专利名称：化妆品中红霉素的高效液相色谱检测方法
技术领域：
本发明是一项利用高效液相色谱仪检测化妆品中红霉素的新技术，尤其适用f化妆品中微量抗生素-红霉素的定性及定量分析。
背景技术：
红霉素(Erythromydn)是一种碱性抗生素，为大环内酯类抗菌药物,作为 一种广谱高效的抗菌药物被广 泛应用到药品、饲料、和化妆品中。红霉素对革兰阳性菌，如葡萄球菌、化脓性链球菌、绿色链球菌等有 较强的抑制作用；对革兰阴性菌，如淋球菌、螺旋杆菌、百日咳杆菌、以及流感嗜血杆菌也有相当的抑制 作用；此外，对支原体、放线菌、螺旋体、立克次体、衣原体、少数分枝杆菌和阿米巴原虫都有抑制作用。 由于其广谱高效的抑菌作用，红霉素被一些化妆品生产厂家，添加到祛痘类产品以达到消炎、祛瘦、除螨 及抗粉刺的0的。但这种药物同时也存在着很多不良反应，《中国药典》规定红霉素针剂仅能静脉内给药， 严禁肌肉注射。若药液不慎漏入皮下或肌肉组织，轻者可引起局部剧烈的疼痛刺激，严重者可导致大片皮 肤坏死、粘连，愈合后常形成疤痕；此外还可阻挠性激素类的肠肝循环；过讨的红霉素能引起腹泻、恶心、 呕吐、胃绞痛、口舌疼痛等，更严重的是长期接触此类药物会导致许多病原微生物产生抗药性，不利于疾 病的治疗。冈此，为保护化妆品消费者的健康安全，建立灵敏、准确、快速的化妆品中红霉素的检测方法 是十分紧迫和必要的。
据各种文献报道，目前药品中红霉素的检测方法主要有抗生素微生物检定法、紫外分光光度法、液相 色谱法、薄层色谱法、化学发光分析、二阶导数差示脉冲极谱法。抗生素微生物检定法是《中国药典》(2000 年版)规定的检铡药品中红霉素的方法，该方法周期长，操作繁琐，影响因素较多，精密度低。紫外分光 光度法是比较经典的方法，但灵敏度不高，专属性差，不适于成分复杂样品的分析。薄层色谱法灵敏度高、 选择性好，但重复性差，且检测步骤繁琐。化学发光分析、二阶导数差示脉冲极谱法虽然检测灵敏度高， 但存在着仪器昂贵，设备不易普及等因素。高效液相色谱方法是g前检测红霉素药品较常用的方法，但也 仅仅局限于各种红霉素药品制剂的含量检测，而化妆品、饲料、肉类中的红霉素含量的检测还没有出台相 关的标准或方法，由丁药品组分较少，基质简单，千扰肉素较少，且样品预处理操作简便，目标检测物损 失小，因此红霉素药品的含量易于检测。与药品不同，化妆品种类繁多，基质复杂，各成分的理化性质差 别较大，干扰闵素较多，尤其是红霉素作为化妆品禁用成分添加到化妆品中，其含量较低，以上所述各种 方法很难准确的检测出化妆品中微量的红霉素成分，而且使用高效液相色谱检测化妆品中的红霉素的方法 还没有文献报道。针对以上现有技术的不足，我们设计了一种用高效液相色谱方法检测化妆品中红霉素的 方法，该方法专属性好，灵敏度高，且操作简单。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测化妆品中红霉素的分析方法，该项技术利用高效液相色谱仪不仅可以对
化妆品中的红霉素进行准确的定性分析，而且还可以进行微量的定量分析。
本发明是用无水甲醇或乙腈提取化妆品中的红霉素，经超声萃取、离心、过滤等一系列操作，滤除阔 体杂质，直至滤液澄清，取制备好的样液上机，用磷酸二氢铵一乙腈缓冲液或磷酸二氢铵一甲醇缓冲液进 行洗脱分离，在1恥-380nm波长下采集数据进行分析。所用高效液相色谱仪的主要配置包括十八烷基硅踪 键合硅胶为填充剂的反相色谱柱C8柱或C18杆:，检测器为紫外检测器或二极管阵列检测器。
本发明方法的主要分析步骤如下
1样品预处理
称取一定量的化妆品(乳、膏、霜或水剂)于10ml刻度离心管中，加入3—7ml无水甲醇或乙腈，涡 旋混匀使基质充分分散，定容至刻度，再超声提取15 — 30min，将提取液转移至E卯endorf管中， 12000rpm/niin离心5min，如果有必要可以再用0. 45 n m滤膜过滤备用。
2色谱条件
(1) 色谱柱以十八烷基硅垸键合硅胶为填充剂的反相色谱柱C8或C18柏-:;
(2) 检测器紫外检测器或二极管阵列检测器；
