专利名称：一种仿生胶原膜包被的培养器皿及制备方法
技术领域：
本发明属于生物材料领域，尤其涉及一种细胞或组织培养材料。
背景技术：
将细胞培养于细胞外基质上有助于在体外维持细胞的分化表型，并可以使用无血清的培养基培养细胞。目前常用于细胞培养的细胞外基质材料有各类型的胶原、纤维粘连蛋白、层粘连蛋白等。胶原作为人与动物体内含量最大的细胞外基质成份，其优异的生物相容性与生物活性早就为人们所熟知。在体内，前胶原分子合成后，被酶切去两端的端肽，形成长约300nm，直径1. 5nm的胶原蛋白分子，然后多个胶原分子自组装形成具有67nm典型D_band结构的纳米胶原纤维。67nm D-band的产生是由于胶原分子在首尾相交联自组装时所产生的overlap和gap所致。Overlap段长约30nm, gap段长约37nm。螺纹结构的深度在3nm至5nm间。如图1所示。在合适的pH、温度、离子浓度的环境中，在静电等作用下，酸法提取得到的胶原分子可以在体外重新自组装，形成与体内类似的具有周期性螺纹结构的胶原纤维。美国Advanced BioMatrix公司有包被胶原纤维的玻璃板出售,但这种玻璃板使用不够方便。限制了其的应用。虽然各国相关的多家公司(美国BD公司等)都有在商业化的培养器皿表面进行胶原包被，且有产品面市，但这种胶原包被的孔板仅仅利用孔板自身吸附胶原分子进行涂覆，并不具备胶原在体内所特有的纤维结构及典型的D-band周期性螺纹结构。而细胞可以响应基质表面的几何形貌，且尺寸可以小至纳米级。因此，制备有纳米结构的胶原涂层培养器皿对于特殊 细胞的培养及胶原体内天然纤维结构生物功能的研究有重要意义。美国国家标准与技术研究院在非TC处理的细胞培养孔板(聚苯乙烯)表面制备胶原纤维涂层，但大部分的胶原都被洗去，因此包被孔板时使用的胶原浓度要求高，胶原的包被率低。
发明内容
本发明的目的在于针对上述产品的缺陷，提供一种易于使用，且均一、平整、具有天然纤维结构及周期性螺纹结构的仿生胶原膜包被的培养器皿，用以增强细胞粘附、细胞增殖和细胞功能及胶原的细胞学功能。该胶原膜同器皿表面结合紧密，不易脱落。本发明同时提供该培养器皿的制备方法。本发明的目的通过以下技术方案实现一种仿生胶原膜包被的培养器皿的制备方法，包括如下步骤( I)将胶原醋酸溶液与盐缓冲液混合，调整混合液的pH至中性；(2)将步骤(I)的混合液装入培养器皿，于40摄氏度以下保温待胶原重组完成；(3)将步骤(2)得到的含重组胶原的器皿于60摄氏度以下烘干；(4)用超纯水洗步骤(3)得到的胶原层(避免洗涤过于剧烈致胶原层脱离器皿底面)，于60摄氏度以下干燥；(5)重复步骤(4)两次以上直至洗去所有的盐结晶，即得仿生胶原膜包被的培养器皿。优选地，步骤(1)所述胶原醋酸溶液为I型或II型胶原醋酸溶液；溶液浓度为
0.02 0. 2mg/ml。优选地，步骤(2)所述保温温度为30-37摄氏度。优选地，步骤(2)所述保温时间1h至5h。优选地，步骤(2)所述的培养器皿为培养多孔板、培养皿、培养瓶等细胞或组织培养用具，TC处理与否均可。与现有技术相比，本发明具有如下优点(1)本发明通过操作简便的自组装过程，经多次清洗烘干，通过氢键与疏水相互作用增加了胶原对器皿表面的结合力，克服了胶原在器皿底面结合力差的问题，制备出具有均一平整结构的无纺布样式纳米纤维仿生胶原膜涂层。(2)胶原利用率高，较美国国家标准与技术研究院的方法相比，达到相同的包被效果所需使用的胶原量大大减少。(3)器皿底面附着的胶原膜其胶原是以纳米纤维形式存在，而且当重组温度介于30至37摄氏度时，形成的纤维具有典型的67nm周期性螺纹结构。(4)所包被的胶原膜可以通过调整胶原的浓度来控制胶原纤维的包被率和膜厚度。(5)本发明的胶原膜活性良好，显示出卓越的细胞亲合性，在细胞粘附方面优于商业化的组织处理细胞孔板。
图1为胶原自组装原理图。图2是天狼星红染色的孔板图，Ca)无胶原包被培养孔板；(b)无结构胶原包被培养孔板；(c)实施例1制备的纤维结构胶原包被培养孔板。图3是实施例1制备的包被在12孔板表面的胶原膜各放大倍数扫描电镜图，(a)1000 倍；(b) 5000 倍；(c) 30000 倍；(d) 50000 倍。图4为实施例1制备的胶原膜刮痕试验的扫描电镜图。图5 (a)显示ATDC5在实施例1制备的包被有纤维结构胶原的培养器皿上粘附的扫描电镜图；(b)显不培养于孔板中的细胞扫描电镜图。图6是实施例2制备的包被在12孔板表面的胶原膜扫描电镜图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1一种仿生胶原膜包被的培养器皿的制备方法，步骤如下(1)将普通酸法提取的I型胶原用0. 005M的醋酸溶液调整浓度至0. 2mg/ml。
