专利名称：两步酶促法制备结合态熊去氧胆酸的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种7 α -羟基类固醇脱氢酶(7 a -HSDH)和 羟基类固醇脱氢酶(7i3-HSDH)联用，两步法催化结合态鹅去氧胆酸转化为结合态熊
去氧胆酸的方法。
背景技术：
熊胆是名贵的中药材，用于治疗胆结石疾病以及各种急性、慢性肝病，具有良好的治疗效果。牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)是中药材熊胆的主要有效成份之一。然而，中药熊胆粉主要的获取方式为“活熊引流取胆”，这有违野生动物保护法，并且被认为是非常不“人道” 的获取方式。不过禽畜胆汁中存在众多胆酸类物质，尤其是鸡鸭鹅胆汁中含有丰富的牛磺鹅去氧胆酸(T⑶CA)。T⑶CA与TUDCA的差别不仅在于7位羟基的差向异构，而且它们的生物活性也相差甚远。目前TUDCA除可以从熊胆中提取外，其制备的方法还有化学合成法和生物转化法。化学合成牛磺熊去氧胆酸，国内外报道主要有三种化学半合成法①用熊去氧胆酸(UDCA)与氯甲酸乙酯或特戊酰氯反应形成混合酸酐，在碱性条件下与牛磺酸反应，再经离子交换柱纯化制得TUDCA，总收率约62%[Arosio R, Rossetti V. US5565587.1995-10-15. (CA1994, 122:265776);Dayal B, et al. Bioorg Med Chem, 1996, 4]；②UDCA和牛磺酸在碱性条件下分别在N-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2- 二氢喹啉(EEDQ，N-ethoxy-carbonyl-ethoxy-1, 2-dihydroquinoline)或氰基憐酸二乙酉旨(DEPC, diethylphosphorocyanidate)作用下直接缩合得TUDCA,收率分别为67%和90%,此法试剂价格昂贵[Momose T, et al. Lipids, 1997,32] ;@UDCA和氯甲酸乙酯形成混合酸酐后，与对轻基苯丙酮缩合，得熊去氧胆酸的活性酚酯，再与牛磺酸反应制得TUDCA，总收率约64%，此法反应步骤较多[Bonaldi A and Molinari E. US, 5362891. 1994-11]。比较三种合成方法，后两种需用有机试剂EEDQ和DEPC，价格昂贵，制备也较烦琐。上述合成中的原料UDCA，也主要是通过化学合成的方法得到。比如，工业上生产UDCA的7步合成法，以牛、羊胆酸(CA)为原料，经胆酸甲酯化，二乙酰化，12位羟基CrO3-HOAc氧化，黄鸣龙还原合成鹅去氧胆酸(⑶CA)，再将⑶CA氧化成7-羰基石胆酸(7-KLCA)，然后在正丙醇中用金属钠还原得UDCA。另外，以鹅去氧胆酸(⑶CA)为原料，⑶CA甲酯化，3位羟基选择性保护后用Jones试剂或NBS氧化7位羟基，然后在叔丁醇中用金属钠、二氯化镍还原得UDCA[庄治平，等·有机化学，1986，(4) :281]。上述描述的化学合成法制备牛磺熊去氧胆酸的过程复杂，要使用大量有机溶剂，存在有机溶剂残留等缺点。这些化学合成法的最大缺点是只能在有机溶剂中进行，且所用的底物是单体纯物质，无法对混合状态存在的胆汁酸(如禽畜胆汁中的TCDCA或CDCA)进行原位转化而不影响其他成分。生物转化也分微生物转化和酶催化法。熊安明和法幼华采用泡木贼镰刀菌将石胆酸转化为M)CA[熊安明和法幼华.微生物学报，1995，35:204-208]。刘光泽等利用不和谐梭菌(C. absonum)将水解鸡胆汁(不含结合态胆汁酸T⑶CA)中的⑶CA转化成为UDCA [刘光泽等，中国兽医学报，1998，18:74-76]，但微生物本身的代谢会产生多种物质，也给水解鸡胆汁引入了很多杂质，使产物的纯化更加困难，且操作复杂，效率较低。Ferrandi EE 等米用来自撒丁岛梭菌(Clostridium sardiniense, ATCC27555)的7 α -羟基类固醇脱氢酶能催化⑶CA转化成7-羰基石胆酸(7-KLCA)，另外发现7 β -羟基类固醇脱氢酶能催化 7-KLCA 转化成 UDCA [Ferrandi EE, et al. Appl MicrobiolBiotechnol 2012，95 (5) : 1221-1233]，但没有报道以纯CDCA作为底物，在这两个酶的作用下连续催化直接转化成UDCA。Pedrini P等采用来自嗜麦芽窄食单胞菌(Xanthomonasmaltophilia, CBS 897. 97)的7 α -羟基类固醇脱氢酶和7 β -羟基类固醇脱氢酶能将 CDCA 转化成 UDCA[Pedrini P et al. Steroids, 2006，71:189 - 198], Tanaka N 等采用来自大肠杆菌(Escherichia coli)的7 α -轻基类固醇脱氢酶能将甘氨鹅去氧胆酸(GCDCA)催化成 7_ 擬基-甘氨鹅去氧胆酸(7-oxo-GCDCA) [Tanaka N, et al. Biochemistry1996，35:7715-7730]。