(3) 检测波长选用1恥-380nm波长作为检测波长；
(4) 流动相采用0. 01-1. 00鹏l/L磷酸二氢铵溶液(用三乙胺调节pH伉为4.0 — 8.0):乙腈=40 80% : 60 20%缓冲溶液或采用0. 01-1.0Omol/L磷酸二氢铵溶液(用二乙胺调节pH值为4. 0—8. 0):甲 醇=40 80% : 60 20%缓冲溶液作为流动相，平衡色谱柱约20rain，使基线平稳，该条件下保留时间适 合，峰形对称，分离度好(R〉1.5)。
(5) 流速0. 5 1..5ml/niin;
(6) 柱温15 35°C。 3浓度计算方法
用红霉素标准物质配制成一定梯度浓度的标准液，20nl体积进样，按外标法，以峰面积一进样浓度 作线性冋归，得出线性回归方程，利用该方程和样品中红霉素的峰面积计算样品中的红霉素含量。 4样品检测
(1) 按照1中的方法进行样品预处理，取处理好的样品20nl进样；然后再取适当浓度的红霉素标准 溶液2(^1进样。
(2) 依照2中的色谱条件进行检测，分别得到样品的色谱图和红霉素标准品的色谱图；将样品的色
谱图和标准品的色谱图进行比较，样品色谱图中与标准品保留时间相近(误差范围:标准品保留时间土0.5 分钟)的色谱峰即为相应的红霉素成分，为了确保检测结果的准确性，可对初步确定的色谱峰进行光谱分 析(光谱分析仅适用于二极管阵列检测器)，若与红霉素标准品的最大吸收波长及光谱图特征相似，可进 一步确定样品中的红霉素成分。
(3) 将样品中红霉素的色谱峰面积带入3中的线性回归方程中，计算样品中红霉素的浓度。 由于化妆品种类繁多、基质复杂，不能完全排除干扰成分与红霉素在同一时间出峰的可能。采用二极
管阵列检测器可获得红霉素的紫外吸收光谱图，与标准品的光谱图对照，通过分析二者的最大吸收波长和 光谱图特征，可进一步进行确认。
本发明的分析方法简便、快捷，灵敏度高，选择性、重复性好，适用于任何裔霜剂、乳剂、及水剂等
各种剂型的化妆品中红霉素的检测。
图1样品色谱图
图2红霉素标准品色谱图
图3样品光谱图
图4红霉素t示准品光谱图
图5红霉素标准曲线图
具体实施例方式
下面结合具体实施实例对本发明作进一步的阐述，但不限制本发明 1材料 1.1仪器
岛津自动进样高效液相色谱系统Hypersil-ODS (150mmx4.6mm, 5jmi，柱号E1720574)色谱柱， SPD-M20A紫外可见光检测器，SPD-M20A 二极管阵列检测器，LC-20AB 二元高压梯度泵，SIL-20A自动进 样系统，CTO-20A柱温箱及LCSolution色谱::l:作站。
1. 2试剂和样品
乙腈(色谱纯)、无水甲醇(色谱纯)为Merck公司产品；磷酸二氢铵(分析纯)、二乙胺(分析纯) 为天津科密欧试剂厂产品；超纯水由Milli-Q system制取。
红霉素标准品购于中国生物制品检定所，批号为130307-200215。 供试样品为碧颜抑痘精华、雪肌柔肤水(不含红霉素)。
1. 3标准品储备液
精密称取40.00mg红霉素标准品置于lOml容量瓶中，加少许无水甲醇溶解，并用甲醇定容至刻度， 摇匀，配制成浓度为4mg/ml的标准液作为储备液，于4i:冰箱中存放备用。 2方法
2. 1色谱条件
色谱柱Shim-packVP-ODS (150mmx4.6mm, 5nm) 检测器SPD-M20A 二极管阵列检测器
流动相采用0. lmol/L磷酸二氢铵溶液(用二乙胺调节pH值为5. 90):乙腈=60: 40缓冲溶液作
为流动相。磷酸二氢铵溶液一乙腈缓冲体系的基线噪音比磷酸二氢铵溶液一甲醇的基线噪音
小，且在pH值为5.恥时峰性对称，分离度好。 检测波长210咖。经190-380波长扫描，红霉素在197nm处有最大吸收，考虑到200 nm接近末端吸
收,溶剂吸收较强,干扰较大，而210 ran波长处溶剂吸收相对较小，故选择210 nm作为检测波长。
流速lml/min 柱温25'C2.2样品预处理
