专利名称：α和β地中海贫血基因检测的核酸膜条及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及地中海 贫血的诊断试剂，尤其涉及一种α和β地中海贫血基因检测的核酸膜条及试剂盒。
背景技术：
地中海贫血(Thalassemia，以下简称地贫)是由于病人某种或某些珠蛋白链合成速率降低，造成一些肽链缺乏，另一些肽链相对过多，出现肽链数量的不平衡而导致的溶血性贫血。地贫主要有两种类型，分别为α-珠蛋白链合成减缺导致的α-地贫和β-珠蛋白合成减缺导致的β -地贫。α -地贫(包括缺失型α -地贫和非缺失型α -地贫)是世界上最常见的单基因遗传病之一，我国南方的广西、广东、云南、海南、香港、台湾等省市及其周边地区也是本病的高发地区，全国29个省、市、自治区90万人血红蛋白病调查结果表明，人群中缺失型α-地贫的基因缺陷携带率为2. 64%，其中广西、广东、江西、四川发病率分别高达14. 95%,4. 11%、2.60%、1.92%。我国的缺失型α-地贫在基因型上主要为-α3_7、-α42和一SEA这三种缺失型，根据这三种缺失型在个体中的不同组合，可表现为静止型、标准型、血红蛋白H病(HbH病)和Hb Bart’ s胎儿水肿综合症这四种表现型。α-珠蛋白基因点突变类型是导致临床α地贫漏诊的主要原因之一，在我国南方非缺失型α-地贫的发病率也较高，广西地区地中海贫血的流行病调查中发现Hb CS和HbQS的发病率分别为I. 21%和O. 36%，可见非缺失型突变在Hb H的基因缺陷中占较大比例，非缺失型α-地贫的突变大多位于功能较强的α 2基因，故非缺失型Hb H病人的临床表现要比缺失型Hb H病人更为严重，纯合的非缺失α-地贫为严重的Hb H病，此外，非缺失型α -地贫与缺失型α -地贫双重杂合还可导致Hb H胎儿水肿综合症。地贫在我国主要分布在广东、广西、云南、海南、台湾、香港等省市及相邻省区的部分地区。据报道在广东β -地贫携带率为I. 83%-3. 36%，广西和海南甚至更高。β -地贫多由β_珠蛋白基因点突变所致，是我国南方各省最常见、危害最大的遗传病之一。在中国人群中常见的突变位点有CD41-42，IVS- II -654，-28，CD71-72等。目前常见的地贫基因检测方法有Southern印迹杂交-限制性酶谱分析法、跨越断裂点PCR (GAP-PCR)法、PCR-寡核苷酸探针(ASO)和PCR-反向点杂交(PCR-RDB)法等；生产厂家主要有亚能生物技术(深圳)有限公司、深圳益生堂生物企业有限公司、中山大学达安基因股份有限公司和潮州凯普生物化学有限公司等。国内临床常用的方法为PCR-反向点杂交法、GAP-PCR法。现有主要产品见表I:
权利要求
1.α和β地中海贫血基因检测的核酸膜条，包括一基底，和固定于所述基底上的特异性寡核酸探针，其特征在于，所述特异性寡核苷酸探针包括 β_地中海贫血基因所对应的正常对照特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ IDNO :1-7 ； α -地中海贫血基因所 对应的正常对照特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ IDNO 9-11 ； 用于检测β-地中海贫血基因的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID N0:8、SEQID NO :12-19 和 SEQ ID NO :23-30 ； 用于检测α-地中海贫血基因的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO20-22、SEQ ID NO :31_33。
2.根据权利要求I所述的α和β地中海贫血基因检测的核酸膜条，其特征在于，所述基底为尼龙膜。
