专利名称：：化妆品中倍他米松的高效液相色谱检测方法
技术领域：
：本发明是一项利用高效液相色谱仪检测化妆品中禁用成分一倍他米松(Betamethasone)的新技术，尤其适用于化妆品中倍他米松的定性及定量分析。
背景技术：
：倍他米松属于肾上腺皮质激素类药物，具有抗菌、消炎的作用。国家卫生部颁布的2002年版《化妆品卫生规范》规定，化妆品中不得添加倍他米松。倍他米松由于其广谱高效的杀菌作用，被添加到祛痘类产品以达到消炎、祛痘、除螨及抗粉剌的目的。但这种药物的不良反应较多，有滁钠作用，对生长的抑制作用较强；还能引起皮质类固醇激素引起的各种不良反应，如肌肉骨骼、胃肠道、皮肤、神经系统、内分泌系统的异常和水电解质紊乱等。鉴于以上这些不良反应，长期使用添加有倍他米松的化妆品或皮肤性接触此种药物可严重影响人体健康。目前关于倍他米松检测的文献报道大都是针对倍他米松原料和药品中倍他米松的检测方法，主要有旋光法、分光光度法、高效液相色谱法等。旋光法影响因素较多，需要标准对照品和样品的量较多，不适宜微量倍他米松的分析；分光光度法操作繁琐，样品处理过程中损失较多，且检出限较高，重复性较差；高效液相色谱方法是近几年检测倍他米松较常用的方法，但也仅仅局限于原料药和各种药品制剂中含量的检测，由于药品组分较少，基质简单，干扰因素较少，且样品预处理简单目标检测物损失小，因此药品中倍他米松的含量容易检测。而化妆品、饲料、肉类中的倍他米松含量的检测国家还没有制定相关的检测标准和方法，并且到目前为止化妆品中倍他米松的检测也没有相关的文献报道。与药品不同，化妆品种类繁多有膏、霜、乳、粉、水、啫喱、凝胶等多种剂型，并且基质复杂，各成分的理化性质差别较大，干扰因素较多，尤其是倍他米松作为化妆品禁用成分添加到化妆品中，其含量较低，用上述的旋光法、分光光度法很难准确的检测出化妆品中微量的倍他米松成分。因此，针对现有倍他米松检测技术上的不足，我们设计了一种用高效液相色谱方法检测化妆品中倍他米松的方法，该方法操作简单，专属性好，灵敏度高，且适宜化妆品中倍他米松的微量检测。
发明内容本发明的目的是提供一种检测化妆品中倍他米松的分析方法，该项技术利用高效液相色谱仪不仅可以对化妆品中的倍他米松进行准确的定性分析，而且还可以进行微量的定量分析。本发明针对倍他米松的理化性质用一定浓度的甲醇一盐酸混合液或乙腈一盐酸混合液提取化妆品中的倍他米松，然后将提取液过滤，滤除固体杂质，直至滤液澄清，取制备好的样液上机，用甲醇一水溶液或乙腈一水溶液进行洗脱分离。所用高效液相色谱仪的主要配置包括十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱或C8柱、二极管阵列检测器或紫外检测器。本发明方法的主要分析步骤如下-1样品预处理称取一定量的化妆品(乳、膏、霜或水剂)于10ml刻度离心管中，加入6ml左右的提取液(甲醇0.011.00mol/ml盐酸=2080%:8020%或乙腈0.011.00mol/ml盐酸=2080%:8020%)，涡旋混匀使基质充分分散,定容至刻度,再超声提取15—30min,将提取液转移至Eppendorf管中冰浴30min使基质析出，12000rpm/min离心5min，如果有必要可以再用0.45um滤膜过滤。2色谱条件(1)色谱柱以十八垸基硅烷键合硅胶为填充剂的反相色谱柱C18或C8柱；(2)检测器二极管阵列检测器或紫外检测器；(3)检测波长选用190-380mi波长作为检测波长；(4)流动相采用甲醇水=2080%:8020%或乙腈水=2080%:8020%泡合液作为流动相，平衡色谱柱约20min，使基线平稳，该条件下保留时间适合，峰形对称，分离度好(R〉1.5)。(5)流速0.51.5ml/min;(6)柱温1535'C。3浓度计算方法用倍他米松标准物质配制成一定梯度浓度的标准溶液，取2(V1进样，按外标法，以峰面积一浓度作线性回归，得出线性冋归方程，利用该方程和测得的样品中倍他米松的峰面积计算样品中倍他米松的含量。4样品检测(1)按照l中的方法进行样品预处理，取处理好的样品20nl进样；然后再取适当浓度的倍他米松标准溶液20nl进样。(2)依照2中的检测条件进行检测，分别得到样品的色谱阁和倍他米松标准品的色谱图；将样品的色谱图和标准品的色谱图进行比较，样品色谱图中与标准品保留时间相近(误差范围标准品保留时间士0.5分钟)的色谱峰即为相应的倍他米松成分，为了确保检测结果的准确性，可对初步确定的色谱峰进行光谱分析(光谱分析仅适用于二极管阵列检测器)，若与标准品的最大吸收波长及光谱图特征相似，可进一步确定样品中的倍他米松成分。(3)将样品屮倍他米松的色谱峰面积带入3中的线性回归方程中，计算样品中倍他米松的浓度。由于化妆品种类繁多、基质复杂，不能完全排除千扰成分与倍他米松在同一时间出峰的可能。采用二极管阵列检测器可获得倍他米松的紫外吸收光谱图，与标准品的光谱图对照，通过分析二者的最大吸收波长和光谱图特征，可进一步进行确认。本发明的分析方法准确、简便、快捷，灵敏度高，选择性、重复性好，适用于任何膏霜剂、乳剂、及水剂等各种剂型的化妆品。