称取l.OOg的化妆品(碧颜抑痘精华)于10ml刻度离心管中，加入5ml无水甲醇，涡旋混匀使基质 充分分散，再超声提取20min,将提取液转移至Eppendorf管中，12000rpm/m] n离心5min，如果存必要可 以再用0. 45 !i m滤膜过滤，制成供试样品溶液。
2. 3标准曲线
用无水甲醇将1.3中红霉素储备液稀释成如下梯度浓度的标准系列0. 1mg/ml、 0.2rag/ml、 0.4mg/ml、 0. 6呢/ml、 0. 8rag/ral、 1. 0mg/ni1、 2. Omg/ml，取各浓度的标准溶液20nl进样.按2. 1的色谱条件进行测定， 得到各浓度的峰面积，作峰面积一浓度标准曲线，得到其线性回归方程(由高效液相色谱T.作站完成计算 工作)。
2. 4精密度
取浓度为0. 4mg/ml的红霉素标准溶液，每次进样20nl，连续进样5次，按2. 1的色谱条件进行测定， 记录峰面积，计算精密度。 2. 5稳定性
取浓度为0.4mg/ni1的红霉素标准溶液，在室温下放置，分别在0h、 5. 5h、 8h、 14h、 25h进样，每次 进样20nl，按2. 1的色谱条件进行测定，比较测定结果的稳定性。 2. 6重现性
取碧颜抑痘精华样品1. OOg，按2. 2中的方法处理样品，共做5个平行样，按2. 1的色谱条件进行测 定，计算相对标准偏差，比较重现性。 2. 7加样回收率
精密称取不含红霉素的雪肌柔肤水样品5份各1. 00克，每份加入2. 0mg/ni1的红霉素标准溶液各2ml， 按2. 2的样品预处理方法进行样品预处理，在2.1的色谱条件下进行测定，计算红霉素的回收率。 2. 8样品检测
取20nl供试液进样，利用2.1中的色谱条件进行检测，获得样品的色谱阁(图O和光谱图(图3); 再取1.3中的红霉素标准品储备液稀释至为0.60mg/ml浓度，20^1进样，问样检测条件下，得到红霉素标 准品的色谱图(图2)和光谱图(图4)。
3结果分析
按2.3的方法测定的红霉素各标准溶液0. lmg/ni1、0. 2mg/ml、0. 4nig/ml、0. 6mg/ni1、0. 8mg/inl丄Omg/ml、 2. Omg/ml的峰面积分别为48.13030咖2、 98. 08345咖2、 193. 37650 mm2、 295. 77676 mm2、 396. 01746 iran2、 502.53531 mm2、 1032.63623咖2，作峰面积一浓度标准曲线(见图5),得到其线性冋归方程(由高效液相 色谱工作站完成计算工作)A(area) =517. 74C-5.274， R2=0. 9999，可见红霉素在0. 1—2. Omg,/ml的浓度 范闱内线性良好。
精密度试验的5次进样的峰面积分别为193.45709 ram2、 193.05008 ram2、 192.76521 mm2、 192.95746 mm2、 193.34682 nrni2，根据峰面积计算其相对标准偏差为0.15% ，表明该方法精密度良好；稳定性试验的5次进 样的峰面积分别为193.58943 mm2、 192.63081咖2、 191.09543鹏2、 191.34327咖2、 189.63548咖2，由峰面 积计算其相对标准偏差为0.79%，表明红霉素甲醇溶液在室温下放置24小时比较稳定；重现性试验的5 次进样的峰面积分别为248.56813咖2、 237.06579咖2、 239.64186咖2、 235.35687 mm2、 230.98452 mm2,以
峰面积计算相对标准偏差为2.74%，说明该方法具有良好的重现性；加标问收率试验的5份平行样品的标 准品回收量和回收率见表1,由此计算得到的相对标准偏差为1. 80% 。
