时，可以采用单独一个反应体系检测质控分子内标，或采用与待测样本核酸检测体系同一个体系对质控分子内标和样本同时检测，根据检测的质控分子内标的信息核对检测结果是否对应正确的待测样本。
优选地，步骤(2)中，所述特异外源核酸序列与待测样本同源性小于80%，连续 40bp碱基以上无同源性。
优选地，步骤(2)中，所述多条特异外源核酸序列彼此存在易于检测的标记或序列差异，包括如下方面多条特异外源核酸序列彼此仅在局部区域存在个别碱基差异或个别碱基插入或缺失导致的长度差异但在其余区域完全相同的核酸序列，以便于用同一对引物对不同外源核酸序列进行扩增并进行后续检测分析。
为了解决现有技术中的这些问题，本发明第二方面提供的技术方案是用于生物样本核酸检测的分子内标质控试剂盒，其特征在于，其含有特异外源核酸序列，为与待检测生物样本基因组高度非同源性的DNA序列，具有Seq. Nol所示序列。
优选地，所述特异外源核酸序列，为以Seq. Nol序列为基础定点突变标记的缺失型标记质控分子内标序列或SNP型质控分子内标序列或二者组合。
优选地，所述分子内标序列在Seq. No. I序列基础上缺失形成，包括如下所述分子内标序列缺失Seq No. I序列的429-430位碱基(CA)，其具有如Seq No. 2所示DNA序列；或者所述分子内标序列，缺失Seq No. I序列的429-432位碱基(CATC)，其具有如SeqNo. 3所示DNA序列；或者所述分子内标序列，缺失Seq No. I序列的429-434位碱基(CATCTG)，其具有如Seq No. 4所示DNA序列；或者所述分子内标序列，缺失Seq No. I序列的429-436位碱基(CATCTGTC)，其具有如 Seq No5所示DNA序列；或者所述分子内标序列，缺失Seq No. I序列的429-438位碱基(CATCTGTCAG)，其具有如Seq No. 6所示DNA序列；或者所述分子内标序列，缺失Seq No. I序列的428-439位碱基(ACATCTGTCAGC)，其具有如Seq No. 7所示DNA序列；所述分子内标序列在Seq. No. I序列基础上突变形成，包括如下在Seq No. I序列的 488位碱基由(C)突变为(A)，其具有如Seq. No. 8所示DNA序列；或者所述分子内标序列，在SeqNo.I序列的619位碱基由(A)突变为(C)Seq.No. 9所示DNA序列；或者所述分子内标序列，在SeqNo.I序列的632位碱基由(A)突变为⑴Seq.No. 10所示DNA序列；或者所述分子内标序列，在SeqNo.I序列的632位碱基由(A)突变为(C)Seq.No. 11所示DNA序列；或者所述分子内标序列，在SeqNo.I序列的733位碱基由(G)突变为⑴Seq.No. 12所示DNA序列；或者所述分子内标序列，在SeqNo.I序列的733位碱基由(G)突变为(A)Seq.No. 13所示DNA序列；或者所述分子内标序列，在SeqNo.I序列的733位碱基由(G)突变为(C)Seq.No. 14所示DNA序列。
本发明中，“分子内标”是指人工合成的一段DNA序列，有别于待测样本核酸序列的特异外源核酸序列，所述的特异外源核酸序列与待测样本的同源性小于99%，而且可在选定的位置上通过定点突变技术，改变碱基构成或让碱基缺失或个别碱基插入导致长度差异但在其余区域完全相同的核酸序列。
本发明中，“碱基缺失”是指在制备分子内标物时，在选定位置处去除该处碱基， 其它位置不变的情况。在本发明中选择了缺失2、4、6、8、10bp，也可以缺失任意碱基数，理论上只要能在后期检测中，通过核酸片段长度分析得出相互之间的差异即可达到标记目的。 但因为检测技术局限，如果两种分子内标相互只有一个碱基的差异且出现同一体系中时， 在片段长度分析时会造成信号相互干扰，难以区分。当然在符合本发明目的的基础上，还可以设计选择使用其他的碱基缺失质控分子内标序列。
本发明中，“SNP型质控分子内标序列”是指在制备分子内标物时，满足PCR条件的一段序列，SNP位点之间不要相距太近，不要设计在引物位置上即可。本发明的试剂盒中采用的就是在401bp的长度中，选了四个点进行突变，当然，在符合本发明目的的基础上， 还可以设计选择使用其他的SNP型质控分子内标序列。
本发明中，“质控系统”或”质控方法”是指针对区分核酸等样本时加入人为设计合成的带有突变或缺失标记物(标记核酸序列)，在该样本需要做识别质量控制时，可以通过核酸分子检测的方法(如测序、片段长度分析等)来识别标记物，从而达到验证样本及是否存在相互污染等情况，包括通过扩增、片段长度分析、SNP分型、多重荧光PCR、毛细管电泳、测序等常用技术即可获取内标物信息用以验证样本，简单易行地完成样本识别及验收等质控环节。
