专利名称：化妆品中克林霉素的高效液相色谱检测方法
技术领域：
本发明是一项利用高效液相色谱仪检测化妆品中克林霉素的新技术，尤其适用于化妆品中微量抗生素 -克林霉素的定性及定量分析。
背景技术：
克林霉素(Clindamycin)为大环内酯类抗菌药物，作为一种广谱高效的抗菌药物被广泛应用到药品、饲 料、和化妆品中。克林霉素对厌氧性菌有较强的抑制作用；对敏感革兰阳性菌也有相当的抑制作用。由于 其广谱高效的抑菌作用，克林霉素被一些化妆品生产厂家，添加到祛痘类产品以达到消炎、祛痘、除螨及 抗粉刺的目的。但这种药物同时也存在着很多不良反应，如容易引起伪膜性肠炎，容易导致肠道菌群失 调，对神经肌肉有阻滞作用，并且克林霉素耐药性在国内外都已比较明显，不利人类疾病的治疗。因此， 为保护化妆品消费者的健康安全，建立灵敏、准确、快速的化妆品中克林霉素的检测方法是十分紧迫和必 要的。
目前药品中克林霉素的检测方法主要有微生物检定法、紫外分光光度法、气相色谱法、旋光法、毛细 管电泳高频电导法、线性扫描伏安法。微生物检定法是《中国药典》(1990年版)规定的检测药品中克林 霉素的方法，该方法周期长，操作繁琐，影响因素较多，灵敏度低，很难反映样品中克林霉素的真实浓度。 紫外分光光度法、气相色谱法虽然灵敏度高，但这两种方法都需要油水两相萃取分离，操作繁琐，目标成 分损失较大，不利于微量组分的检测。旋光法对环境条件要求较高，特别是温度的变化对其影响较大。毛 细管电泳高频电导法和线性扫描伏安法灵敏度低，但步骤复杂，影响因素较多，重现性较差。高效液相色 谱方法是目前检测克林霉素药品较常用的方法，但也仅仅局限于各种克林霉素药品制剂的含量检测，而化 妆品、饲料、肉类中的克林霉素含量的检测还没有出台相关的标准或方法，由于药品组分较少，基质简单， 干扰因素较少，且样品处理简单，目标检测物损失小，因此药品中的克林霉素易于检测。与药品不同，化 妆品种类繁多，基质复杂，各成分的理化性质差别较大，干扰因素较多，尤其是克林霉素作为化妆品禁用 成分添加到化妆品中，其含量较低，以上所述各种方法很难准确的检测出化妆品中微量的克林霉素成分， 而且使用高效液相色谱检测化妆品中的克林霉素的方法还没有文献报道。针对以上现有技术的不足，我们 设计了一种用高效液相色谱方法检测化妆品中克林霉素的方法，该方法效率高，专属性好，灵敏度高，且 样品预处理简单。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测化妆品中克林霉素的分析方法，该项披术利用髙效液相色谱仪不仅可以 对化妆品中的克林霉素进行准确的定性分析，而且还可以进行微量的定量分析。
本发明是用无水甲醇或乙腈提取化妆品中的克林霉素，经超声萃取、离心、过滤等一系列操作，滤除 固体杂质，直至滤液澄清，取制备好的样液上机，用磷酸二氢铵一乙腈缓冲溶液或磷酸二氢铵一甲醇缓冲
溶液进行洗脱分离，在l恥一380nm波长下采集数据进行分析。所用高效液相色谱仪的主要配置包括十八 烷基硅烷键合硅胶为填充剂的反相色谱柱C8或C18柱、紫外检测器或二极管阵列检测器。
本发明方法的主要分析步骤如下.-
1样品预处理
称取一定量的化妆品(乳、膏、霜或水剂)于10ml刻度离心管中，加入4一7ml无水乙腈或甲醇(与 流动相保持一致)，涡旋混匀使基质充分分散，定容至刻度，再超声提取15 — 30min，将提取液转移至 E卯endorf管中，12000rpm/min离心5min，如果有必要可以再用0. 45 u m滤膜过滤。
2色谱条件
(1) 色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的反相色谱柱C8或C18柱；
(2) 检测器紫外检测器或二极管阵列检测器；
(3) 检测波长选用190-380nm波长作为检测波长；
