专利名称：毛发中氢化可的松的提取和检测方法
技术领域：
本发明是提取、检测毛发中氢化可的松的新技术，属于临床医学分析的技术领域。
背景技术：
肾上腺皮质激素氢化可的松是维持生命的必需激素，体内其含量的多少对物质代 谢、血管反应、神经系统、泌尿系统及消化系统的功能有不同程度的影响；氢化可的松反映 了下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(HPA)的活性，若肾上腺皮质激素水平低下，人体对外来损 伤性剌激或剧烈环境变化的适应能力将大大降低。此外，氢化可的松是一种非常重要的肾 上腺皮质激素，是心理应激反应的一个重要生物指针，已成为评价心理应激的一个重要指 标。因此，氢化可的松水平在临床医学和心理健康评测等领域是一种重要的生化指标。
实施检测时，通常是测定血清或血浆中氢化可的松的含量；血样的采取需要静脉 穿剌，往往会产生额外的应激，可能影响结果的可靠性。尿液、粪便或唾液取样时，则能避免 上述所述额外产生的应激。尿液中氢化可的松的分析在内分泌学中运用很广泛；近年来粪 便中氢化可的松的分析也广泛运用在动物实验中；唾液中氢化可的松分析在人类应激研究 中很有价值，有时候也在动物实验中运用。 尽管从血液、唾液、粪便和尿液中分析氢化可的松都在各自的领域有各自的应用 价值，但都有各自的局限性。血液和唾液中的氢化可的松只反应了某个时间点(时刻)的 水平，它们很容易受生理节律、采样的时间、摄食时间和其它环境因素所干扰；尿液和粪便 中的氢化可的松反映一段较长时间内的下丘脑_垂体_肾上腺皮质轴的活性(例如，尿液 反映24小时)。如果要反映一个个体的长期状况，实验者还需要对同一个体进行重复采样。
测量毛发中的氢化可的松克服了上述的局限性。毛发中氢化可的松含量比较稳 定，能够反应一段时间内内在的糖皮质激素的含量变化(如可以反映长时期所处的慢性心 理压力状态)。毛发中的氢化可的松来源于血液，血液中的游离氢化可的松从毛细血管扩散 进入到毛囊中，然后在毛干中固化下来。毛发中所测定的类固醇的含量是没有粘附蛋白的、 游离的氢化可的松含量。 当前氢化可的松主要的检测方法有高效液相色谱法(HPLC)，免疫法和色谱_质谱 联用法(LC-MS) 。 HPLC法多见于血液、尿液和唾液中氢化可的松的测定，毛发中氢化可的松 的检测多使用色谱-质谱联用法(LC-MS)。 LC-MS虽然准确灵敏但需要昂贵的仪器，故难以 普及；HPLC法虽然无需复杂昂贵的仪器，灵敏度也较高，但目前还只是停留在血液、尿液和 唾液中的测定，没有应用到检测毛发中氢化可的松的报道。于是我们准备建立起一种基于 高效液相色谱_荧光检测器(HPLC-FLU)，以检测毛发为基础的检测方法。
发明内容
技术问题本发明的目的是利用高效液相色谱_荧光检测技术结合而建立的毛发
中氢化可的松的提取和检测方法，该方法简单、经济、准确性好。
技术方案本发明的毛发中氢化可的松的提取和检测方法具体如下
3
a.毛发中氢化可的松的提取 取毛发，在室温下用有极性的低分子有机溶剂清洗，清洗后用球磨机研磨；取研磨 后的毛发粉末，加入中性或酸性含水溶液，在30-6(TC条件下孵化4-24h ;孵化完毕后将孵 化溶液离心，取上清液，用乙酸乙酯从中萃取出氢化可的松，再将乙酸乙酯层，用纯^吹干，
