专利名称：一种短小芽孢杆菌kmxu56及其接种剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种短小芽孢杆菌KMXU56及其接种剂，属环境微生物技术领域。
背景技术：
水葫芦，又名凤眼莲，属雨久花科水葫芦属，是一种原产于南美洲的多年生浮水植物。水葫芦生性喜光，适应于热带、亚热带气候(27-30°C为最佳生长温度)，生长速度快，在适合条件下，每五日生物量即增加一倍；单位生物量大，每公顷水面达200万株，合300-400吨；忍耐力极强，不论是在贫营养，还是在富营养湖泊、水库，甚至在高酸性和高碱性水体中，水葫芦都能存活(盛婧等，2010)。近年来，随着我国许多水体富营养化程度的加剧，水葫芦的分布面积有不断增大的趋势，其在江河、湖泊、水库大面积覆盖常见报道，因此，水葫芦在我国资源丰富。由于水葫芦大面积覆盖，易造成水体溶解氧降低、生物多样性 减少、水上交通堵塞等不良影响，每年南方很多地区都需要积极采取措施对其进行打捞防除，但是水葫芦被打捞后往往直接丢弃，造成严重的二次污染和资源浪费(刘红江等2011)。研究证明，水葫芦具有较高的利用价值。Gajalakshmi and Abbasi (2002)研究结果表明，利用水葫芦混合堆肥生产的绿肥，对植物的生长产生明显的促进效果，而且是安全可行的。Murugesan等以水葫芦、稻草为原料栽培食用菌，结果表明，水葫芦处理的收益显著高于稻草处理。通过水葫芦的转化利用来减少水葫芦数量，使之变废为宝，是控制水葫芦水体危害及二次污染的良好途径。已有的研究表明，水葫芦是钾含量最高的水生植物之一(Reddy et al.，1991 ;周文兵等，2004)，全株干基钾含量能够达到5%以上，水葫芦也具有较强的氮吸收能力，氮含量达3%。由此可见，水葫芦植株是极好的养分资源。而且，在水葫芦众多处置措施中，水葫芦农田施用是最为经济有效、环境友好、操作简单的一种处理方式。由于到水葫芦打捞和作物生长在时间上可能存在的不同步性，水葫芦常被简易堆制成有机肥施用。作为补充土壤钾的良好措施，水葫芦有机肥在农田施用在我国南方发展潜力巨大。随着滇池水葫芦种植面积的扩大，水葫芦渣的产生量也急剧增加。水葫芦渣的处理与处置已成为限制利用水葫芦去除滇池中的富营养化的限制条件之一。水葫芦渣堆肥与其他处理方法，如填埋、焚烧相比，具有建设投资少，运行费用低，基本无二次污染等优点。并且，水葫芦渣经堆肥处理后能土地利用，能充分利用其有机质和氮、磷等营养元素，是适合我国国情的处置方式。但是，堆肥工厂化的发展一直受到因堆肥时间和场地带来的成本问题的困扰，堆肥的快速化具有重要的现实意义。水葫芦渣堆肥接种已成为提高堆肥质量和发酵效率的重要手段之一。目前，已有多种微生物被应用于堆肥接种。但这些菌株大多分解水葫芦有机质能力不强，也不是从水葫芦渣中分离而得，使有机物的分解效率下降，影响堆肥腐熟。因此，迫切需要寻找一类既能在中温、又能在高温的条件下，代谢有机物的温度广谱性微生物，并且，把这类微生物接种到堆肥中，在堆肥中快速分解水葫芦渣纤维，实现水葫芦渣的快速腐熟，减少进一步的环境污染，降低成本，缩短生产发酵时间。本发明涉及一种生长温度广谱的短小芽孢杆菌KMXU56及其接种剂，在水葫芦渣堆肥处理中加快腐熟过程和纤维素分解。经文献检索，未见与本发明相同的公开报道。参考文献[I] Reddy K. R. , Agami M. , D，Angelo E. M. , Tucker J. C, Influence of Ksupply on growth and nutrient storage of water hyacinth. Bioresource Technol.