(4) 流动相釆用0.01—0.50mol/L磷酸二氢铵溶液(用三乙胺调节pH值为4.0—8.0):乙腈=40 80% : 60 20%缓冲溶液或0. Ol—O. 50mol/L磷酸二氢铵溶液(用三乙胺调节pH值为4. 0_8. 0):甲醇 =40 80% : 60 20%缓冲溶液作为流动相，平衡色谱柱约20min,使基线平稳，该条件下保留时间适合， 峰形对称，分离度好(R〉1.5)。
(5) 流速0. 5 1. 5ml/min;
(6) 柱温15 35°C。 3浓度计算方法
用克林霉素标准物质配制成一定梯度浓度的标准液，体积进样，按外标法，以峰面积一浓度作 线性回归，得出线性回归方程，利用该方程和样品中克林霉素的峰面积计算样品中的克林霉素含量。 4样品检测
(1) 按照l中的方法进行样品预处理，取处理好的样品2(^1进样；然后再取适当浓度的克林霉素标 准溶液2(^1进样。
(2) 依照2中的检测条件进行检测，分别得到样品的色谱图和克林霉素标准品的色谱图；将样品的 色谱图和标准品的色谱图进行比较，样品色谱图中与标准品保留时间相近(误差范围标准品保留时间土 0.5分钟)的色谱峰即为相应的克林霉素成分，为了确保检测结果的准确性，可对初步确定的色谱峰进行光 谱分析(光谱分析仅适用于二极管阵列检测器)，若与标准品的最大吸收波长及光谱图特征相似，可进一 步确定样品中的克林霉素成分。
(3) 将样品中克林霉素的色谱峰面积带入3中的线性回归方程中，计算样品中克林霉素的浓度。 由于化妆品种类繁多、基质复杂，不能完全排除干扰成分与克林霉素在同一时间出峰的可能。采用二
极管阵列检测器可获得克林霉素的紫外吸收光谱图，与标准品的光谱图对照，通过分析二者的最大吸收波 长和光谱图特征，可进一步进行确认。
本发明的分析方法准确、简便、快捷，灵敏度高，选择性、重复性好，适用于任何膏霜剂、乳剂、及 水剂等各种剂型的化妆品。
图1样品色谱图
图2克林霉素标准品色谱图
图3样品光谱阁
图4克林霉素标准品样品光谱图
图5克林霉素标准曲线图
具体实施例方式
下面结合具体实施实例对本发明作进一步的阐述，但不限制本发明 1材料 1. 1仪器
岛津自动进样高效液相色谱系统Hypersil-ODS (150mmx4.6mm， 5nm，柱号E1720574)色谱柱， SPD-M20A紫外可见光检测器，SPD-M20A 二极管阵列检测器，LC-20AB 二元高压梯度泵，SIL-20A自动进 样系统，CT0"20A柱温箱及LCSolution色谱工作站。
1. 2试剂和样品
乙腈(色谱纯)、无水甲醇(色谱纯)为Merck公司产品；磷酸二氢铵(分析纯)、三乙胺(分析纯) 为天津科密欧试剂厂产品；超纯水由Milli-Q system制取。
克林霉素标准品购于中国生物制品检定所，批号为130422-200404。
供试样品为抗痘清新冰妍啫喱。
1. 3标准品储备液
精密称取100. 00fflg克林霉素标准品置于50ml容量瓶中，加少许无水甲醇溶解，并用甲醇定容至刻度， 摇匀，配制成浓度为2mg/ml的标准液作为储备液，于4'C冰箱中存放备用。 2方法
2. 1色谱条件
色谱柱Shim-packVP-ODS (150mmx4.6mm, 5jim) 检测器SPD"M20A 二极管阵列检测器
流动相采用0.05mol/L磷酸二氢铵溶液(用三乙胺调节pH值为6.30):乙腈=60: 40，磷酸二氢 铵溶液一 乙腈缓冲体系的基线噪音比磷酸二氢铵溶液一甲醇的基线噪音小，且在pH值为6. 30 时峰性对称，分离度好。
检测波长210nm。经190-400波长扫描，克林霉素在197ran附近有最大吸收，考虑到197nm接近末 端吸收,溶剂吸收较强,干扰较大,而210nm波长处溶剂吸收相对较小,故选择210nm作为检测 波长。
流速lml/min
柱温25。C
2. 2样品预处理 称取l.OOg的化妆品(抗痘清新冰妍啫喱)于10ml刻度离心管中，加入5ml无水甲醇，涡旋混匀使 基质充分分散，再超声提取20inin，将提取液转移至Eppendorf管中'12000rpm/min离心5min'如果有必 要可以再用0. 45 u m滤膜过滤，制成供试样品溶液。
2. 3样品检测