b.毛发中氢化可的松的检测 将上述吹干后的物质，用体积比为50 : 50 90 : IO的强硫酸乙醇溶液在 50-90°C的高温条件下衍生l-10min，然后加入水阻止衍生反应，放入到冰箱中；等衍生物 质冷却l-30min后取出，向其中加入10-2000ng/ml荧光素溶液作为内标，混匀后注入到 SPE C18柱中；使用商业化的固相萃取C18柱SPE前，先用甲醇活化，然后用水洗，上述样品 洗完后依次用体积比为l : 9-5 : 5丙酮/去离子水、去离子水和正己烷冲洗，然后干燥 10-60min，再用甲醇洗脱；最后将得到的洗脱液蒸发至干，再重新用甲醇溶解，用以高效液 相色谱分析； 用高效液相色谱将其分离，并使用荧光检测器进行检测，用内标法对毛发中的氢 化可的松定量检测，使用高效液相色谱得到的图谱，内标峰的滞留时间在4. 5-12. 5分钟， 目标峰的滞留时间在5. 5-15. 5分钟，和干扰峰完全分开；
c)用荧光检测器检测的色谱条件
色谱柱C18色谱柱； 流动相体积比为50 : 50-80 : 20的甲醇水，其中每100ml流动相含0. 1-1. Og
乙酸铵，用磷酸调节该溶液的pH = 5. 0，用0. 22 ii m的微孔滤膜过滤， 超声脱气；流速0. 5-1. 25ml/min ;检测波长荧光激发光波长为360nm，发射光波长为480nm ;
进样量2-20 ill;
柱温25-40。C。
有益效果本方法可用于毛发中氢化可的松的提取和检测。 加标回收实验，回收率为102. 5% ±13.0%;提取回收率为103. 3% ±5. 2%;日内 标准偏差小于7. 3% ;日间标准偏差小于8. 5% 。证明本检测技术是准确的，可靠的。
图1是人类头发中氢化可的松的高效液相色谱_荧光检测图谱。
具体实施方式
1试剂 实验过程中所使用的水都是三蒸水。甲醇、乙醇、硫酸和乙酸乙酯从中国江苏淮阴 化学药品研究所购买，都是高效液相色谱纯。氢化可的松标准样品从美国Sigma公司购买。 荧光素钠从中国上海化学试剂厂购买。固相萃取C18柱从美国Dikma公司购买。
2仪器 高效液相色谱系统由日本岛津LC-20A泵和岛津荧光检测器RF-10AXL组成。数据 分析使用随机附带的岛津高效液相色谱软件包。实验使用的色谱柱为VP-ODSDikma C18，
4(5iim，250mmX4. 6mm)。研磨毛发使用的球磨机为(匪400type，Retsch，Germany)。流动相
的PH值用Orion model SA 720PH计测定(OrionResearch Incorporated, USA)。目标化
合物的激发光和发射光的波长分别为360和480nm。流速为1. Oml/min。所有的测定操作
都在室温下进行。 3方法 1)毛发的采集 尽量贴近皮肤的剪取长度大于lcm长的毛发，在室温下保存于干燥的软管中。
2)毛发中氢化可的松的提取，包括清洗、孵化、液相萃取
2-1)清洗 由于类固醇在有极性的低分子有机溶剂(如甲醇)中易溶，为清洗掉毛干外的氢 化可的松和类固醇等干扰物，取适量(如100mg)的毛发在室温下用适量(如3-7ml)的低 分子有极性的有机溶剂清洗多次(如两次)，每次l-10min。使用超声协助清洗时，可适当 縮短清洗次数和实践。清洗过的头发晾干后用球磨机研磨。
2-2)孵化 尽管类固醇微溶于水，但水更容易渗入到毛发内层。为将毛干内更多的类固醇萃 取出来，在含水溶液中孵化。称取适量(如50mg)的毛发粉末，置于中性或酸性含水溶液 (如磷酸缓冲液或lml 0. 1M HC1)，在30-60。C条件下孵化4-24h。
2-3)液相萃取 孵化完毕后，将上述孵化溶液离心，取上清液；用乙酸乙酯从中萃取出氢化可的 松，再将乙酸乙酯层，用纯^吹干。 3)毛发中氢化可的松的检测，包括提取产物的衍生、固相萃取、高效液相色谱分