图1样品色谱图图2倍他米松标准品色谱图图3样品光谱图图4倍他米松标准品光谱图图5倍他米松标准曲线图具体实施例方式下面结合具体实施实例对本发明作进一步的阐述，但不限制本发明1材料1.1仪器岛津自动进样高效液相色谱系统Hypersil-ODS(150mmx4.6mm，5jim，柱号E1720574)色谱柱，SPD-M20A紫外可见光检测器，SPD-M20A二极管阵列检测器，LC-20AB二元高压梯度泵，SIL-20A自动进样系统，CTO-20A柱温箱及LCSolution色谱工作站。1.2试剂和样品无水甲醇(色谱纯)为Merck公司产品；盐酸(优级纯)为天津科密欧试剂厂产品；超纯水由Milli-Qsystem制取。倍他米松标准品购于中国药品生物制品检定所，批号为100118-200403。供试样品为快速去痘面膜。1.3标准品储备液精密称取100.OO呵倍他米松标准品置于50ml容量瓶中，加少许无水甲醇溶解，并用甲醇定容至刻度，摇匀，配制成浓度为2mg/ml的标准液作为储备液，于4'C冰箱中存放备用。2方法2.1色谱条件色谱柱Shim-packVP-ODS(150mmx4.6mm，5jim)检测器SPD-M20A一极管阵列检测器流动相采用甲醇水=60%:40%混合液作为流动相，使用该比例的流动相峰性对称，分离度好。检测波长241nm。经190-400nm波长扫描，倍他米松在241咖附近有最大吸收，故选择241nm作为检测波长。流速lml/min柱温25°C2.2样品预处理称取l.OOg的化妆品(快速去痘面膜)于10ml刻度离心管中，加入5ml无水甲醇，涡旋混匀使基质充分分散'再超声提取20min,将提取液转移至Eppendorf管中冰浴30min，12000rpm/min离心5min，再用0.45吵滤膜过滤，制成供试样品溶液。2.3样品检测取2(HU供试液进样，利用2.1中的色谱条件进行检测，获得样品的色谱图(图l)和光谱阁(图3);再取1.3中的倍他米松标准品储备液稀释至为60叫/ml浓度，20jxl进样，同样检测条件下，得到倍他米松标准品的色谱图(图2)和光谱图(图4)。2.4标准曲线ffl无水甲醇将倍他米松储备液稀释成如下梯度浓度的标准系列5ng/ml、10ng/ml、20tig/ml、40jig/ml、60叫/ml、80ng/ml、100ng/ml，取各浓度的标准溶液20(il进样，得到各浓度的峰面积(见表1),作峰面积一浓度标准曲线(见图5),得到其线性回归方程(由高效液相色谱工作站完成计算工作)。回归方程A(area)=78824C—6600R2=0.9999表1倍他米松标准曲线各点浓度及峰面积标曲各点浓度((ig/ml)峰面积<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>3结果分析由倍他米松标准品的色谱图(图2)可以看出，利用2.1中的色谱检测条件得到倍他米松标准品的保留时间为10.584min，将样品的色谱图(图l)和标准品的色谱图(图2)进行比较，可见样品色谱图中在10.575min处有一色谱峰与倍他米松标准品色谱峰的保留时间10.584min相近，误差在土O.5分钟范围之内，因此可以初步确定样品色谱图中10.575min处的色谱峰为倍他米松，该峰面积为955842.2mra2。将样品色谱图中10.575inin处峰的光谱图(图3)与倍他米松标准品的光谱图(图4)进行对比，可以发现样品的光谱图与标准品的光谱图的最大吸收波长相近且光谱图特征相似，可进一步确定样品中保留时间为10.575min的组分为倍他米松。将样品中倍他米松的色谱峰面积1959241.2mn^代入线性回归方程中，即可得到样品处理液屮倍他米松的含量为24.94吗/ml(由高效液相色谱工作站完成计算工作)，经计算可得快速去痘面膜样品中倍他米松的含量为0.2494呢/kg。该发明具有高分辨率，高灵敏度，重现性、选择性好且样品预处理方法简单的特点，适宜化妆品中倍他米松的定性、定量分析。本发明以大量实验和理论分析，找到了一种利用高效液相色谱仪检测化妆品中倍他米松的分析方法，填补了化妆品中倍他米松液相色谱分析方面的研究空白。权利要求1一种化妆品中倍他米松的高效液相色谱检测方法，其特征在于采用紫外检测器或二极管阵列检测器，以外标法定量，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱或C8柱，以甲醇-水混合液或乙腈-水混合液为流动相，采用190-380nm的检测波长，采用甲醇-盐酸混合液或乙腈-盐酸混合液溶解样品，超声萃取，0.45μm滤膜过滤。全文摘要本发明是一种采用高效液相色谱仪检测化妆品中倍他米松的分析方法。其特点在于采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱或C8柱；二极管阵列检测器或紫外检测器在190-380nm处进行检测；流动相采用甲醇-水混合液或乙腈-水混合液；样品经甲醇-盐酸混合液或乙腈-盐酸混合液萃取，超声提取20min左右，再冰浴30min，然后12000rpm/min高速离心5min，取上清备用，如果有必要，可再用0.45μm滤膜过滤后使用；根据样品的保留时间和光谱图进行定性分析，根据其峰面积进行定量分析。该发明的优点在于分辨率、灵敏度高，重现性、选择性好，样品预处理方法简单，适宜化妆品中倍他米松的微量分析。文档编号G01N30/00GK101169396SQ20071002792公开日2008年4月30日申请日期2007年5月10日优先权日2007年5月10日发明者郑伟东申请人:广东省保化检测中心有限公司