专利名称：一种从神秘果中提取天然抗氧化物质的方法
技术领域：
本发明属于天然物质的提取领域，特别涉及一种从神秘果中提取天然抗氧化物质的方法。
背景技术：
神秘果属山榄科神秘属，为常绿灌木，原产西非，分布在西非至刚果一带，在印度尼西亚的丛林中也有发现。20世纪60年代引入后在我国海南、广东、广西、福建种植，神秘果是一种国宝级植物，不管是在西非还是我国，都受到保护，禁止出口。神秘果树生长在西非热带地区，其果实为椭圆形，成熟果皮呈鲜红色，肉薄，乳白色，味微甜。此外，神秘果果肉中含有神秘素，能改变味觉，当地居民常常用它来调节食物的 味道，它能使酸面包变得甜而可口，使酸味的棕榈酒和啤酒变甜；吃过酸、辣、苦、咸的食物之后，嚼上几口神秘果，立刻变成甜的味道。奇异的神秘果不愧为是一种通用性变味觉的果实，这是一种天然、物理性而安全的变化，因而神秘果适合作为日常食品食用。神秘果可鲜食，也可制成酸性食品的助食剂，制成糖尿病人需要的甜味的变味剂。在食品工业上，人们常将神秘果用作调味剂。果肉含有丰富奇特的醣蛋白、维生素C、KI、柠檬酸、琥珀酸、草酸等，种子含有天然固醇等，常生吃熟果或浓缩锭剂具有调节高血糖、高血压、高血脂、痛风、尿酸、头痛等，达正常值稳定作用之功效。果汁涂抹于蚊虫叮咬处能消炎消肿。种子可解心绞痛、喉咙痛、痔疮等。然而，虽然对果实的变味机理做了很多研究，但对其生物活性物质的提取和功能研究未有报道。
发明内容
为了弥补有关神秘果中活性物质的成分、提取及抗氧化活性研究的空白，本发明提供了一种从神秘果中提取天然抗氧化物质的方法，该方法可获得神秘果中的天然抗氧化活性物质，同时大大提高了提取物中抗氧化物质的含量，高效浓缩了神秘果中的抗氧化活性物质。根据本发明的一个实施方式，提供了一种从神秘果中提取天然抗氧化物质的方法，包括以粉碎后的神秘果果肉为原料，以色谱级乙醇为溶剂，进行超声波水浴浸提，得到乙醇提取液；所述乙醇提取液经离心分离后得到上清液；重复所述浸提和所述离心分离至少I次，并且合并得到的上清液；合并后的所述上清液用非极性的硅胶基质吸附剂吸附分离，并用70 80v/v%的乙醇水溶液进行洗脱，收集洗脱液；将所述洗脱液蒸馏得到天然抗氧化物质溶液；将所述天然抗氧化物质溶液经真空干燥得到固体状天然抗氧化物质；其中，所述超声波水浴浸提的超声时间为15 30min ;所述神秘果果肉和所述色谱级乙醇的用量比为每克果肉使用6 12ml的所述色谱级乙醇；所述硅胶基质吸附剂为C18十八烷基固相萃取柱，且所述上清液的流速为5±0. 5ml/min ;所述真空干燥的温度为45±2°C。根据另一实施方式，所述超声波水浴温度为45 65°C。
根据又一实施方式，合并后的所述上清液的吸附分离和洗脱步骤在2 4°C的低温避光条件下进行。根据上述本发明的提取方法，以乙醇为溶剂，采用超声波辅助提取，提取时间短，操作简单，所获得的产品中抗氧化物质含量高，且抗氧化能力强。由上述方法提取的高浓度抗氧化物质可用于开发高含量的新型天然神秘果抗氧化剂，来达到保健功能，并可作为食品改酸，涩味变甜的天然添加剂，实现神秘果高附加值综合利用。
图I是260nm波长下检测的标准的酚类物质的HPLC色谱图。图2是370nm波长下检测的根据本发明的方法提取的目标产物中多酚物质的HPLC色谱图。 图3是神秘果果肉中叶黄素的HPLC色谱图。
具体实施例方式根据本发明的各实施方式，提供一种从神秘果中提取天然抗氧化物质的方法，具体如下(I)粉碎将洗干净的神秘果果肉用研钵磨碎或打浆机打碎呈果浆状；(2)提取以色谱级乙醇(即纯度95%以上)为溶剂，采用超声波水浴浸提，其中果肉与色谱级乙醇的用量比为每Ig果肉使用6 12ml的色谱级乙醇，控制水浴温度为45 65°C，超声时间15 30min，得乙醇提取液；(3)离心分离提取液经离心机在转速5000±100rpm下离心30±lmin，分离出上