本发明中，“生物样本核酸检测”包括常规的生化实验各种操作，如各种PCR、各种电泳、SNP分型、STR分析、片段长度分析、插入缺失检测、基因拷贝数检测、基因突变检测、 测序等涉及到核酸的分子生物学检测实验本发明技术方案在总结了现有各种宏观及微观质控体系优缺点的基础上，利用DNA合成、定点突变、基因克隆等技术制备了分子内标物，并且应用于分子诊断样本标识质量控制体系中，通过片段长度分析、SNP分型、多重荧光PCR、毛细管电泳等常用技术即可获取内标物信息用·以验证样本，简单易行地完成样本识别及验收等质控环节。在保证分子诊断检测结果高准确率的前提下，以较低的成本，极大的提高了质控可靠性。预计该技术在未来分子诊断领域及临床诊断检测领域将会有广泛的应用前景。
相对于现有技术中的方案，本发明的优点是I.在生物样本核酸检测包括临床分子诊断过程中，以分子内标的形式在分子层级上标记样本，在检测过程结束后，可以通过简单的验证分子内标实验，完成样本识别及污染等质控步骤。
2.在分子层面上，建立起对样本标记、识别等质控体系，填补了国内外生物样本核酸检测包括临床诊断领域内相关质控体系的空白，为体外诊断检测建立标准化质控系统提供可选措施。
3.在检测过程中，可单独检验分子标记完成质控；也可在同一体系内同时完成样本的核酸检测实验分析和分子标记检测质控。
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述图I为应用本发明分子内标物的质控检测方法。
图2为单独检测三个不同样本缺失型分子内标物的检测结果。
图3为三个样本STR分析与分子内标物的检测结果。
图4为SNP型内标突变位点测序结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
以下将以举例形式进行说明，如有未详尽之处，可以参见常用的实验手册，如《分子克隆实验手册》以及所用试剂和仪器的厂商说明书。本发明涉及的人工序列DNA及涉及的碱基缺失、碱基突变序列等是由金唯智公司合成。
实施例I .分子内标的制备1.I原始序列的设计使用 Random DNA Sequence在线生物学软件(http://www. bioinformatics, org/sms2/ random_dna. html)设计了一段长1380bp的DNA序列，如Seq No. I所示,此序列GC含量在O. 4到O. 6之间，通过NCBI数据库基因组同源性比对后，确认在连续40bp以上无同源序列，即保证在任何生物体中都不存在所设计的此段序列。
I. 2对Seq No. I序列进行基因定点突变人工合成DNA的方法合成此段序列作为模板，利用定点突变技术改变此DNA序列特定位置的碱基以达到序列标记的作用，即在特定位置处利用定点突变技术设计6种缺失不同碱基数量(缺失2bp、4bp、6bp、8bp、10bp和12bp的标记序列)的内标和在4个不同位置碱基处设计了 SNP突变位点型内标序列备用，上述序列及包含有相应序列的内标序列由金唯智公司合成或制备。
这些标记序列序列可以通过排列组合方法加大可标记样本数量。理论上缺失型的分子内标通过排列组合，可以有64种不同组合；SNP型的内标选取2个位点的组合共有32 个不同组合；可一次性在同一批样本中标记95样。
实施例2.分子内标标记方法样本以人全血为例2.I全血样本的来源或制备医院抽血于采血管内即可，在采集后未进行任何后续操作处理；2.2缺失型分子内标序列I、II、III的制备2.3分子内标标记方法(1)按比例在三例样本原管200ul全血样本中分别加入O.05ng的缺失型分子内标I、II、III，做好样本与内标对应记录，然后进行下列DNA抽提步骤(采用QIAGEN的QIAamp DNA Mini Kit试剂盒)；(2)取20ulQIAGEN蛋白酶或者蛋白酶K加到1.5ml离心管的底部；(3)加入200ul样本(全血、血浆、血清、血沉黄层、或者溶于200ulPBS中的5X106个淋巴细胞)如果样本不足200ul,用PBS补足，QIAamp Mini spin columns会同时提取出样本中的RNA和DNA，RNA不会抑制PCR，但是可能会抑制某些酶促反应，为了除去RNA，我们可以在加buffer AL前在样本中加入4ul RNase A储存液(100mg/ml)。