3.α和β地中海贫血基因检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括 特异性扩增非缺失型α-地中海贫血基因的一对引物引物 ATF: SEQ ID NO 34 ；引物 ATR SEQ ID NO :35 ； 特异性扩增缺失型α-地中海贫血基因的三对引物引物 3. 7F SEQ ID NO :36 ；引物 3. 7R SEQ ID NO :37 ；引物 4. 2F SEQ ID NO :38 ；引物 4，· 2R SEQ ID NO :39 ；引物 SEAF SEQ ID NO :40 ；引物 SEAR SEQ ID NO 41 ； 特异性扩增地中海贫血基因两对引物引物 BFl SEQ ID NO :42 ；引物 BR2 SEQ ID NO :43 ；引物 BF2 SEQ ID NO :44 ；引物 BR2 SEQ ID NO :45 ； β-地中海贫血基因所对应的正常对照特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ IDNO :1-7 ； α -地中海贫血基因所对应的正常对照特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ IDNO 9-11 ； 用于检测β-地中海贫血基因的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO:8、SEQID NO :12-19 和 SEQ ID NO :23-30 ； 用于检测α-地中海贫血基因的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO20-22、SEQ ID NO :31_33。
4.根据权利要求3所述的α和β地中海贫血基因检测的试剂盒，其特征在于，所述寡核苷酸探针固定在基底上。
5.根据权利要求4所述的α和β地中海贫血基因检测的试剂盒，其特征在于，所述寡核苷酸探针固定在尼龙膜上。
6.根据权利要求3所述的α和β地中海贫血基因检测的试剂盒，其特征在于，所述引物5’端标记生物素。
7.根据权利要求3所述的α和β地中海贫血基因检测的试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液I和PCR反应液II，所述的PCR反应液I各组分含量为 去离子水17. 2μ L ; IOXPCR buffer 2. 5μ L ；. 25mM MgCl2 0. 5μ L ； .2. 5mM dNTP 2μ L ；. 100 μ M 引物 3. 7F 0. 07μ L ； .100 μ M 引物 3. 7R 0. 07μ L ；. 100 μ M 弓丨物 4· 2F 0. 05μ L ； .100 μ M 弓丨物 4· 2R 0. 05μ L ； . 100 μ M 引物 SEAF 0. 03μ L ；.100 μ M 引物 SEAR 0. 03μ L ； 5U/yL 超纯 Taq 酶0.5yL; 所述的PCR反应液II各组分含量为 去离子水16. 82μ L ；.10XPCR buffer 2. 5μ L ； .25mM MgCl2 0. 5μ L ； .2. 5mM dATP、dCTP、dGTP、dUTP 的等体积混合液2μ L ； . 100 μ M 引物 ATF 0. 06μ L ； . 100 μ M 引物 ATR 0. 06μ L ；. 100 μ M 弓丨物 BFl 0. 08μ L ；. 100 μ M 弓丨物 BRl 0. 08μ L ；ΙΟΟμΜ 引物 BF2 0. 05μ L ；ΙΟΟμΜ 引物 BR2 0. 05μ L ； IU/μ L UNG 0. 3μ L ；5υ/μ L Taq 酶0· 5μ L。
全文摘要
本发明涉及地中海贫血的诊断试剂，尤其涉及一种α和β地中海贫血基因检测的核酸膜条及试剂盒。本发明的一个技术方案为提供一种α和β地中海贫血基因检测的核酸膜条，包括一基底，和固定于所述基底上的特异性寡核酸探针，所述特异性寡核苷酸探针包括针对6种常见类型的α-地贫(3种缺失型和3种突变型)以及17种突变型β-地贫的探针。本发明能一次试验能同检测缺失型α地贫、非缺失型α地贫和β地贫，相对于现有同类技术，同时检测了未见报道的2种β地贫(-30和-32)和1种非缺失型α地贫(αWSα)，这3种基因型在中国的发生率不低，不检测会大大增加地贫漏检的风险，给家庭和社会带来严重的负担。
文档编号C12N15/11GK102943115SQ201210494748
公开日2013年2月27日 申请日期2012年11月28日 优先权日2012年11月28日
发明者刘福平, 梁少明, 刘晶晶, 任维 申请人:亚能生物技术(深圳)有限公司