清液，弃去沉淀物；(4)重复以上提取和离心步骤至少I次，并合并所得上清液；(5)吸附分离将上述上清液通过预先经净化处理的非极性的C18十八烷基固相萃取柱，流速5±0. 5mL/min，吸附后用纯净水洗柱，再用体积比为70 80% v/v的乙醇水溶液以5±0. 5ml/min的流速洗脱，收集洗脱液；(6)脱溶剂在常压(LOlXlO5Pa)下从洗脱液中蒸出乙醇得天然抗氧化物质溶液；(7)真空干燥将天然抗氧化物质溶液经冷却后在真空下进行脱水干燥，即得粉状天然抗氧化活性物质，其中真空干燥的温度为45 ± 2 °C。其中，以上吸附分离和洗脱步骤在避光低温(2 4°C )条件下操作。以下，将参照图I至3对本发明涉及的从神秘果中提取天然抗氧化物质的方法进行更详细地说明。实施例I(I)将干净并粉碎的神秘果果肉2g和色谱级乙醇12ml置于有盖的玻璃试管中，用漩涡仪混匀，然后进行超声波水浴浸提，控制超声波水浴温度为65°C，超声时间为30min，得乙醇提取液；(2)将乙醇提取液冷却后经离心机离心分离，设置离心机转速为5000rpm，离心30min,分离出上清液；(3)重复一次上述浸提和离心分离步骤，合并上清液；(4)将上述合并的上清液以5ml/min的流速加至已经过处理的C18十八烷基固相萃取柱，之后用纯净水洗柱，再用7(^八％的乙醇水溶液以5±0. 5ml/min的流速洗脱，且合并洗脱液。所有的操作在4°C低温避光下进行；(4)在常压下(I. OlXlO5Pa)蒸出上述洗脱液中的乙醇，得到天然抗氧化活性物质溶液；(5)真空干燥将天然抗氧化物质溶液经冷却后在真空下于45°C进行脱水干燥，即得粉状天然抗氧化活性物质O. 138g，得率6. 9%。实施例2 (I)将干净并粉碎的神秘果果肉2g和色谱级乙醇18ml置于有盖的玻璃试管中，漩涡仪混匀，然后进行超声波水浴提取，控制超声波水浴温度为45°C，超声时间为15min，得乙醇提取液；(2)将提取液冷却后经离心机离心分离，设置离心机转速为5000rpm，离心30min，
分离出上清液；(3)重复一次上述浸提和离心分离步骤，合并上清液；(4)将上述合并的上清液以5ml/min的流速加至已经过处理的C18十八烷基固相萃取柱，之后用纯净水洗柱，再用80v/v%的乙醇水溶液洗脱，合并洗脱液。所有的操作在
2°C低温避光下进行；(5)在常压下(I. 01 X IO5Pa)下从洗脱液中蒸出乙醇得到天然抗氧化物质溶液；(6)真空干燥将天然抗氧化物质溶液经冷却后在真空下进行脱水干燥，即得粉状天然抗氧化活性物质O. 130g，得率6. 5%。将以上两个实施例得到的固体天然抗氧化物质进行混合后作为目标产物，并对其测定多酚含量及抗氧化能力。试验例I :目标产物中多酚的组成和含量分析采用高效液相色谱法测定了上述目标产物中的多酚组成。其中，高效液相色谱(HPLC)条件为Supelco (Bellefonte, PA) Discovery C18 十八烧基固相萃取柱,柱温 35°C ；Waters2690 分离器单元；Water996光电二极管检测器；Waters Millennium 32 色谱管理软件；流动相为乙腈和10%乙酸水溶液的混合液，流速为O. 8ml/min，采用梯度洗脱；检测波长为370nm和260nm。同时在相同的色谱条件下绘制维生素C、没食子酸、儿茶酸、表儿茶酸、鞣花酸、芦丁、杨梅酮、槲皮素、山萘酚等标准样品的标准曲线，从而定性和定量确定其中的多酚组分和含量。先用HPLC分析多酚物质的标准样品，如图I所示，在260nm波长下检测的标准的多酚物质的HPLC色谱图如下I、维生素C 2、没食子酸3、儿茶酸4、表儿茶酸5、鞣花酸
6、芦丁 7、杨梅酮8、槲皮素9、山萘酚。目标产物中多酚物质经上述乙酸-乙腈体系分离后得到的HPLC图谱(图2)，再通过与先用HPLC分析多酚物质的标准样品(图I)比较，通过标准样品的分离时间和最大吸收确定目标产物中的主要成分。如图2所示，在370nm波长下检测的目标产物中多酚物质的HPLC色谱图I、维生素C 2、没食子酸3、表儿茶酸4、鞣花酸5、芦丁 6、杨梅酮7、槲皮素8、山萘酚。图3是目标产物中叶黄素的HPLC色谱图。对以上色谱分析结果进行定量，并换算为各组分基于每克神秘果果肉的含量示于表I中。 表I神秘果果肉中的多酚含量
序号物质名称含量(pg/g鲜重)
1维生素C2892
2没食子酸106
3儿茶酸162.7