注意也可以在离心管中先加样本后加蛋白酶，但是要保证充分混匀；(4)加200ulbuffer AL，间歇漩涡振荡15s使裂解充分；(5)56°C水浴lOmin，延长时间并不会提高产量或质量；(6)加200ul无水乙醇，间歇漩涡振荡15s使混匀，简单离心；(7)将上述混合物小心转移到QIAampMini spin column中，不要沾湿管口，盖上盖子， 6000g (8000rpm)离心lmin，如果液体没有全部通过离心柱请增大离心力再次离心直至液体全部通过离心柱，将QIAamp Mini spin column转移到新的2ml离心管中(试剂盒提供);(8)打开盖子小心加入500ulbuffer AW1，不要沾湿管口，盖盖6000g (8000rpm)离心 lmin,将QIAamp Mini spin column转移到新的2ml离心管中(试剂盒提供)；(9)打开盖子，小心加入500ulbufferAff2,不要沾湿管口，20000g (14000rpm)离心 3min ；(10)把QIAampMini spin column转移到新的2ml离心管(自备)中全速离心lmin以除去可能残留的buffer Aff2(11)将QIAampMini spin column转移到新的I. 5ml离心管(自备)中，小心打开管盖，加入200ul buffer AE或者蒸懼水,室温孵育lmin,6000g (8000rpm)离心lmin。其中， a.加入buffer AE或者蒸懼水后室温孵育时间延长至5min可以提高DNA产量；b.可使用另外200ul buffer AE或者蒸馏水进行第二次洗脱可以增加最多15%的DNA产量；c. I. 5ml 离心管中洗脱时单次洗脱体积不得多于200ul，否则离心管底会接触到洗脱后的液体，这可能会产生雾气；d.使用少于200ul的洗脱液会显著提高获得的DNA浓度，同时稍微降低DNA 产量，如果预期DNA产量少于lug，建议使用50ul的洗脱液进行洗脱；e.每次使用IOOul 洗脱液洗脱两次和使用200ul洗脱液洗脱一次相比并不能提高DNA产量。
所抽提到的DNA可用于核酸检测实验。
实施例3.独立内标质控检测在需要对样本中内标进行单独检测时，取Iul样本，进行PCR反应，反应总体积为10 微升(IyL IOX PCR缓冲液(Qiagen公司)，0.2yL 25mmol氯化镁、I μ L检测内标引物、 O. 8 μ L 2. 5mmol dNTP>0. 04 μ L HotStarplus Taq 酶(Qiagen 公司)，5· 96 μ L ddH20)。PCR 反应条件设置如下95° ClO分钟；7个循环的Touchdown程序(94° C 20秒，65°C-I 40 秒和 72。C 2min), 28 个循环扩增(94° C 20 秒，63°C 30 秒和 72。C2min)，在 72。C 延伸2分钟；缺失型内标引物序列如Seq No. 16. 17所示IMMLABF 5/ -TTTTATCATGGCGCCCTCACTT-3'，IMMLABR5' - CCTTAGCGAAGGGCGTAGGAGT -3'。
PCR反应完成后，将PCR扩增产物稀释20倍，取出Iul加入8. 9ul HIDI和O. Iul LIZ,混匀后95°C 5min，毛细管电泳上样；因所用检测内标引物带有荧光，通过毛细管电泳分离不同长度的扩增片断，以荧光检测系统分析结果得出分子内标信息(如图2所示)，即可与原记录对比，完成质控。
实施例4.样本与分子内标同一体系中同时检测(以三个样本STR检测为例) 同样使用对应的检测缺失型内标引物与样本微卫星分析PCR荧光引物按比例混合制成引物Mix。取Iul样本，进行PCR反应，反应总体积为10微升(I μ L IOX PCR缓冲液(Qiagen 公司)，0· 2μ L 25mmol 氯化镁、I μ L 引物 Mix、0. 8 μ L 2. 5mmol dNTP.O. 04 μ L HotStarplus Taq 酶(Qiagen 公司)，5· 96 μ L ddH20)。PCR 反应条件设置如下:95。ClO 分钟-J个循环的Touchdown程序(94° C 20秒，65°C -I 40秒和72° C 2min), 28个循环扩增(94° C 20秒，63°C 30秒和72° C2min)，在72° C延伸2分钟；缺失型内标引物序列为 IMMLABF 5' -TTTTATCATGGCGCCCTCACTT-3'，IMMLABR: 5' - CCTTAGCGAAGGGCGTAGGAGT -3/ 。
PCR反应完成后，将多重PCR产物稀释20倍后取Iul加入8. 9ul Hi-Di和0. Iul LIZ500的Mix中，混匀后95°C 5min变性后上测序仪进行荧光毛细管电泳。
通过电泳分离不同长度片段后，荧光检测系统分析实验结果，除样本实验数据外， 还可同时得到内标物信息，与原加入内标记录对比即可完成质控；如图3所示的三个样本STR分析与分子内标同时检测的结果。
表一三个样本STR信息
权利要求