(2)缓冲液的配制终浓度为 270mM NaCl,60mM HEPES、60mMNa2HP04 · H2OU. 4mMNaOH的缓冲液。(3)将步骤(I)和步骤(2)溶液进行混合，得到pH为中性的胶原混合液，取Iml加入Corning公司经TC处理的12孔板中，盖好盖子，于30摄氏度烘箱保温3h。(4)将步骤(3)得到的含重组胶原的12孔板盖子打开，于30摄氏度烘箱烘12h。(5)用超纯水洗步骤(4)得到的器皿中的胶原层，避免洗涤过于剧烈致胶原层脱离器皿底面。于30摄氏度烘箱烘2h。(6)重复步骤(5)四次，即得仿生胶原膜包被的培养器皿。由图2可以看出，制备的胶原膜在培养器皿表面分布平整均一，布满了整个器皿的底面。图3可以看出，器皿 底面附着的胶原膜其胶原是以纳米纤维形式存在，直径约为200nm,而且具有典型的67nm周期性螺纹结构。图4的刮痕试验表明胶原膜仅有几层胶原纤维构成，厚度为nm级。将ATDC5细胞(一种小鼠软骨分化模型细胞)分别培养于制备的包被有纤维结构胶原的培养器皿以及普通的商业化的组织处理细胞孔板中，培养24h后戊二醛固定，梯度酒精脱水并风干，镀金膜后扫描电镜观察。图5a显示ATDC5在包被有纤维结构胶原的培养器皿上粘附良好，显示出卓越的细胞亲合性；而培养于孔板中的细胞铺展面积要远小于培养于胶原纤维膜上的细胞(图5b)说明胶原膜活性良好，在细胞粘附方面优于商业化的组织处理细胞孔板。实施例2一种仿生胶原膜包被的培养器皿的制备方法，步骤如下(I)将普通酸法提取的I型胶原用O. 005M的醋酸溶液调整浓度至O. 05mg/ml。(2)缓冲液的配制终浓度为 270mM NaCl,60mM HEPES、60mMNa2HP04 · H2OU. 4mMNaOH的缓冲液。(3)将步骤(I)和步骤(2)溶液进行混合，得到pH为中性的胶原混合液，取Iml加入Corning公司经TC处理的12孔板中，盖好盖子，于30摄氏度烘箱保温3h。(4)将步骤(3)得到的含重组胶原的12孔板盖子打开，于30摄氏度烘箱烘12h。(5)用超纯水洗步骤(4)得到的器皿中的胶原层，避免洗涤过于剧烈致胶原层脱离器皿底面。于30摄氏度烘箱烘2h。(6)重复步骤(5)四次，即得仿生胶原膜包被的培养器皿。由图6可以看出，制备的胶原膜以比较稀疏的方式分布于12孔板底面，且平整均
O
权利要求
1.一种仿生胶原膜包被的培养器皿的制备方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)将胶原醋酸溶液与盐缓冲液混合，调整混合液的pH至中性； (2)将步骤(I)的混合液装入培养器皿，于40摄氏度以下保温待胶原重组完成； (3)将步骤(2)得到的含重组胶原的器皿于60摄氏度以下烘干； (4)用超纯水洗步骤(3)得到的胶原层，于60摄氏度以下干燥； (5)重复步骤(4)两次以上直至洗去所有的盐结晶，即得仿生胶原膜包被的培养器皿。
2.根据权利要I所述的制备方法，其特征在于，步骤(I)所述胶原醋酸溶液为I型或II型胶原醋酸溶液；胶原浓度为O. 02、. 2mg/ml。
3.根据权利要I或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述保温温度为3(Γ37摄氏度。
4.根据权利要3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述保温时间为Ih至5h。
5.根据权利要I或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的培养器皿为培养多孔板、培养皿、培养瓶等细胞或组织培养用具。
6.权利要求f5任意一项所述方法制备的仿生胶原膜及仿生胶原膜包被的培养器皿。
全文摘要
本发明公开了一种仿生胶原膜包被的培养器皿及制备方法，包括如下步骤(1)将胶原醋酸溶液与盐缓冲液混合，调整混合液的pH至中性；(2)将步骤(1)的混合液装入培养器皿，于40摄氏度以下保温待胶原重组完成；(3)将步骤(2)得到的含重组胶原的器皿于60摄氏度以下烘干；(4)用超纯水洗步骤(3)得到的胶原层，于60摄氏度以下干燥；(5)重复步骤(4)两次以上直至洗去所有的盐结晶，即得仿生胶原膜包被的培养器皿。通过简单的胶原自组装得到的产品，具有如下优点胶原与培养器皿贴合紧密，平整度好，抗降解性能好，具有纳米纤维结构，且具有胶原体内独有的67nm周期性螺纹结构。
文档编号C12M3/00GK103060192SQ201210537068
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月12日 优先权日2012年12月12日
发明者王迎军, 翟志臣, 姚咏嫦 申请人:华南理工大学