由红霉素标准品的色谱图(图2)可以看出，利用2. 1中的色谱检测条件得到红霉素标准品的保留时 间为5.089min，将样品的色谱图(图l)和标准品的色谱图(图2)进行比较，可见样品色谱图中在5. 127min 处有一色谱峰与红霉素标准品色谱峰的保留时间5.089min相近，误差在土O. 5分钟范闱之内，因此可以初 步确定样品色谱图中5. 127niin处的色谱峰为红霉素，该峰面积为239. 79056mm、将样品色谱图中5. 127min 处峰的光谱图(图3)与红霉素标准品的光谱图(图4)进行对比，可以发现样品的光谱图与标准品的光 谱图的最大吸收波长及光谱图特征均相似，可进一步确定样品中保留时间为5. 127min的组分为红霉素。
将样品中红霉素的色谱峰面积239. 79056咖2代入线性回归方程中，即可得到样品处理液中红霉素的含 量(由高效液相色谱工作站完成计算工作)，经计算可得碧颜抑痘精华样品中红霉素的含量为4. 73mg/g。
该发明具有高分辨率，高灵敏度，重现性、选择性好且样品预处理方法简单的特点，适宜化妆品中红 霉素的定性、定量分析。
本发明以大量实验和理论分析，找到了一种利用高效液相色谱仪检测4t妆品中红霉素的分析方法，填 补了化妆品中红霉素液相色谱分析方面的研究空白。
权利要求
1 一种化妆品中红霉素的高效液相色谱检测方法，其特征在于采用紫外检测器或二极管阵列检测器，使用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱或C8柱，以磷酸二氢铵-乙腈缓冲溶液或磷酸二氢铵-甲醇为流动相，采用190-380nm的检测波长，样品预处理采用无水甲醇或乙腈溶解样品，超声萃取，0.45μm滤膜过滤，以外标法定量计算样品中红霉素浓度。
2.根据权利要求1所述的化妆品中红霉素的高效液相色谱检测方法，其特征在于采用紫外检测器或二 极管阵列检测器。
3.根据权利要求1所述的化妆品中红霉素的高效液相色谱检测方法，其特征在于采用十八烷基硅烷键 合硅胶为填充剂的C18柱或C8柱。
4.根据权利要求1所述的化妆品中红霉素的高效液相色谱检测方法，其特征在于流动相采用 0. 01-1. 0Omol/L磷酸二氢铵溶液(用三乙胺调节pH值为4.0 — 8.0):乙腈=40 80% : 60 20%或 0.01-1.00mol/L磷酸二氢铵溶液(用三乙胺调节pH值为4.0-8.0):甲醇=40 80% : 60 20%，最佳 流动相选择为0. lmol/L磷酸二氢铵溶液(用三乙胺调节pH值为5.90):乙腈=60% : 40%。
5.根据权利要求1所述的化妆品中红霉素的高效液相色谱检测方法，其特征在丁采用190-380nm波 长进行检测，最佳检测波长为210tim。
6.根据权利要求1所述的化妆品中红霉素的高效液相色谱检测方法，其特征在于所用流速为0.5-1.5ml/min，柱温为20-30'C，进样体积为20^1;其中最佳流速为lml/min，最佳柱温为25。C。
7.根据权利要求1所述的化妆品中红霉素的高效液相色谱检测方法，.其特征在T样品预处理采用无水 甲醇或乙腈溶解萃取，超声提取15-25min， 0. 45pm滤膜过滤。
8.根据权利要求1所述的化妆品中红霉素的高效液相色谱检测方法，其特征在于样品分析后根据其保 留时间和光谱图进行定性分析，利用外标法根据其峰面积进行定量分析。
全文摘要
本发明是一种化妆品中红霉素的高效液相色谱检测方法，其特点在于采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C8柱或C18柱；采用紫外检测器或二极管阵列检测器在190-380nm处进行检测；以磷酸二氢铵溶液-乙腈缓冲液或磷酸二氢铵溶液-甲醇缓冲液为流动相；样品经无水甲醇或乙腈萃取，超声提取20min，再12000rpm/min离心约5min，取上清液作为供试样液，如有必要可再用0.45μm滤膜过滤备用；根据样品的保留时间和光谱图进行定性分析，根据其峰面积进行定量分析。该发明的优点在于分辨率、灵敏度高，重现性、选择性好，样品预处理方法简单快捷，适宜化妆品中红霉素的微量分析。
文档编号G01N30/02GK101173912SQ20071002685
公开日2008年5月7日 申请日期2007年2月9日 优先权日2007年2月9日
发明者郑伟东 申请人:广东省保化检测中心有限公司