取20nl供试液进样，利用2.1中的色谱条件进行检测，获得样品的色谱阁(阁l)和光谱图(图3); 再取1.3中的克林霉素标准品储备液稀释至为5jxg/ml浓度，2(^1进样，同样检测条件F，得到克林霉素标 准品的色谱图(图2)和光谱图(图4)。
2.4标准曲线
用无水甲醇将克林霉素储备液稀释成如下梯度浓度的标准系列5ng/ml、l(Vg/nil、20ng/nil、5(Hig/ral、 iOOHg/ml、 200jig/ml、 5(KHtg/tn1,取各浓度的标准溶液20fil进样，得到各浓度的峰面积(见表l)，作峰 面积一浓度标准曲线(见图5),得到其线性回归方程(由高效液相色谱工作站完成计算工作)。
冋归方程A(area)=3.6383 C+5. 7668R2=0. 9999
表1克林霉素标准曲线各点浓度及峰面积
标曲各点浓度 (jig/ml)峰面积 (mmO标准曲线公式
520. 3059
1038. 2943
2077.1244
50188. 2844A (area) =3. 6388 C+5. 7668 (R2=0.9999)
100373.2703
200742. 2076
500l咖.7863
3结果分析
由克林霉素标准品的色谱图(图2)可以看出，利用2. 1中的色谱检测条件得到克林霉素标准品的保 留时间为8.376min,将样品的色谱图(图l)和标准品的色谱图(图2)进行比较，可见样品色谱图中在 8. 284min处有一色谱峰与克林霉素标准品色谱峰的保留时间8. 376min相近，误差在土O. 5分钟范围之内， 因此可以初步确定样品色谱图中8.284min处的色谱峰为克林霉素，该峰面积为388.2816咖2。将样品色谱 图中8.284min处峰的光谱图(图3)与克林霉素标准品的光谱图(图4)进行对比，可以发现样品的光谱 图与标准品的光谱图的最大吸收波长及光谱图特征均相似，可进一步确定样品中保留时间为8.284min的 组分为克林霉素。
将样品中克林霉素的色谱峰面积388.2816咖2代入线性回归方程中，即可得到样品处理液中克林霉素 的含量(由高效液相色谱工作站完成计算T.作)，经计算可得抗痘清新冰妍啫喱样品中克林霉素得含量为 0. 11fflg/g。
该发明具有高分辨率，高灵敏度'重现性、选择性好且样品预处理方法简单的特点，适宜化妆品中克
林霉素的定性、定量分析。
本发明以大量实验和理论分析，找到了一种利用高效液相色谱仪检测化妆品中克林霉素的分析方法， 填补了化妆品中克林霉素液相色谱分析方面的研究空白。
权利要求
1一种化妆品中克林霉素的高效液相色谱检测方法，其特征在于采用紫外检测器或二极管阵列检测器，以外标法定量，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱或C8柱，以磷酸二氢铵溶液-乙腈缓冲液或磷酸二氢铵溶液-甲醇缓冲液为流动相，采用180-380nm的检测波长，样品预处理采用无水甲醇或乙腈溶解样品，超声萃取，0.45μm滤膜过滤备用。
全文摘要
本发明是一种采用高效液相色谱仪检测化妆品中克林霉素的分析方法，其特点在于采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱或C8柱；使用紫外检测器或二极管阵列检测器在190-380nm处进行检测；流动相采用磷酸二氢铵溶液-乙腈缓冲液或磷酸二氢铵溶液-甲醇缓冲液；样品用无水甲醇或乙腈溶解萃取，经超声提取20min后，再12000rpm/min离心约5min，取上清液作为供试样液，如有必要可再用0.45μm滤膜过滤备用；根据样品的保留时间和光谱图进行定性分析，根据其峰面积进行定量分析。该发明的优点在于分辨率、灵敏度高，重现性、选择性好，样品预处理方法简单，适宜化妆品中克林霉素的微量分析。
文档编号G01N30/02GK101169394SQ20071002685
公开日2008年4月30日 申请日期2007年2月9日 优先权日2007年2月9日
发明者郑伟东 申请人:广东省保化检测中心有限公司