含鼠lgG2b抗体Fc标签的酵母表达载体及其构建方法
【专利摘要】本发明涉及一种含鼠lgG2b抗体Fc标签的酵母表达载体，包括鼠lgG2b抗体Fc段基因与毕赤酵母表达载体pPICZαA，鼠lgG2b抗体Fc段基因连接在毕赤酵母表达载体pPICZαA的NotⅠ酶切位点和XbaⅠ酶切位点之间，其中，鼠lgG2b抗体Fc段基因的序列为SEQ?ID?NO.1。上述表达载体表达得到的带有鼠Fc标签的融合蛋白易于纯化对小鼠无免疫原性或免疫原性很低、适用于小分子蛋白或多肽的表达等优点。此外，本发明还提供一种含鼠lgG2b抗体Fc标签的酵母表达载体的构建方法。
【专利说明】含鼠lgG2b抗体Fe标签的酵母表达载体及其构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种含鼠lgG2b抗体Fe标签的酵母表达载体及其构建方法。
【背景技术】
[0002]不管是制备单克隆抗体还是制备多克隆抗体，抗原的设计与制备都是非常重要的问题。设计或者制备得到不好的抗原有可能完全不能免疫出抗体来或者免疫出的抗体特异性和亲和力很差。常用的抗原形式包括:纯化的天然蛋白、纯化的重组蛋白、人工合成的多肽、小分子物质、组织或细胞成分。
[0003]天然蛋白结构完整，因此是很好的抗原，但是天然蛋白很难达到较高的纯度，而且对于含量很低的蛋白，很难分离到足够的蛋白。而为了制备特异针对某一抗原表位(抗原决定簇)的抗体，可以人工表位肽用于免疫，但是多肽分子一般8~20个氨基酸，分子量太小，很难引起机体的免疫反应，所以合成的多肽后需要与一个大的载体蛋白连接以增加其免疫原性。但是这种方法的成本较高且制备出的抗体亲和力较低。小分子物质，主要是小分子药物，分子量一般不超过lOOODa，小分子药物属于半抗原，也需要连接载体才能够进行免疫动物。有时候也可用从组织直接分离的细胞或体外培养的细胞进行免疫，完整的细胞具有更强的颗粒性和外源性，但是这种方法复杂，成本更高。
[0004]相对于上述几种常用的抗原形式，重组蛋白以其来源容易、制备简单、纯度较高，成为研究的热点。而且随着基因工程技术的迅速发展，重组蛋白的表达载体和纯化方式变得丰富多样。但是重组蛋白的表达载体通常需要带一段标签，如631\1^(3、1^?、？1&8等，用于后续表达的蛋白的鉴定和纯化，但是在免疫中动物体通常会产生这些标签的抗体，尤其对于大分子量的标签，而且重组蛋白表达载体还普遍存在表达水平低的问题。
【发明内容】
[0005]基于此，有必要提供一种表达水平较高的含鼠lgG2b抗体的Fe标签的酵母表达载体。
[0006]一种含鼠lgG2b抗体Fe标签的表达载体，包括鼠lgG2b抗体Fe段基因与毕赤酵母表达载体pPICZ α Α，所述鼠lgG2b抗体Fe段基因连接在所述毕赤酵母表达载体pPICZ a A的Not I酶切位点和Xba I酶切位点之间，其中，鼠lgG2b抗体Fe段基因的序列为SEQ IDN0.1。
[0007]由于毕赤酵母蛋白表达水平高，规模大小容易控制，成本低廉，操作简单，且本身分泌的蛋白水平低，有利于下游产品的分离纯化，因此可以作为外源基因的表达载体。而lgG2b是鼠体内含量较高的抗体亚型。因此，上述含鼠lgG2b抗体的Fe标签的表达载体具有较高的表达水平。
[0008] 且上述含鼠lgG2b抗体Fe标签的酵母表达载体能表达带有鼠Fe标签的融合蛋白，表达得到的带有鼠Fe标签的融合蛋白可直接用蛋白A或蛋白G进行纯化，纯化方法简单且获得的带有鼠Fe标签的融合蛋白纯度高；而且带有鼠Fe标签的融合蛋白可以直接免疫小鼠用于鼠单克隆抗体或多克隆抗体的制备，不用切除标签序列，因为Fe片段来自小鼠，对小鼠无免疫原性或免疫原性很低，不会产生与Fe标签的相应的抗体；同时还可以用抗小鼠IgG抗体的二抗对带有鼠Fe标签的融合蛋白进行检测，检测过程简单、结果可信度高。此外，带有鼠Fe标签的融合蛋白因Fe的二硫键作用形成二聚体，从而得到具有相对较大分子量的蛋白，提高了其稳定性和免疫原性，因此上述含鼠lgG2b抗体Fe标签的酵母表达载体特别适用于小分子蛋白或多肽的表达，克服小分子蛋白或多肽因分子量小而存在免疫原性低的问题。
