专利名称：化妆品中氢化可的松的高效液相色谱检测方法
技术领域：
本发明是一项利用高效液相色谱仪检测化妆品中禁用成分一氢化可的松(Hydrocortisone)的新技术， 尤其适用于化妆品中氢化可的松的定性及定量分析。
背景技术：
氢化可的松属于糖皮质激素类药物，具有抗菌、消炎的作用。国家卫生部颁布的2002年版《化妆品 卫生规范》规定，化妆品中不得添加氢化可的松。氢化可的松由于其广谱高效的杀菌作用，被添加到祛痘 类产品以达到消炎、祛痘、除螨及抗粉剌的目的。但这类药物的不良反应较多，如体重增加、下肢浮肿、 紫纹、易出血倾向、创口愈合不良、肱或股骨头缺血性坏死、骨质疏松或骨折、肌无力、肌萎縮、低血钾 综合征、胃肠道刺激(恶心、呕吐)、胰腺炎、消化性溃疡或肠穿孔，儿童生长受到抑制、青光眼、白内 障、良性颅内压升高等综合征。长期使用添加有氢化可的松的化妆品或皮肤性接触此种药物可严重影响人 体健康。
目前关于氢化可的松检测的文献报道大都是针对氢化可的松原料和药品中氢化可的松的检测方法，主 要有荧光光度法、分光光度法、褶合光谱法、双波长分光光度法、三波长分光光度法、薄层色谱法、高效 液相色谱法等。荧光光度法虽然灵敏度高，但反应时间较长，操作繁琐；分光光度法呈色反应的时间和温 度影响较大，致使方法的重复性较差；褶合光谱法、双波长分光光度法、三波长分光光度法容易受基质成 分的干扰；薄层色谱法可以用来进行定性检测，不适用于定量检测；高效液相色谱方法是近几年检测氢化 可的松较常用的方法，但也仅仅局限于原料药和各种药品制剂中含量的检测，由于药品组分较少，基质简 单，干扰因素较少，且样品预处理简单目标检测物损失小，因此药品中氢化可的松的含量容易检测。而化 妆品、饲料、肉类中的氢化可的松含量的检测国家还没有制定相关的检测标准和方法，并且到目前为止化 妆品中氢化可的松的检测也没有相关的文献报道。与药品不同，化妆品种类繁多有膏、霜、乳、粉、水、 啫喱、凝胶等多种剂型，并且基质复杂，各成分的理化性质差别较大，干扰因素较多，尤其是氢化可的松 作为化妆品禁用成分添加到化妆品中，其含量较低，用上述的荧光光度法、分光光度法、薄层色谱法等光 学分析方法很难准确的检测出化妆品中微量的氢化可的松成分。因此，针对现有氢化可的松检测技术上的 不足，我们设计了一种用高效液相色谱方法检测化妆品中氢化可的松的方法，该方法操作简单，专属性好， 灵敏度高，且适宜化妆品中氢化可的松的微量检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测化妆品中氢化可的松的分析方法，该项技术利用高效液相色谱仪不仅可 以对化妆品中的氢化可的松进行准确的定性分析，而且还可以进行微量的定量分析。
本发明是用一定浓度的甲醇一盐酸混合液或乙腈_盐酸混合液提取化妆品中的氢化可的松，然后将提 取液过滤，滤除固体杂质，直至滤液澄清，取制备好的样液上机，用甲醇一水溶液或乙腈一水溶液进行洗
脱分离。所用高效液相色谱仪的主要配置包括十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱或C8柱、二极管 阵列检测器或紫外检测器。
本发明方法的主要分析步骤如下
1样品预处理
称取一定量的化妆品(乳、膏、霜或水剂)于10ml刻度离心管中，加入4一7ml提取液(甲醇0. 01 1. 00mol/ml盐酸-20 80X : 80 20%或乙腈0. 01 1. 00mol/ml盐酸=20 80% : 80 20%)，涡旋混 匀使基质充分分散，定容至刻度，再超声提取15—30min，将提取液转移至Eppendorf管中冰浴30min使 基质析出，12000rpm/min离心5min，如果有必要可以再用0. 45 u m滤膜过滤。
2色谱条件
(1) 色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的反相色谱柱C18或C8柱；