1.用于生物样本核酸检测的分子内标质控方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)采集待测生物样本备用； (2)制备一条或多条有别于待测样本核酸序列的特异外源核酸序列，所述的特异外源核酸序列与待测样本的同源性不高于99%，同一批处理的不同待测样本分别与不同的特异外源核酸序列混合； (3)将上述的特异外源核酸序列加入采集后未处理的待测样本并混合均匀，做好对应记录并一起进行后续处理，完成待测样本的核酸检测分析； (4)在需要质控时，可以采用单独一个反应体系检测质控分子内标，或采用与待测样本核酸检测体系同一个体系对质控分子内标和样本同时检测，根据检测的质控分子内标的信息核对检测结果是否对应正确的待测样本。
2.根据权利要求I中所述的分子内标质控方法，其特征在于，步骤(2)中，所述特异外源核酸序列与待测样本同源性小于80%，连续40bp碱基以上无同源性。
3.根据权利要求I中所述的分子内标质控方法，其特征在于，步骤(2)中，所述多条特异外源核酸序列彼此存在易于检测的标记或序列差异，包括如下方面多条特异外源核酸序列彼此仅在局部区域存在个别碱基差异或个别碱基插入或缺失导致的长度差异但在其余区域完全相同的核酸序列，以便于用同一对引物对不同外源核酸序列进行扩增并进行后续检测分析。
4.用于生物样本核酸检测的分子内标质控试剂盒，其特征在于，其含有特异外源核酸序列，为与待检测生物样本基因组闻度非同源性的DNA序列，具有Seq. Nol所不序列。
5.根据权利要求4中所述的分子内标质控试剂盒，其特征在于，所述特异外源核酸序列，为以Seq. Nol序列为基础定点突变标记的缺失型标记质控分子内标序列或SNP型质控分子内标序列或二者组合。
6.根据权利要求5中所述的分子内标质控试剂盒，其特征在于，所述分子内标序列在Seq. No. I序列基础上缺失形成，包括如下 所述分子内标序列缺失Seq No. I序列的429-430位碱基(CA)，其具有如Seq No. 2所示DNA序列； 或者所述分子内标序列，缺失Seq No. I序列的429-432位碱基(CATC)，其具有如SeqNo. 3所示DNA序列； 或者所述分子内标序列，缺失Seq No. I序列的429-434位碱基(CATCTG)，其具有如SeqNo. 4所示DNA序列； 或者所述分子内标序列，缺失Seq No. I序列的429-436位碱基(CATCTGTC)，其具有如Seq No5所示DNA序列； 或者所述分子内标序列，缺失Seq No. I序列的429-438位碱基(CATCTGTCAG)，其具有如Seq No. 6所示DNA序列； 或者所述分子内标序列，缺失Seq No. I序列的428-439位碱基(ACATCTGTCAGC)，其具有如Seq No. 7所示DNA序列； 所述分子内标序列在Seq. No. I序列基础上突变形成，包括如下在Seq No. I序列的·488位碱基由(C)突变为(A)，其具有如Seq. No. 8所示DNA序列； 或者所述分子内标序列，在Seq No. I序列的619位碱基由(A)突变为(C)，其具有如Seq. No. 9所示DNA序列； 或者所述分子内标序列，在SeqNo. I序列的632位碱基由(A)突变为(T)，其具有如Seq. No. 10 所示 DNA 序列； 或者所述分子内标序列，在SeqNo. I序列的632位碱基由(A)突变为(C)，其具有如Seq. No. 11 所示 DNA 序列； 或者所述分子内标序列·，在SeqNo. I序列的733位碱基由(G)突变为(T)，其具有如Seq. No. 12 所示 DNA 序列； 或者所述分子内标序列，在SeqNo. I序列的733位碱基由(G)突变为(A)，其具有如Seq. No. 13 所示 DNA 序列； 或者所述分子内标序列，在SeqNo. I序列的733位碱基由(G)突变为(C)，其具有如Seq. No. 14 所示 DNA 序列。
全文摘要
本发明所要解决的问题在于提供一种用于生物样本核酸检测的分子内标质控方法及试剂盒以对样本进行识别、检测分析等质量监控，质控分子内标是一类区别于待测样本的核酸序列的特异外源核酸序列，其与待测样本的同源性不高于99%，将上述的特异外源核酸序列与待测样本混合均匀，做好对应记录并一起进行后续处理。本发明利用DNA合成、定点突变、基因克隆等技术制备了质控分子内标，并且应用于生物样本核酸检测的标识质量控制体系中，通过扩增、片段长度分析、SNP分型、多重荧光PCR、毛细管电泳、测序等常用技术即可获取质控分子内标信息用以验证样本，简单易行地完成样本识别及验收等质控环节。
文档编号C12Q1/68GK102978283SQ20121047188
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月20日 优先权日2012年11月20日
发明者姜正文, 李才华, 张希 申请人:天昊生物医药科技(苏州)有限公司