专利名称：一种细菌通用pcr检测方法
技术领域：
本发明涉及细菌检测领域，具体涉及一种细菌通用的PCR检测方法，用于所有细菌的检测。
背景技术：
疫苗等生物制品的生产需要遵从药品产生质量管理规范，并且在规范的质量检测体系经过严格的检测才能确保疫苗安全性和有效性，以求最大效率地提高接种后的效应作用，最大限度地降低免疫接种后的不良反应。微生物检验是医疗器械、生物药品等生产制造行业产品质量控制的重要内容，其内容主要包括以培养方法检测是否有细菌、支原体等微生物的污染；其中菌检是微生物检测的最基本也是最重要的组成部分，纯菌实验检测诸如减毒活菌苗自身菌体的活菌量、总菌量以及是否有其他杂菌的存在；以及以CHO细胞毒试验、HeLa细胞毒等试验检测细菌毒素的活力等。传统方法对检测场所和检测人员素质要求较高，且培养基的配制、质控标准的把握等繁琐，且需时较长，不利于快速做出判断。原核生物的r RNA含有3种类型23S、16S、5SrRNA，它们分别含有2，900、1540和120个核苷酸。16SrRNA为核糖体RNA的一个亚基，其编码基因是16SrDNA ；16SrDNA长度适中信息量较大、易分析，且在有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌通用物，可以扩增出具有细菌高度特异性的片段，是生物的种属鉴定和系统的重要分子基础。以16SrDNA为目的现代分子生物学技术能精确的揭示微生物种类和遗传的多样性，从而16SrDNA序列分析成了微生物分类鉴定主要依据。随着核酸测序技术的发展，越来越多的微生物的16SrDNA序列被测 定并收入国际基因数据库中，16SrDNA序列分析技术在微生物分类鉴定及分子检测中得到了广 泛的应用。
发明内容
鉴于传统检测方法的缺陷，本发明的目的在于提供一种细菌通用的PCR检测方法，可快速鉴别不同细菌，敏感性、准确性优于传统检测方法，解决了特异性PCR逐个筛选鉴别病原的繁琐性，克服了传统微生物培养方法的限制，操作方便，检测快速准确且灵敏度闻。为实现上述目的本发明所采用的技术方案如下
一种细菌通用的PCR检测方法，包括以下步骤
I)样品处理
无菌条件下从样本中分离细菌，划线接种于营养琼脂平板、血液琼脂平板和麦康凯平板上，置恒温培养箱中，培养，获得单菌落；单菌落用单菌落接种液体培养基培养；收集菌液，在液氮和35-40°C下，分别反复冻融裂解细菌或超声波破碎细菌，之后消化处理；2)核酸提取
将处理后的样本，用总核酸试剂盒提取核酸，核酸提取后用分光光度计测核酸浓度；
3)PCR扩增
设计引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2加入到PCR反应体系中对细菌DNA模板进行PCR扩增；
4)PCR产物克隆、测序
PCR产物纯化回收，使用分光光度计检测核酸浓度，回收产物16°C过夜连接PMD-18T克隆载体进行克隆；随机挑选克隆产物中的10个菌落，分别于AMP+LB液体培养基培养3 6小时，用上述引物SEQ ID ΝΟ:1和SEQ ID NO:2进行PCR进行鉴定，电泳观测结果，PCR结果阳性的样本菌液送测序公司进行测序。步骤I)中恒温培养箱的温度为35_40°C，培养时间为18_24h。步骤I)中消化处理过程为Iml的细菌中分别加入5 μ I的RNase，及lOXBuffer，37°C消化1. 5小时后，80°C、5min终止消化。步骤3)中所述PCR反应体系为细菌DNA模板1-10 μ1、10XPCR buffer5_20 μ1、dNTPs Mixture4-10 μ1、r TaqO. 25 μ I, ddH20 补足 50 μ I ;引物的加入量为 16SrDNAFl-μ l、16SrDNA Rl μ I。步骤3)中所述 PCR 扩增程序为 96°C，预变性 2min ；96°C,30s ； 55。。，30s ；72°C,60s ；35个循环，72°C，10min，4°C保存；扩增产物用1%的琼脂糖凝胶中进行电泳。步骤4)中克隆程序为将连接产物加入至100 μ I的DH5a感受态中，冰浴30min 后，于421水浴热激908，置冰上3 51^11后，加入50(^1的LB培养基，37°C振荡培养Ih ；将培养液3000rpm离心3min，弃去400 μ I培养基，剩余培养基重新与离心细菌沉淀混合，混合液涂布于Amp-LB固体培基，充分吸收后，于37°C倒置培养12 16h。本发明的有益效果在于本发明的建立了一种细菌通用PCR检测方法，可快速鉴别不同细菌，敏感性、准确性优于传统检测方法，解决了特异性PCR逐个筛选鉴别病原的繁琐性；该方法可用于生产中疑似细菌污染产品及临床病料样本的快速检测，有利于提高生产效率以及疾病的快速准确诊断，本发明克服了传统微生物培养方法的限制，操作方便，检测快速准确且灵敏度高，已广泛应用到菌种鉴定，群落对比分析等领域，是一种客观和可信度较高的鉴别方法。结果表明本发明的PCR检测方法具有良好的特异性和较高的敏感性，同时为细菌快速诊断试剂盒研发奠定了技术基础。下面结合附图及具体的实施方式对本发明作进一步详细说明。