(2) 检测器紫外检测器或二极管阵列检测器；
(3) 检测波长选用190-380nm波K:作为检测波长；
(4) 流动相釆用甲醇水=20 80% : 80 20%或乙猜水=20 80% : 80 20%混合液作为流 动相，平衡色谱柱约20min，使基线平稳，该条件下保留时间适合，峰形对称，分离度好(R〉1.5)。
(5) 流速0,5 1. 5ml/niin;
(6) 柱温15 35°C。 3浓度计算方法
用氢化可的松标准物质配制成一定梯度浓度的标准液，取20^il进样，按外标法，以峰面积一浓度作 线性回归，得出线性回归方程，利用该方程和样品中氢化可的松的峰面积计算样品中的氢化可的松含量。 4样品检测
(1) 按照l中的方法进行样品预处理，取处理好的样品20(11进样；然后再取适当浓度的氢化可的松 标准溶液20nl进样。
(2) 依照2中的检测条件进行检测，分别得到样品的色谱图和氢化可的松标准品的色谱图；将样品 的色谱图和标准品的色谱图进行比较，样品色谱图中与标准品保留时间相近(误差范围:标准品保留时间± 0.5分钟)的色谱峰即为相应的氢化可的松成分，为了确保检测结果的准确性，可对初步确定的色谱峰进行 光谱分析(光谱分析仅适用于二极管阵列检测器)，若与标准品的最大吸收波长及光谱图特征相似，可进 一步确定样品中的氢化可的松成分。
(3) 将样品中氢化可的松的色谱峰面积带入3中的线性回归方程中，计算样品中氢化可的松的浓度。 由于化妆品种类繁多、基质复杂，不能完全排除干扰成分与氢化可的松在同一时间出峰的可能。釆用
—极管阵列检测器可获得氢化可的松的紫外吸收光谱图，与标准品的光谱图对照，通过分析二者的最大吸 收波长和光谱图特征，可进一步进行确认。
本发明的分析方法准确、简便、快捷，灵敏度髙，选择性、重复性好，适用于任何膏霜剂、乳剂、及 水剂等各种剂型的化妆品。
图1样品色谱图
图2氢化可的松标准品色谱图
图3样品光谱图
图4氢化可的松标准品光谱图
图5氢化可的松标准曲线图
具体实施例方式
下面结合具体实施实例对本发明作进一步的阐述，但不限制本发明
1材料 1.1仪器
岛津自动进样高效液相色谱系统Hypersil-ODS (150mmx4.6mm， 5pm,柱号E1720574)色谱柱， SPD-M20A紫外可见光检测器，SPD-M20A 二极管阵列检测器，LC-20AB 二元高压梯度泵，SlL-20A自动进 样系统，CTO-20A柱温箱及LCSolution色谱工作站。
1. 2试剂和样品
无水甲醇(色谱纯)为Merck公司产品；盐酸(优级纯)为天津科密欧试剂厂产品；超纯水由Milli-Q system制取。
氢化可的松标准品购于中国药品生物制品检定所，批号为100152-200206。 供试样品为快速祛痘修复菁华。
1. 3标准品储备液
精密称取50.00mg氢化可的松标准品置于5(kl容量瓶中，加少许无水甲醇溶解，并用甲醇定容至刻 度，摇匀，配制成浓度为lmg/ml的标准液作为储备液，于4'C冰箱中存放备用。 2方法
2. 1色谱条件
色谱柱Shim-packVP-ODS (150mmx4.6mm， 5pm)
检测器SPD-M20A二极管阵列检测器
流动相采用甲醇水=60% : 40%混合液作为流动相，使用该比例的流动相峰性对称，分离度好。 检测波长245nm。经190-400nm波长扫描，氢化可的松在245nm附近有最大吸收，故选择245nm作
为检测波长。 流速lml/min 柱温25°C 2. 2样品预处理
称取1.00g的化妆品(快速祛痘修复菁华)于10ml刻度离心管中，加入5ml无水甲醇，涡旋混匀使 基质充分分散，再超声提取20min,将提取液转移至Eppendorf管中冰浴30min， 12000rpm/min离心5min， 如果有必要可以再用0. 45拜滤膜过滤，制成供试样品溶液。
2. 3样品检测