，1991，37 (I) 79 - 84[2]刘红江，陈留根，朱普平，盛婧，张岳芳，郑建初，农田施用水葫芦对水稻干物质生产与分配的影响，应用与环境生物学报，2011，17(4) =521-526[3]盛婧，陈留根，朱普平，周炜，薛新红，高养分富集植物水葫芦的农田利用研 究，中国生态农业学报，2010，18 (I) 46-49[4]谢建昌，周建民，Harder R.钾与中国农业.南京河海大学出版社，2000 :105-106[5]周文兵，刘大会，朱端卫，不同调理剂对猪粪堆肥过程及其养分状况的影响，华中农业大学学报，2004，23 (4) :421 - 42
发明内容
本发明的目的在于提供一种短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)KMXU56及其接种剂。本发明的目的是这样实现的本发明菌株KMXU56是从采自昆明神瑞农业有限公司堆肥发酵车间腐熟的水葫芦堆肥样品中分离筛选得到的一株具有较好的分解纤维素能力，能够在中高温范围(40°C 70°C)条件下生存的短小芽孢杆菌菌株，该菌株已于2012年9月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)，保藏号 CGMCC No. 6595。本发明菌株KMXU56具有如下特性KMXU56菌株菌体呈杆状，圆末端，单个或呈短链排列，1. 2 1. 5X2. O 4. O微米。能运动，革兰氏阳性，芽孢1. O 1. 2 X1. 5 2. O微米，椭圆形，中生或次端生。该菌能水解淀粉，降解甘露聚糖、木聚糖、纤维素。含有短小芽孢杆菌KMXU56的接种剂，经如下步骤得到(I)、菌种活化取短小芽孢杆菌KMXU56的菌种接种于LB液体培养基胰蛋白胨10g/L，酵母萃取物 5g/L，NaCl 10g/L, ρΗ7· O 中，在 30-35 °C 条件下培养 3_5d ；(2)、发酵种子液制备将活化的菌种接种于LB液体培养基中进行一级扩大培养，当培养液0D_在大于1. 5时停止培养，得一级种子；将一级种子按体积比8%接种至LB液体培养基中进行二级扩大培养，当培养液OD6tltl在大于2. 6时停止培养,得发酵种子液；一级、二级培养条件均为30-35°C，转速为120-180r/min，培养时间为5_7d ；(3)、接种剂的制备在含水量为40%_50%的稻壳堆中添加尿素和蔗糖，24h后，再在稻壳堆中均匀泼洒麸皮、玉米粉和发酵种子液进行堆置发酵，期间翻堆，至温度稳定在环境温度时，停止发酵，将发酵产物干燥，制得接种剂；其中a.尿素和蔗糖的添加方法为分别按稻壳干重质量比0. 5%和2%称取尿素和蔗糖，将尿素和蔗糖与水按重量比1:20配成溶液，均匀泼洒稻壳堆中；
b.麸皮、玉米粉和发酵种子液的添加方法为将按稻壳堆干重1%的麸皮、2%的玉米粉和2%的步骤(2)得到的发酵种子液混合，混拌均匀后泼洒在稻壳堆中，稻壳堆体高度O. 6-1. Sm，占地面积〈50m2，盖上透气性覆盖物进行堆置发酵；c.当发酵温度达到60_65°C并持续36_48h后，进行第I次翻堆，以后按第I次翻堆的条件再翻堆4-8次，直到温度稳定在环境温度后，将发酵产物在45-55°C下烘干4h，得固态接种剂。本发明的优点在于1、本发明选育的菌种短小芽孢杆菌KMXU56能够适合于水葫芦渣固态发酵，将该菌株制得的接种剂加入搅拌到水葫芦渣中，能够对其进行生物发酵，转变为生物有机肥。2、短小芽孢杆菌菌株KMXU56效果明显，无害、无环境造成污染具有重要的经济价 值和应用前景，适合大规模应用于大面积水域种植的水葫芦渣堆肥中。
具体实施例方式实施例所用的设备均为市场销售的通用设备。实施例1 :短小芽孢杆菌KMXU56的分离与纯化称取昆明神瑞农业有限公司堆肥发酵车间的水葫芦渣堆肥腐熟的样品有机肥