[0009]一种含鼠lgG2b抗体Fe标签的酵母表达载体的构建方法，包括如下步骤:
[0010]提取小鼠脾脏的总RNA，并反转录合成cDNA第一条链；
[0011]以所述cDNA第一条链为模板、序列为SEQ ID N0.2的DNA链作为上游引物及序列为SEQ ID N0.3的DNA链作为下游引物进行PCR扩增，得到PCR产物，其中，上游引物的序列中含有Not I酶切位点，下游引物的序列中含有终止密码子与Xba I酶切位点；
[0012]分别用Not I酶与Xba I酶对毕赤酵母表达载体pPICZ a A与PCR产物进行双酶切反应，回收并纯化得到含鼠lgG2b抗体Fe段基因的酶切产物及毕赤酵母表达载体pPICZ α A的酶切产物；
[0013]采用DNA连接酶对回收并纯化的两种酶切产物进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5 α，用Zeocin的LB平板筛选，挑选单菌落后提取质粒经酶切鉴定和测序鉴定后得到所述含鼠lgG2b抗体Fe标签的酵母表达载体，其中，鼠lgG2b抗体Fe段基因连接在所述毕赤酵母表达载体P PICZ a A的Not I酶切位点和Xba I酶切位点之间，鼠lgG2b抗体Fe段基因的序列为SEQ ID N0.1。
[0014]上述构建方法首先从小鼠脾细胞中克隆鼠lgG2b抗体Fe段基因，然后将克隆得到的鼠lgG2b抗体Fe段基因插入毕赤酵母表达载体pPICZ a A的Not I酶切位点和Xba I酶切位点之间，得到含鼠lgG2b抗体Fe标签的酵母表达载体。该表达载体可表达带有鼠Fe标签的融合蛋白，此融合蛋白可直接免疫小鼠，不需要切除标签序列。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为一实施方式的含鼠lgG2b抗体Fe标签的酵母表达载体的构建方法的流程图。
[0016]图2为PCR扩增小鼠lgG2b Fe片段基因的电泳鉴定图；
[0017]图3为构建的酵母表达载体pPICZ a A-mFc进行双酶切的电泳鉴定图。
【具体实施方式】
[0018]下面主要结合附图及具体实施例对含鼠lgG2b抗体Fe标签的酵母表达载体及其构建方法作进一步详细的说明。
[0019]—实施方式的含鼠lgG2b抗体Fe标签的酵母表达载体,包括鼠lgG2b抗体Fe段基因与毕赤酵母表达载体PPICZ α Α,鼠lgG2b抗体Fe段基因连接在毕赤酵母表达载体pPICZ a A的Not I酶切位点和Xba I酶切位点之间，其中，鼠lgG2b抗体Fe段基因的序列为 SEQ ID N0.1。[0020]如图1所示，本实施方式的含鼠lgG2b抗体Fe标签的酵母表达载体的构建方法，包括如下步骤:
[0021]步骤SI 10，提取小鼠脾脏的总RNA，并反转录合成cDNA第一条链。
[0022]步骤S120，以cDNA第一条链为模板、序列为SEQ ID N0.2的DNA链作为上游引物及序列为SEQ ID N0.3的DNA链作为下游引物进行PCR扩增，得到PCR产物，其中，上游引物的序列中含有Not I酶切位点，下游引物的序列中含有终止密码子与Xba I酶切位点。
[0023]步骤S130，分别用Not I酶与Xba I酶对毕赤酵母表达载体pPICZ a A与PCR产物进行双酶切反应，回收并纯化得到含鼠lgG2b抗体Fe段基因的酶切产物及毕赤酵母表达载体pPICZ a A的酶切产物。
[0024]步骤S140，采用DNA连接酶(如T4DNA连接酶等)对回收并纯化的两种酶切产物进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5ci，用Zeocin的LB平板筛选，挑选单菌落后提取质粒经酶切鉴定和测序鉴定后得到含鼠lgG2b抗体Fe标签的酵母表达载体，其中，鼠lgG2b抗体Fe段基因连接在毕赤酵母表达载体pPICZ a A的Not I酶切位点和Xba I酶切位点之间，鼠lgG2b抗体Fe段基因的序列为SEQ ID N0.1。