离、使用荧光检测器检测。 3-1)头发中提取产物的衍生 将上述吹干后的物质(即上述从头发中提取的氢化可的松)，用适量(如50iiL) 的强硫酸乙醇溶液(如体积比70/30硫酸/乙醇溶液)在高温(如70°C)条件下衍生 l-10min，然后加入100-900 ii L的水阻止衍生反应，放入到冰箱中。
3-2)固相萃取 等上述衍生物质冷却l-30min后取出，向其中加入30-100 y L的10-2000ng/ml荧 光素溶液作为内标，混匀后注入到固相萃取C18柱中。使用商业化的固相萃取C18柱SPE 前，先用适量(如3ml)的甲醇活化，然后用适量(如3ml)的水洗。上述样品流完后，依次 用适量(如lml)的适当体积比(如2 : 8)的丙酮/去离子水，用适量(如lml)的去离子 水和用适量(如lml)的正己烷冲洗，然后干燥10-60min，再用100-2000 y L的甲醇洗脱。 最后将得到的洗脱液蒸发至干，再重新用30-100 ii L的甲醇溶解，用以高效液相色谱分析。
3-3)高效液相色谱分离 毛发经过孵化和衍生得到的溶液中有许多干扰物，必须经过分离才能被准确检 测。本发明用高效液相色谱将其分离，并使用荧光检测器进行检测，用内标法对毛发中的氢 化可的松定量检测。使用高效液相色谱得到的图谱，内标峰的滞留时间在4. 5-12. 5分钟， 目标峰的滞留时间在5. 5-15. 5分钟，和干扰峰完全分开。
3-4)用荧光检测器检测的色谱条件
色谱柱C18色谱柱； 流动相体积比为50 : 50-80 : 20的甲醇水，其中每100ml流动相含O. 1-1. Og 乙酸铵，用磷酸调节该溶液的PH = 5. O，用0. 22 m的微孔滤膜过滤，超声脱气；
流速0. 5-1. 25ml/min ;检测波长荧光激发光波长为360nm，发射光波长为480nm ;
进样量2-20 ill;
柱温25-40。C。
实例 32个汉族正常人头发中氢化可的松的检测
—、毛发中氢化可的松的提取 每次取约lOOmg的头发在室温下用5ml的甲醇清洗两次(每次2min)，然后用球磨 机研磨。称取50mg的头发粉末，加入1ml 0. 1M HC1，在4(TC条件下孵化16h。孵化完毕后 将孵化溶液离心，取上清液，用乙酸乙酯从中萃取出氢化可的松，再将乙酸乙酯层用纯^吹干。 二、毛发中氢化可的松的衍生、分离和荧光检测 吹干后的物质用50 ii L的硫酸/乙醇溶液(体积比70/30)在7(TC条件下衍生 2min，然后加入500 y L的水阻止衍生反应，放入到冰箱中。等衍生物质结冰lOmin后取出， 向其中加入50 ii L的1000ng/ml荧光素溶液作为内标，混匀后注入到SPE C18柱中(使用 商业化的SPE C18前，先用3ml的甲醇活化然后用3ml的水洗)。样品流完后依次用lml的 2 : 8(v/v)丙酮/去离子水，lml的去离子水和lml的正己烷冲洗，然后干燥30min，再用 500 L的甲醇洗脱。最后将得到的洗脱液蒸发至干，再重新用50 L的甲醇溶解，用以高效 液相色谱分析。 使用迪马C18色谱柱(4. 6X250mm，5iim)，使用流动相为60 : 40 (V : V)甲醇 水，其中每100ml流动相溶液含0. 5g乙酸铵，pH = 5. 0 (用磷酸调节)，用0. 22 y m的微孔 滤膜过滤，超声脱气，流速为1. Oml/min ;柱温3(TC ;荧光检测器的检测波长为荧光激发光 波长为360nm，发射光波长为480nm ;进样量为20 yl。 得到的图谱中，内标峰在11. 2分钟出现，目标峰在12. 8分钟出现，见附图1。