4表儿茶酸171.85鞣花酸3.8
6芦丁28.37
7杨梅酮8.3
8榭皮素10.5
9山萘酚3.0
10叶黄素3.5试验例2 :目标产物中总酚含量的测定以儿茶酸(catechin,Sigma 公司)为对照物,采用 Folin-Ciocalteu 试剂(Sigma公司，美国)来分析本发明目标产物中的总酚含量。取O. Iml目标产物的乙醇溶液(目标产物浓度为O. 05g/l)，与7. 5ml的Folin-Ciocalteu试剂(稀释10倍)在25°C下避光反应5min,然后加入O. 75ml的碳酸氢钠溶液^Og/l)。之后再在25°C恒温水浴中反应90min，然后用O. 45 μ m的注射器式过滤器过滤。所得滤液用分光光度计(SpectraMax Plus384,美国Molecular Devices公司)于750nm处测得吸光度值。目标产物的总酚含量用达到相同量的儿茶酸的量(μ gCE/g)来表
/Jn ο测定结果总酚含量2470μ g CE/g以上结果数据表明目标产物具有很高的总酚含量。
试验例3 目标产物对自由基的清除能力测定以二苯基-苦基-肼基自由基(DPPH，美国Sigma公司)为标准物，用DPPH清除自由基能力的方法来测定上述目标产物的抗氧化能力。取2ml的DPPH溶液(浓度为O. 025mg/ml)，与50、100、150 μ I的目标产物(浓度为2mg/ml)混合,在25°C恒温下避光反应30min。在λ = 515nm处测定吸光度值。实际结果以达到相同抗氧化能力的Trolox的量(μπιο TE/g)来表示。测定结果总抗氧化能力74·06 μ mol TE/g以上结果数据表明目标产物具有很强的抗氧化能力。 综上所述，由根据本发明的提取方法制得的天然抗氧化物质可用于保健品或食品添加剂。
权利要求
1.一种从神秘果中提取天然抗氧化物质的方法，其特征在于，所述方法包括 以粉碎后的神秘果果肉为原料，以色谱级乙醇为溶剂，进行超声波水浴浸提，得到乙醇提取液； 所述乙醇提取液经离心分离后得到上清液； 重复所述浸提和所述离心分离至少I次，并且合并得到的上清液； 合并后的所述上清液用非极性的硅胶基质吸附剂吸附分离，并用70 80v/v%的乙醇水溶液进行洗脱，收集洗脱液； 将所述洗脱液蒸馏得到天然抗氧化物质溶液； 将所述天然抗氧化物质溶液经真空干燥得到固体状天然抗氧化物质； 其中，所述超声波水浴浸提的超声时间为15 30min ;所述神秘果果肉和所述色谱级乙醇的用量比为每克果肉使用6 12ml的所述色谱级乙醇；所述硅胶基质吸附剂为C18十八烷基固相萃取柱，且所述上清液的流速为5±0. 5ml/min ;所述真空干燥的温度为45±2°C。
2.根据权利要求I所述的从神秘果中提取天然抗氧化物质的方法，其特征在于所述超声波水浴的温度为45 65°C。
3.根据权利要求I或2所述的从神秘果中提取天然抗氧化物质的方法，其特征在于合并后的所述上清液的吸附分离和洗脱步骤在2 4°C的低温避光条件下进行。
4.根据权利要求I或2所述的从神秘果中提取天然抗氧化物质的方法，其特征在于在用乙醇水溶液进行洗脱之前先用纯净水洗脱。
全文摘要
本发明公开了一种从神秘果中提取天然抗氧化物质的方法，包括以粉碎后的神秘果果肉为原料，以色谱级乙醇为溶剂，采用超声波水浴浸提，得到乙醇提取液；所述乙醇提取液经离心分离后得到上清液；重复所述浸提和离心分离步骤至少1次，并合并所述上清液；合并的所述上清液用非极性的硅胶基质吸附剂吸附分离，并用乙醇水溶液进行洗脱并收集洗脱液；将所述洗脱液蒸馏得到天然抗氧化物质溶液；所述天然抗氧化物溶液经真空干燥得到固体天然抗氧化物质。本发明的提取方法步骤简单，且提取出的天然抗氧化物质具有很强的抗氧化生物活性功能，具有广泛的应用前景。
文档编号A23L1/223GK102960734SQ20121047197
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月20日 优先权日2012年11月20日
发明者张秀梅, 徐志民, 杜丽清, 刘胜辉, 孙光明 申请人:中国热带农业科学院南亚热带作物研究所