专利名称：用于检测黄瓜疫霉的lamp引物及含有该引物的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及黄瓜疫霉的检测，具体地说，涉及用于检测黄瓜疫霉的LAMP引物及含有该引物的试剂盒。
背景技术：
植物病原卵菌是一类重要的植物病原菌，可侵染危害多种植物，导致多种植物的毁灭性病害，如致病疫霉(Phytophthora infestans)、辣椒疫霉(P. capsici )、大豆疫霉(P. sojae)、寄生疫霉(P. parasitic)、樟疫霉(P. cinnamomi)及冬生疫霉(P. hibemalis)分别引起马铃薯、辣椒、大豆、烟草、樟树及柑橘的重要疫病，严重年份乃至绝产。该类病菌主要以菌丝体或卵孢子在病残体或土壤中渡过不良环境而作为初侵染源，在适宜条件下，菌丝体或卵孢子均可萌发产生孢子囊-释放游动孢子，再借助雨水或气流进行传播、侵染而导致植物病害。因此，对该类病菌的初侵源或侵染寄主早期进行适时监控，利于控制病害的 发生，传统的病害防控策略主要依靠品种、栽培、化防和生态调控等防治措施，这些防控措施主要在病害爆发乃至产生明显危害时才实施，忽视了对初侵染源或侵染寄主早期适时采取综合防控和高效治理措施，因而事倍功半，防效甚微，最终很难控制病害的发生与流行。黄瓜疫霉(P. melonis)是我国乃至亚洲常见黄瓜病害种类，多在温室等低温高湿低光照环境下侵染黄瓜(Cucumis sativus),造成黄瓜根腐病，导致生产损失，此病还在台湾地区、日本和韩国等地也均有报道。此外，黄瓜疫霉在亚洲地区也有侵染西瓜(CitrullusIanatus,韩国)、香瓜(Cucumis melo,韩国和日本)开心果(Pistacia vera,伊朗)、异株括楼(Trichosanthes dioica,印度)等多种作物的报道。因此，它是我国和亚洲地区的重要作物病害，开发黄瓜疫霉的早期快速检测技术，对相关作物生产中的病害防控和无公害化具有重要的意义。近年来，PCR技术及其相关分子检测技术已广泛用于植物病原菌消长动态的分子检测与预警，主要利用核糖体rDNA/ITS序列设计特异性引物来对植物致病菌进行快速检测。ITS+5. 8S区域由编码真核细胞rRNA 5. 8S亚基的基因和该基因两侧的转录间序列(InterTranscribedSpacer, ITS)组成，由于ITS+5. 8S区域具有较高的变异速率，因此常被用于真菌种水平的鉴定和分子系统学研究。目前大多采用常规PCR方法进行植物病原菌检测，对仪器设备(如PCR仪、凝胶成像系统)要求高，投入大，给技术的基层推广造成了极大障碍。
发明内容
本发明的目的是提供一种便于基层推广使用的，用于检测黄瓜疫霉的LAMP引物及含有该引物的试剂盒。为了实现本发明目的，本发明的一种用于检测黄瓜疫霉(Phytophthora melonis)的LAMP引物组，其包括外侧正向引物F3 :5 ’ -CGGCGACTGGCTGCTA-3 ’ ；
外侧反向引物B3 :5 ’ -ATTACGTATCGCAGTTCGCA-3 ’ ；以及内侧正向引物 FIP : 5 ’ -CAAGAATGGGTTTAAAAGGTGGGCATGGCGATTGGTTTGGG-3，；内侧反向引物 BIP :5’ -TTACTGAATATACTGTGGGGACGAAAGTCTTTCCTAGACATCCACTGCTGAAAG-3，。本发明还提供含有上述LAMP引物组的用于检测黄瓜疫霉的试剂盒，其中所述试剂盒包括引物FIP、BIP、F3和B3。前述试剂盒中还包括dNTPs、Bst DNA聚合酶、PCR反应缓冲液中的一种或多种。更优选地，前述试剂盒还包括标准阳性模板。本发明进一步提供上述LAMP引物组或试剂盒在检测黄瓜疫霉中的应用，包括步骤1)提取样品中的DNA ;2)以步骤I)中提取的DNA为模板，进行LAMP-PCR扩增反应；3)分析PCR产物，即对上述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳检测结果判定样品中是
否含有黄瓜疫霉。LAMP-PCR反应体系以40 ill计为
权利要求
1.用于检测黄瓜疫霉(Phytophthoramelonis)的LAMP引物组,其特征在于,其包括 外侧正向引物 F3 :5，-CGGCGACTGGCTGCTA-3，；外侧反向引物 B3 :5’ -ATTACGTATCGCAGTTCGCA-3’ ；以及内侧正向引物 FIP :5’ -CAAGAATGGGITTAAAAGGTGGGCATGGCGATTGGITTGGG-3’ ；内侧反向引物 BIP :5’ -TTACTGAATATACTGTGGGGACGAAAGTCTTTCCTAGACATCCACTGCTGAAA G-3，。
2.含有权利要求I所述LAMP引物组的用于检测黄瓜疫霉的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、BstDNA聚合酶、PCR反应缓冲液中的一种或多种。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
5.权利要求I所述LAMP引物组或权利要求2-4任一项所述试剂盒在检测黄瓜疫霉中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤1)提取样品中的DNA；2)以步骤I)中提取的DNA为模板，进行LAMP-PCR扩增反应；3)分析PCR产物。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，PCR反应体系以40μ I计为
8.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，LAMP-PCR反应条件为65°C60分钟， 80 0C 2分钟，冰上终止反应。
全文摘要
本发明提供一种用于检测黄瓜疫霉(Phytophthora melonis)的LAMP引物及含有该引物的试剂盒，所述引物包括FIP和BIP以及F3和B3(如Seq ID No.1-4所示)。本发明将LAMP引物恒温扩增技术用于黄瓜疫霉病菌的快速检测，可从发病植物组织及土壤中复杂的病原菌环境准确地检测出黄瓜疫霉。该方法的特异性和灵敏度均较常规PCR方法更高，可对黄瓜疫霉的各种形态的繁殖体如菌丝、卵孢子和游动孢子等进行检测，对黄瓜疫霉疫情的早期预警、疫区的病原监测等方面具有重要意义；同时可以免除高昂的仪器投入，便于基层推广使用。
文档编号C12Q1/04GK102978285SQ20121049260
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月27日 优先权日2012年11月27日
发明者孙翔, 郭良栋, 季妞妞 申请人:中国科学院微生物研究所