图1为敏感性试验电泳图；泳道1:阴性对照，泳道2 :细菌稀释度10-8，泳道3 细菌稀释度10-7，泳道4 :细菌稀释度10-6，泳道5 :细菌稀释度10-5，泳道6 :细菌稀释度10-4，泳道7 :细菌稀释度10-3 ;泳道8 :细菌稀释度10-2 ;泳道9 :细菌稀释度10_1 ;泳道10 :阳性对照；
图2为特异性试验电泳图⑷为DL 2000 MARK ;泳道I大肠杆菌；泳道2副猪嗜血杆菌；泳道3绿脓杆菌；泳道4巴氏杆菌；泳道5沙门氏菌；泳道6为阴性对照；图3为大肠杆菌16S rDNA PCR检测；M为DL 2000 MARK ;泳道I大肠杆菌；
图4为未知样品16S rDNA PCR结果；M DL2000 ；1, 2为检测样本；
图5为未知样品16S rDNA PCR测序结果BLAST ；
图6为单菌落照片。
具体实施例方式实施例1 :细菌通用PCR方法敏感性试验
取大肠杆菌作已知检测，溶解于PBS (pH值7. 4)缓冲液中，取500 μ L处理的菌液按1:10倍连续稀释，之后按上述实验步骤进行DNA抽提、PCR及序列分析，确定该方法敏感性。I)实验材料
菌株DH5a菌株由广东大华农动物保健品股份有限公司生药研发中心保存；
试剂麦康凯琼脂培养基、三糖铁琼脂、Dunham氏蛋白胨水溶液、葡萄糖蛋白胨水溶液、LB均购自广州齐云生物药品有限公司；Π引哚(靛基质)试剂、Μ. R (甲基红)试剂、VP试剂等常规生化试剂购自广州建阳生物；微量生化发酵管购自杭州天和微生物试剂有限公司；Tris-HCl、EDTA、NaAc、乙醇、NaCl、LiCl等试剂购自鼎国生物药品有限公司；DNA胶回收试剂盒为omega公司产品；常规分子生物学实验试剂购自宝生物工程(大连)有限公司；引物16SrDNA F : 5’ -GAGCGGATAACAATTTCACACAGGGA-3’
16SrDNA R :5’ -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACAG-3’
2)实验方法
细菌分离、纯化以及预处理取大肠杆菌作已知检测，溶解在PBS(pH值7. 4)缓冲液中，取500mL处理的菌液按1:10倍连续稀释；无菌操作从样本中分离细菌，划线接种于营养琼脂平板、血液琼脂平板和麦康凯平板上，置于37°C恒温培养箱中，培养18-24h，观察单个菌落形态；挑取单菌落接种液体培养基，200rpm、37°C培养24h ;收集菌液，液氮或_80°C中，37°C反复冻融三次裂解细菌(超声波破碎亦可)，Iml的菌液中分别加入5μ I的RNase，及10XBuffer，37°C消化1. 5小时后，80°C 5min终止消化；
细菌核酸提取将处理后的样本，按常规方法提取核酸，核酸提取后用分光光度计测核酸浓度；
PCR扩增:反应体系(50 μ I ):10XPCR buffer 与 dNTPs Mixture 总量为 25 μ I，细菌DNA模板 10 μ 1，引物 16SrDNA F 与 16SrDNA R 各 Iul (10 μ M)，ddH20 补足 50 μ I 反应体系；反应条件96°C，预变性 2min，96°C，30s，55。。，30s，72。。，60s，35 个循环，72°C，lOmin。4°C保存，取5μ LPCR产物在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳，并观测结果；
PCR产物克隆测序对扩增结果为阳性的PCR产物纯化回收，回收试剂盒为TaKaRaDNA Fragment Purification Kit Ver. 2. O.并使用分光光度计测核酸浓度；回收产物连接于 PMD 18-T Vector，连接体系为 PMD 18-T Vector*l I μ I, insert DNA 0. 3pmol,Solution I 5μ 1，ddH20补足10μ 1，16°C过夜连接，连接产物加入至100μ I的DH5a感受态中，冰浴30min后，于42°C水浴热激90s，置冰上3 5min后，加入500 μ I的LB培养基，37°C振荡培养lh，将培养液3000rpm离心3min，弃去200 μ I培养基。剩余培养基重新与离心细菌沉淀混合，混合液涂布于AIX LB固体培基，充分吸收后，于37°C倒置培养12 16h ；随机挑选10个菌落，分别于AMP+LB液体培养基培养3 6小时，使用上述引物PCR进行鉴定。电泳观测结果，PCR结果阳性的样本送测序公司进行测序。测序结果通过BLAST与GenBank公布的序列进行比对分析；