0.5 g,加入20 mL无菌水，混勻，使样品悬浮，取悬浮液I mL接种到含100 mL液体种子培养基的250 mL摇瓶中，45° CU80 r/min培养5 d。取I mL培养液梯度稀释至102、104、IO6UO8涂布于固体培养基上47°C培养2 d。挑取平板上菌落饱满、透明圈明显的单个菌落接种于液体培养基中，47° CU80 r/min再培养2 d。重复液体培养和固体平板分离3次。)，挑取生长旺盛的单菌落，在细菌培养基上，反复划线分离纯化3次，再将形态一致的菌落制片，进行简单染色，在油镜下观察菌体形态，多视野下观察菌体细胞形态，确认菌体形态一致后，接种至细菌斜面培养至丰厚，在4°C下保存，备用。将初筛得到的单菌株进行纤维素分解鉴定和不同温度活性实验，最终筛选出一株在40°C 70°C生存生长，并有效分解纤维素的菌株KMXU56。实施例2 :菌株KMXU56的鉴定生理生化特征菌株的生理和生化特征实验测定方法及鉴定，革兰氏染色结果表明，菌株KMXU56为革兰氏阳性。菌株KMXU56知接触酶、葡萄糖产酸、淀粉水解试验、丙二酸盐利用、硝酸盐还原、柠檬酸盐利用均为阳性；葡萄糖产气、甲基红实验、V-P测定、吲哚反应、H2S实验均为阴性；根据《伯杰细菌鉴定手册》，其特征与短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)特性相吻合。菌株KMXU56的16S rRNA基因序列分析采用PCR技术，成功扩增出菌株KMXU56的16SrRNA基因，然后克隆和测序。测定的序列长度为1458 bp，获得的 16S rRNA 基因序列通过 GENBANK 数据库(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/genbank/)进行比对，结果显示相似性在99%以上的菌株均为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的菌株，把该菌株编号命名为KMXU56，并于2012年9月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏,分类命名为短小芽孢杆菌Bacillus pumilus,保藏号CGMCCNo. 6595。 实施例3 短小芽孢杆菌KMXU56分解纤维素活性测定
将实菌株短小芽孢杆菌KMXU56菌株在无菌环境中接种至LB培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母萃取物5g/L，NaCl 10g/L, pH7. O)上，在37°C下培活化养3天，然后在无菌环境中，用接种针挑取一环KMXU56，接种至装有600ml已灭菌的LB培养基中，在180rpm，37 °C下振荡培养3天，得发酵液。发酵液经4000 r/min离心10 min,上清液作为粗酶液。用O. 5 mL适当稀释的酶液于70°C恒温水浴预热2 min后，加入1. 5 mL用醋酸缓冲液pH 4. 8配制的1%羧甲基纤维素钠溶液，70°C恒温水浴酶解30 min,加入I mL浓度为I mol/L的氢氧化钠摇匀以终止反应。然后加入2 mL的DNS于沸水浴中5 min,用流动的冷水终止反应，冷却后在540 nm下测定其吸光值，并对照标准曲线后测算酶活力。结果显示产酶的菌株KMXU56所产生 的纤维素酶40°C 70°C下，相对酶活力较高，达到95°/Γ89%。在此温度范围之外，相对酶活力较低。实施例4 含有短小芽孢杆菌KMXU56的接种剂，经如下步骤得到(I)、菌种活化取短小芽孢杆菌KMXU56的菌种接种于LB液体培养基胰蛋白胨10g/L，酵母萃取物5g/L，NaCl 10g/L, ρΗ7· O中，在35 °C条件下培养5d ；(2)、发酵种子液制备将活化的菌种接种于LB液体培养基中进行一级扩大培养，当培养液0D_在大于1. 4时停止培养，得一级种子；将一级种子按体积比8%接种至LB液体培养基中进行二级扩大培养，当培养液OD6tltl在大于2. 