三、标准曲线的绘制。 取标准储备液用甲醇倍比稀释配成终浓度lng/ml、2ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、 50ng/ml、100ng/ml的系列浓度标准溶液。取磨碎的头发50mg，分别加入上列浓度氢化可的 松系列标准溶液50iil，混匀，放入5(TC孵育14小时。经过以上步骤的处理后，用取样针量 取20iU洗脱液进样分析。 在2-100ng/ml范围内，以氢化可的松浓度为横坐标，样品峰/内标色谱峰面积比 为纵坐标进行线性回归分析，得回归方程为y = 0. 009x+0. 0324 (r = 0. 9996)。
四、计算 经换算得32个汉族正常人头发中氢化可的松的含量为3. 28-24. 83pg/mg。做加标 回收实验，回收率为102.5±13.0%;提取回收率为103.3% ±5.2%;日内和日间精密度分 别为7. 3%和8. 5%。
权利要求
一种毛发中氢化可的松的提取和检测方法，其特征在于该方法为a.毛发中氢化可的松的提取取毛发，在室温下用有极性的低分子有机溶剂清洗，清洗后用球磨机研磨；取研磨后的毛发粉末，加入中性或酸性含水溶液，在30-60℃条件下孵化4-24h；孵化完毕后将孵化溶液离心，取上清液，用乙酸乙酯从中萃取出氢化可的松，再将乙酸乙酯层，用纯N2吹干，b.毛发中氢化可的松的检测将上述吹干后的物质，用体积比为50∶50～90∶10的强硫酸乙醇溶液在50-90℃的高温条件下衍生1-10min，然后加入水阻止衍生反应，放入到冰箱中；等衍生物质冷却1-30min后取出，向其中加入10-2000ng/ml荧光素溶液作为内标，混匀后注入到SPE C18柱中；使用商业化的固相萃取C18柱SPE前，先用甲醇活化，然后用水洗，上述样品洗完后依次用体积比为1∶9-5∶5丙酮/去离子水、去离子水和正己烷冲洗，然后干燥10-60min，再用甲醇洗脱；最后将得到的洗脱液蒸发至干，再重新用甲醇溶解，用以高效液相色谱分析；用高效液相色谱将其分离，并使用荧光检测器进行检测，用内标法对毛发中的氢化可的松定量检测，使用高效液相色谱得到的图谱，内标峰的滞留时间在4.5-12.5分钟，目标峰的滞留时间在5.5-15.5分钟，和干扰峰完全分开；c)用荧光检测器检测的色谱条件色谱柱C18色谱柱；流动相体积比为50∶50-80∶20的甲醇∶水，其中每100ml流动相含0.1-1.0g乙酸铵，用磷酸调节该溶液的pH＝5.0，用0.22μm的微孔滤膜过滤，超声脱气；流速0.5-1.25ml/min；检测波长荧光激发光波长为360nm，发射光波长为480nm；进样量2-20μl；柱温25-40℃。
全文摘要
毛发中氢化可的松的提取和检测方法可用于毛发中氢化可的松的提取和检测。加标回收实验，回收率为102.5％±13.0％；提取回收率为103.3％±5.2％；日内标准偏差小于7.3％；日间标准偏差小于8.5％。证明本检测技术是准确的，可靠的。其方法具体为a.毛发中氢化可的松的提取，b.毛发中氢化可的松的检测，c)用荧光检测器检测的色谱。
文档编号G01N1/28GK101726551SQ20091023427
公开日2010年6月9日 申请日期2009年11月16日 优先权日2009年11月16日
发明者皋伟, 谢巧珍, 邓慧华, 陆祖宏 申请人:东南大学