[0025]构建表达载体的目的之一是为了表达蛋白，在本实施方式中，还包括用甲醇诱导得到的含鼠lgG2b抗体Fe标签的酵母表达载体表达带有鼠Fe (mouse Fe,简称mFc)标签的融合蛋白的步骤，具体为:将得到的含鼠lgG2b抗体Fe标签的表达载体，转化毕赤酵母GS115，当然，也可以转化毕赤酵母XS-33等表达宿主菌；然后用甲醇诱导表达带有鼠Fe标签的融合蛋白，并采用蛋白A 对得到的带有鼠Fe标签的融合蛋白进行纯化，当然，也可以采用蛋白G来进行纯化。
[0026]作为抗原的蛋白，其纯度都是越高越好。上述得到的带有鼠Fe标签的融合蛋白采用蛋白A来进行纯化后，具有高的纯度，实际应用价值大。
[0027]由于毕赤酵母蛋白表达水平高，规模大小容易控制，成本低廉，操作简单，且本身分泌的蛋白水平低，有利于下游产品的分离纯化，因此可以作为外源基因的表达载体。因此，上述含鼠lgG2b抗体的Fe标签的酵母表达载体具有较高的表达水平，且表达的蛋白具有易于纯化的优点。
[0028]且上述含鼠lgG2b抗体Fe标签的酵母表达载体能表达带有鼠Fe标签的融合蛋白，表达得到的带有鼠Fe标签的融合蛋白可直接用蛋白A或蛋白G进行纯化，纯化方法简单且获得的带有鼠Fe标签的融合蛋白纯度高；而且带有鼠Fe标签的融合蛋白可以直接免疫小鼠用于鼠单克隆抗体或多克隆抗体的制备，不用切除标签序列，因为Fe片段来自小鼠，对小鼠无免疫原性或免疫原性很低，不会产生与Fe标签的相应的抗体；同时还可以用抗小鼠IgG抗体的二抗对带有鼠Fe标签的融合蛋白进行检测，检测过程简单、结果可信度高。此外，带有鼠Fe标签的融合蛋白因Fe的二硫键作用形成二聚体，从而得到具有相对较大分子量的蛋白，提高了其稳定性和免疫原性，因此上述含鼠lgG2b抗体Fe标签的酵母表达载体特别适用于小分子蛋白或多肽的表达，克服小分子蛋白或多肽因分子量小而存在免疫原性低的问题。
[0029]且上述构建方法首先从小鼠脾细胞中克隆鼠lgG2b抗体Fe段基因，然后将克隆得到的鼠lgG2b抗体Fe段基因插入毕赤酵母表达载体pPICZ a A的Not I酶切位点和Xba I酶切位点之间，得到含鼠lgG2b抗体Fe标签的表达载体。该表达载体可表达带有鼠Fe标签的融合蛋白，此融合蛋白可直接免疫小鼠，不需要切除标签序列。
[0030]以下为具体实施例部分
[0031](1)提取小鼠脾脏的总RNA，并反转录合成cDNA第一条链
[0032]小鼠放血后，取新鲜的脾脏，切取50_100mg的组织置于培养皿中的滤网(100目)上，加入ImL的Trizol (—种总RNA抽提试剂)，用注射器的活塞挤压组织，去除大的组织团块后，用带枪头的移液枪吹打细胞数次使细胞裂解，将混合液转入一支洁净的无RNA酶的离心管中。室温静置5分钟使核蛋白复合物完全裂解。
[0033]向离心管中加入0.2mL氯仿，盖好离心管盖；剧烈涡旋振荡15秒后，室温静置2~3分钟；然后于4°C，12000Xg的条件下离心15分钟；将离心管倾斜45°，将上层水相溶液转移到另一小离心管中，并加入与上层水相等体积的异丙醇，混匀后室温静置10分钟，然后于4°C，12000Xg的条件下离心10分钟；弃上清液后，向离心管中加入ImL乙醇，并短暂涡旋，乙醇的质量分数为80% ;然后于4°C，7500Xg的条件离心5分钟，弃洗出液；在洁净环境中放置5~IO分钟使RNA沉淀干燥，然后用适量的DEPC水(一种经DEPC(diethylpyrocarbonate,焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压灭菌的水)溶解RNA沉淀，并于55~60°C下放置10-15分钟。
[0034]严格按invitrogen的M-MLV反转录试剂盒说明书(cat.nos.28025-032)反转录合成cDNA第一条链。
[0035](2) PCR扩增小鼠IgG2b抗体的Fe段基因
[0036]根据GenBank:V00763.1序列设计鼠Fe段基因的引物