3)实验结果
电泳结果用细菌通用PCR方法检测取大肠杆菌作已知检测，溶解在PBS (pH值7. 4)缓冲液中，取ImL处理的菌液按1: 10倍连续稀释，敏感性试验表明，细菌通用PCR方法检测大肠杆菌最闻稀释度为10-6，如图1不。测序结果测序结果为大肠杆菌基因序列，NCBI BLAST结果如图1。本实施例中，以取大肠杆菌作已知检测，进行了细菌通用PCR方法的敏感性试验，细菌通用PCR方法检测大肠杆菌最高稀释度为10-8。表明该方法具有较高的敏感性。实施例2、细菌通用PCR方法特异性试验 O实验材料
毒株、细胞特异性试验检测细菌(如表I所示)毒株由广东大华农动物保健品股份有限公司生药研发中心研发并保存。表I
权利要求
1.一种细菌通用的PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤 1)样品处理 无菌条件下从样本中分离细菌，划线接种于营养琼脂平板、血液琼脂平板和麦康凯平板上，置恒温培养箱中，培养，获得单菌落；单菌落用单菌落接种液体培养基培养；收集菌液，在液氮和35-40°C下，分别反复冻融裂解细菌或超声波破碎细菌，之后消化处理； 2)核酸提取 将处理后的样本，用总核酸试剂盒提取核酸，核酸提取后用分光光度计测核酸浓度； 3)PCR扩增 设计引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2加入到PCR反应体系中对细菌DNA模板进行PCR扩增； 4)PCR产物克隆、测序 PCR产物纯化回收，使用分光光度计检测核酸浓度，回收产物161过夜连接？1 -18丁克隆载体进行克隆；随机挑选克隆产物中的10个菌落，分别于AMP+LB液体培养基培养3 6小时，用上述引物SEQ ID ΝΟ:1和SEQ ID NO:2进行PCR进行鉴定，电泳观测结果，PCR结果阳性的样本菌液送测序公司进行测序。
2.根据权利要求1所述的细菌通用的PCR检测方法，其特征在于步骤I)中恒温培养箱的温度为35-40°C，培养时间为18-24h。
3.根据权利要求1所述的细菌通用的PCR检测方法，其特征在于步骤I)中消化处理过程为1ml的细菌中分别加入5μ l的RNase，及10XBuffer，37°C消化1. 5小时后，80°C、5min终止消化。
4.根据权利要求1所述的细菌通用的PCR检测方法，其特征在于步骤3)中所述PCR反应体系为细菌 DNA 模板 l-10μ 1U0XPCR buffer5_20 μ1、dNTPs Mixture4_10 μ1、rTaqO. 25μ1、ddH20 补足 50μl ;引物的加入量为 16SrDNA Fl-μ1、16SrDNA Rl μ l。
5.根据权利要求1所述的细菌通用的PCR检测方法，其特征在于步骤3)中PCR扩增程序为 96°C，预变性 2min ；96°C,30s ； 55。。，30s ；72°C,60s ;35 个循环，72°C，lOmin，4°C保存；扩增产物用1%的琼脂糖凝胶中进行电泳。
6.根据权利要求1所述的细菌通用的PCR检测方法，其特征在于步骤4)中克隆程序为将连接产物加入至100 μ I的DH5a感受态中，冰浴30min后，于42°C水浴热激90s，置冰上3 511^11后，加入50(^1的LB培养基，37 °C振荡培养Ih ;将培养液3000rpm离心3min，弃去400 μ I培养基，剩余培养基重新与离心细菌沉淀混合，混合液涂布于Amp-LB固体培基，充分吸收后，于37°C倒置培养12 16h。
全文摘要
本发明公开一种细菌通用的PCR检测方法，包括样品处理、核酸提取、PCR扩增、PCR产物克隆、测序等步骤，本发明的建立的细菌通用PCR检测方法，可快速鉴别不同细菌，敏感性、准确性优于传统检测方法，解决了特异性PCR逐个筛选鉴别病原的繁琐性；该方法可用于生产中疑似细菌污染产品及临床病料样本的快速检测，有利于提高生产效率以及疾病的快速准确诊断，本发明克服了传统微生物培养方法的限制，操作方便，检测快速准确且灵敏度高，已广泛应用到菌种鉴定，群落对比分析等领域，是一种客观和可信度较高的鉴别方法。结果表明本发明的PCR检测方法具有良好的特异性和较高的敏感性，同时为细菌快速诊断试剂盒研发奠定了基础。
文档编号C12Q1/04GK103060440SQ20121053695
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月12日 优先权日2012年12月12日
发明者任常宝, 邵定勇, 陈瑞爱, 黄红亮, 谢小雨, 唐兆新 申请人:肇庆大华农生物药品有限公司, 广东大华农动物保健品股份有限公司