取20pl供试液进样，利用2.1中的色谱条件进行检测，获得样品的色谱图(图l)和光谱图(图3); 再取1.3中的氢化可的松标准品储备液稀释至为50pg/nil浓度，2(^1进样，同样检测条件下，得到氢化可 的松标准品的色谱图(图2)和光谱图(图4)。
2.4标准曲线
用无水甲醇将氢化可的松储备液稀释成如下梯度浓度的标准系列5叫/ml、 1(Hig/ml、 25吗/ml、 50ng/ml、 75pg/ml、 100pg/ml,取各浓度的标准溶液20nl进样，得到各浓度的峰面积(见表O，作峰面 积一浓度标准曲线(见图5),得到其线性回归方程(由高效液相色谱工作站完成计算工作)。
回归方程A(axea) =112504046666R2=0. 9999
表1氢化可的松标准曲线各点浓度及峰面积
标曲各点浓度 ((ig/ml)峰面积 (mm2)标准曲线公式
5550381. 7
101128761. 3
252701830. 2
505544948. 1A(area)=U2504 C-46666 (R2=0. 9999)
758375942. 2
10011241634. 3
3结果分析
由氢化可的松标准品的色谱图(图2)可以看出，利用2.1中的色谱检测条件得到氢化可的松标准品 的保留时间为7.538min，将样品的色谱图(图l)和标准品的色谱图(图2)进行比较，可见样品色谱图中在 7. 515min处有一色谱峰与氢化可的松标准品色谱峰的保留时间7. 538min相近，误差在土O. 5分钟范围之 内，因此可以初步确定样品色谱图中7.515min处的色谱峰为氢化可的松，该峰面积为955842. 2min2。将样 品色谱图中7.515min处峰的光谱图(图3)与氢化可的松标准品的光谱图(图4)进行对比，可以发现样 品的光谱图与标准品的光谱图的最大吸收波长相近，并且光谱图特征相似，可进一步确定样品屮保留时间 为7. 515min的组分为氢化可的松。
将样品中氢化可的松的色谱峰面积955842. 2咖2代入线性回归方程中，即可得到样品处理液中氢化可 的松的含量为8.91叫/ml (由髙效液相色谱工作站完成计算工作)，经计算可得快速祛痘修复菁华样品中氢 化可的松的含量为0. 0891mg/kg。
该发明具有高分辨率，高灵敏度，重现性、选择性好，专属性强，且样品预处理方法简单的特点，适 宜化妆品中氯化可的松的定性、定量分析。
本发明以火量实验和理论分析，找到了一种利用高效液相色谱仪检测化妆品中氢化可的松的分析方 法，填补了化妆品中氢化可的松液相色谱分析方面的研究空白。
权利要求
1一种化妆品中氢化可的松的高效液相色谱检测方法，其特征在于采用紫外检测器或二极管阵列检测器，以外标法定量，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱或C8柱，以甲醇-水混合液或乙腈-水混合液为流动相，采用190-380nm的检测波长，采用甲醇-盐酸混合液或乙腈-盐酸混合液溶解样品，超声萃取，0.45μm滤膜过滤。
全文摘要
本发明是一种采用高效液相色谱仪检测化妆品中氢化可的松的分析方法。其特点在于采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C8柱或C18柱；二极管阵列检测器或紫外检测器在190-380nm处进行检测；流动相采用甲醇-水混合液或乙腈-水混合液；样品经甲醇-盐酸混合液或乙腈-盐酸混合液萃取，超声提取10-30min，再冰浴30min，然后12000rpm/min高速离心5min，取上清备用，如果有必要，可再用0.45μm滤膜过滤后使用；根据样品的保留时间和光谱图进行定性分析，根据其峰面积进行定量分析。该发明的优点在于分辨率、灵敏度高，重现性、选择性好，样品预处理方法简单，适宜化妆品中氢化可的松的微量分析。
文档编号G01N30/00GK101169395SQ20071002792
公开日2008年4月30日 申请日期2007年5月10日 优先权日2007年5月10日
发明者郑伟东 申请人:广东省保化检测中心有限公司