[0037]h游引物:5’-ATTTGCGGCCGCGAGCCCAGCGGGCCCATTTC-3，(序列表中 SEQ ID N0.2,GCGGCCGCG为Not I酶切位点)
[0038]下游引物:5’-CCGTCTAGATTATCATTTACCCGGAGACCGGGAG-3> (序列表中 SEQ IDN0.3，TCTAGA为Not I酶切位点，TTATCA为终止密码子)
[0039]以上述cDNA第一条链为模板，以及两条引物进行PCR扩增，得到PCR产物。如图2所示，PCR扩增小鼠lgG2b Fe片段基因，在700bp左右具有明显条带，与目的片段大小(717bp)—致，表明成功扩增出了小鼠lgG2b Fe片段基因。
[0040]分别用Not I酶与Xba I酶对毕赤酵母表达载体pPICZ a A与PCR产物进行双酶切反应，用琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的产物；然后采用T4DNA连接酶对回收并纯化的酶切产物进行连接，得到含鼠lgG2b抗体Fe标签的酵母表达载体。
[0041]将得到的含鼠lgG2b抗体Fe标签的酵母表达载体，转化大肠杆菌DH5ci，经Not I和Xba I酶切鉴定和测序验证后确认获得了正确的含鼠lgG2b抗体Fe标签的酵母表达载体。如图3所示，构建的酵母表达载体pPICZ a A-mFc进行双酶切(Not I和Xba I )鉴定，在4000bp和700bp左右具有明显条带与pPICZ a A和mFc的大小一致，表明mFc成功构建到pPICZ a A载体上。
[0042]将得到的含鼠lgG2b抗体Fe标签的酵母表达载体，转化毕赤酵母GS115，并用甲醇诱导表达带有鼠Fe标签的融合蛋白。采用蛋白A纯化带有鼠Fe标签的融合蛋白。
[0043]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本 发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【权利要求】
1.一种含鼠lgG2b抗体Fe标签的酵母表达载体,其特征在于,包括鼠lgG2b抗体Fe段基因与毕赤酵母表达载体pPICZ a A，所述鼠lgG2b抗体Fe段基因连接在所述毕赤酵母表达载体pPICZ a A的Not I酶切位点和Xba I酶切位点之间，其中，鼠lgG2b抗体Fe段基因的序列为 SEQ ID N0.1。
2.一种含鼠lgG2b抗体Fe标签的酵母表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤: 提取小鼠脾脏的总RNA，并反转录合成cDNA第一条链； 以所述cDNA第一条链为模板、序列为SEQ ID N0.2的DNA链作为上游引物及序列为SEQ ID N0.3的DNA链作为下游引物进行PCR扩增，得到PCR产物，其中，上游引物的序列中含有Not I酶切位点，下游引物的序列中含有终止密码子与Xba I酶切位点； 分别用Not I酶与Xba I酶对毕赤酵母表达载体pPICZ a A与PCR产物进行双酶切反应，回收并纯化得到含鼠lgG2b抗体Fe段基因的酶切产物及毕赤酵母表达载体pPICZ a A的酶切产物； 采用DNA连接酶对回收并纯化的两种酶切产物进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5ci，用Zeocin的LB平 板筛选，挑选单菌落后提取质粒经酶切鉴定和测序鉴定后得到所述含鼠lgG2b抗体Fe标签的酵母表达载体，其中，鼠lgG2b抗体Fe段基因连接在所述毕赤酵母表达载体pPICZ a A的Not I酶切位点和Xba I酶切位点之间，鼠lgG2b抗体Fe段基因的序列为SEQ ID N0.1。
【文档编号】C12N15/13GK103898152SQ201210575163
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2012年12月26日 优先权日:2012年12月26日
【发明者】万晓春, 王彩霞 申请人:深圳先进技术研究院