上述生物转化法主要是将游离态的CDCA催化转化为游离态的UDCA，没有提到将T⑶CA (或G⑶CA)转化为TUDCA (或GUDCA)。而且游离态的⑶CA和UDCA的水溶性差，不利于生物转化在水溶液中进行，而且第一步反应完成后需要处理，再进行第二步反应，反应比较麻烦，后处理多。综上所述，TUDCA主要是以UDCA、CA或⑶CA为原料通过化学合成法来制备。目前为止还没有文献报道在动物体外采用生物转化方法将结合态鹅去氧胆酸(TCDCA和GCDCA)转化成结合态熊去氧胆酸(TUDCA和⑶DCA)。另外将禽畜胆汁中的T⑶CA原位转化为TUDCA的方法也未见报道。这是因为动物体内的TCDCA转化成TUDCA的过程相当复杂，体外很难模拟。在动物体内T⑶CA转化成TUDCA要依赖于体内的胆汁酸肝肠循环过程，主要包括以下5个步骤(见下式)
权利要求
1.两步酶促法制备结合态熊去氧胆酸的方法，包括如下步骤(I)在7α -羟基类固醇脱氢酶和氧化型辅酶NAD+或NADP+存在的条件下将溶于水溶液中的底物结合态鹅去氧胆酸的7位α -羟基氧化成羰基，形成中间产物结合态7-羰基-石胆酸；(2)在步骤(I)反应后的混合物中，向混合物中加入7 β -羟基类固醇脱氢酶和还原型辅酶NADH或NADPH，将中间产物7位羰基还原成β-羟基得到结合态熊去氧胆酸。
2.根据权利要求1所述的方法，所述的水溶液的pH值为7-9。
3.根据权利要求1所述的方法，所述的水溶液为PH8.5磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求1所述的方法，所述步骤(1)、(2)的反应温度为30°C，反应时间为1-3 小时。
5.根据权利要求1所述的方法，所述的结合态鹅去氧胆酸包括牛磺鹅去氧胆酸见式 (I )、甘氨鹅去氧胆酸见式(2);结合态熊去氧胆酸包括牛磺熊去氧胆酸见式(3)、甘氨熊去氧胆酸见式(4)。
6.根据权利要求1所述的方法，所述的7a -HSDH和7 β -HSDH转化的底物是以单体形式存在或者以天然混合物状态存在。
7.根据权利要求1所述的方法，所述的天然混合物状态包括禽畜胆汁。
8.根据权利要求7所述的方法，禽畜胆汁包括鸡、鸭、鹅、牛、狗、兔、羊的胆汁。
9.根据权利要求1所述的方法，所述的7α -羟基类固醇脱氢酶和7 β -羟基类固醇脱氢酶来自于微生物。
10.根据权利要求1所述的方法，所述7α-羟基类固醇脱氢酶来自撒丁岛梭菌(Clostridium sardiniense, ATCC27555)和脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis ATCC25825);所述7 β -轻基类固醇脱氧酶来自撒丁岛梭菌(Clostridium sardiniense, ATCC27555)和产气柯林斯菌(Collinsella aerofaciens，ATCC25986)。
11.根据权利要求1所述的方法，所述的7a -HSDH和7β -HSDH是在非致病微生物中的表达产物。
12.根据权利要求1所述的方法，所述非致病微生物为大肠杆菌。
全文摘要
本发明涉及两步酶促法制备结合态熊去氧胆酸的方法，属于生物技术领域。本发明在水溶液状态下，能在7α-HSDH和7β-HSDH存在下转化底物结合态鹅去氧胆酸为结合态熊去氧胆酸，而且中间步骤不需要分离，非常简单，而且转化率非常高。特别是作为混合物状态的鸡胆汁，鸭胆汁或鹅胆汁，不需要将结合态鹅去氧胆酸分离纯化就能发生反应，该制备工艺简单，易行，为结合态熊去氧胆酸原料提供了新的简便的制备方法。
文档编号C12P33/00GK102994604SQ20121047348
公开日2013年3月27日 申请日期2012年11月21日 优先权日2012年11月21日
发明者王伯初, 谭君, 娄德帅, 祝连彩, 刘绍勇, 岑小惜, 季庆治 申请人:上海凯宝药业股份有限公司