6时停止培养,得发酵种子液；一级、二级培养条件均为35°C，转速为150 r/min或180r/min，培养时间为7d ；(3)、在含水量为50%的稻壳堆中添加尿素和蔗糖，24h后，再在稻壳堆中均匀泼洒麸皮、玉米粉和发酵种子液进行堆置发酵，期间翻堆，至温度稳定在环境温度时，停止发酵，将发酵产物干燥，制得接种剂；其中a.尿素和蔗糖的添加方法为分别按稻壳干重质量比0. 5%和2%称取尿素和蔗糖，将尿素和蔗糖与水按重量比1:20配成溶液，均匀泼洒稻壳堆中；b.麸皮、玉米粉和发酵种子液的添加方法为将按稻壳堆干重1%的麸皮、2%的玉米粉和2%的步骤(2)得到的发酵种子液混合，混拌均匀后泼洒在稻壳堆中，稻壳堆体高度1. 2m，占地面积〈50m2，盖上透气性覆盖物进行堆置发酵；c.当发酵温度达到60°C并持续42h或48h后，进行第I次翻堆，以后按第I次翻堆的条件再翻堆4-8次，直到温度稳定在环境温度后，将发酵产物在45°C或55°C下烘干4h，得固态接种剂。
权利要求
1.一种短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) KMXU56，其保藏号为=CGMCC No. 6595。
2.含有权利要求1所述短小芽孢杆菌KMXU56的接种剂，其特征在于该接种剂 经如下步骤得到 (1)、菌种活化取短小芽孢杆菌KMXU56的菌种接种于LB液体培养基胰蛋白胨IOg/L，酵母萃取物5g/L，NaCl 10g/L, ρΗ7· O中，在30-35 °C条件下培养3_5d ； (2)、发酵种子液制备将活化的菌种接种于LB液体培养基进行一级扩大培养，当培养液0D_在大于1. 3时停止培养，得一级种子；将一级种子按体积比8%接种至LB液体培养基进行二级扩大培养，当培养液OD6tltl在大于2. 5时停止培养，得发酵种子液；一级、二级培养条件均为30-35°C，转速为150-180r/min，培养时间为5_7d ； (3)、接种剂的制备在含水量为40%-50%的稻壳堆中添加尿素和蔗糖，24h后，再在稻壳堆中均匀泼洒麸皮、玉米粉和发酵种子液进行堆置发酵，期间翻堆，至温度稳定在环境温度时，停止发酵，将发酵产物干燥，制得接种剂；其中 a.尿素和蔗糖的添加方法为分别按稻壳干重质量比O.5%和2%称取尿素和蔗糖，将尿素和蔗糖与水按重量比1:20配成溶液，均匀泼洒稻壳堆中； b.麸皮、玉米粉和发酵种子液的添加方法为将按稻壳堆干重1%的麸皮、2%的玉米粉和2%的步骤(2)得到的发酵种子液混合，混拌均匀后泼洒在稻壳堆中，稻壳堆体高度O.6-1. Sm，占地面积〈50m2，盖上透气性覆盖物进行堆置发酵； c.当发酵温度达到60-65°C并持续42-48h后，进行第I次翻堆，按照前述方法再翻堆4-8次，直到温度稳定在环境温度后，将发酵产物在45-55°C下烘干4h，得固态接种剂。
全文摘要
本发明涉及一种短小芽孢杆菌KMXU56 及其接种剂，属环境微生物技术领域。短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) KMXU56，其保藏号为CGMCC No.6595。含有短小芽孢杆菌KMXU56的接种剂，经菌种活化、发酵种子液制备、接种剂的制备步骤得到。本发明的菌株从水葫芦渣在自然发酵条件下分离筛选出来，具有较好的分解纤维素能力，能够在中高温范围(40℃~70℃)条件下生存；经发酵培养和扩繁后制得的接种剂，加入到水葫芦渣混合物中，在自然条件下进行堆肥发酵，将水葫芦渣转化为生物有机肥。该水葫芦渣生物有机肥具有良好的肥效和保水性能，且绿色环保，无污染，具有较好的经济效益和社会效益。
文档编号C12R1/07GK103013887SQ20121057590
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月27日 优先权日2012年12月27日
发明者余磊, 赵建荣 申请人:昆明学院