专利名称：一种管状多孔细菌纤维素的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种管状多孔细菌纤维素的制备方法，特别是涉及一种具有多孔结构的管状多孔细菌纤维素的制备方法。
背景技术：
细菌纤维素是指在不同条件下，能够生物合成纤维素的微生物，包括木醋杆菌、产醋杆菌、醋化杆菌、巴氏醋杆菌、葡萄糖杆菌、农杆菌、根瘤菌、八叠球菌、洋葱假单胞菌、椰毒假单胞菌或空肠弯曲菌中的一种或几种微生物合成的纤维素的统称。醋酸菌属中的木 醋杆菌Acetobacter xylinum由于产生纤维素效率最高而被广泛用于细菌纤维素基础研究以及应用研究的模板微生物。细菌纤维素的制备方法目前主要为静态培养与动态培养两种。由于菌种为革兰氏阴性原生细胞体的赖氧生存属性，使细菌纤维素形成于糖源与有氧区与的交界处。静态培养得到的细菌纤维素材料根据培养容器形状不同以及应用领域能够形成薄膜状，管状等规则几何形状。在静态培养过程中，严格要求不使培养容器产生剧烈晃动以避免细菌纤维素产生分层或部分黏连的现象，降低材料的应用价值。此外，静态培养周期较长，成本过高，细菌纤维素产量无法满足大规模生产的要求；动态培养是指在培养过程中，将氧气或空气以气泡形式通入培养容器中并结合机械搅拌的方式，人为地使原本氧气含量十分有限的培养液含有接近空气中的氧气含量，制备细菌纤维素。由于培养过程中存在着剪切应力，因此得到的细菌纤维素为絮状、星形、团簇状、球形、椭圆等不规则几何形状，应用价值不高。此外，有研究发现动态培养条件下会产生菌种细胞变异体，变异体不具有产生纤维素的能力，因此动态培养时间过久会抑制纤维素的产量。现有技术有报道利用先动态，后静态的“两步法”制备细菌纤维素，广泛应用于东南亚地区“纳塔”(椰果)产业。“两步法”能够在一定程度上提高单一静态培养细菌纤维素的产量，但是从实质上说，仍然是两种不同的制备工艺的简单叠加，无法实现细菌纤维素材料既保证产量，又具有规整的几何外形。现有技术采用透氧材料制成中空模具，利用菌种赖氧生存的生物特性，在模具内腔通入一定压力的空气或氧气,置于接入菌种的发酵培养液中；或者将接入菌种的发酵培养液灌满中空模具内部，将其置于一定压力的环境中。静置一段时间后，细菌分泌纤维素包覆模具外壁或紧贴模具内腔，形成异型中空材料。这种方法能够获得外形不局限于简单的薄膜、管状的异型中空细菌纤维素材料。需要指出的是，现有利用透氧材料人为创造气/液界面，培养细菌纤维素材料存在培养周期长的缺陷。采用现有技术要使的细菌纤维素材料具有能够满足应用要求的力学性能，培养周期需要两周甚至更长的时间。有研究认为，微生物形成细菌纤维素的关键在于其所处环境满足有氧与有糖两个条件。细菌纤维素内部由于上方空气扩散作用而存在一个有氧区，同时由于下方培养液渗透作用而存在一个碳源区，处于有氧区与碳源区重叠区域，也称为“有效区域”，的细菌才是真正产生纤维素的细菌，80%的纤维素来自于这部分细菌，因此也称为“活性菌”。从实质上说，现有技术采用透氧材料制备细菌纤维素仍属于静态培养范畴，没有将动态培养与静态培养各自的优势完全结合起来。现有技术将采用透氧材料制备得到的中空异型细菌纤维素应用于人造血管的构建，并已取得一定的成果。但是，仅依靠单层透氧材料制备得到的管状细菌纤维素其有着内腔致密，外壁疏松的不对称结构。疏松的外壁使得材料的缝合性能较差。在缝合处容易由于材料与周围组织的顺应性不够而形成内膜增生，进而导致血栓的发生。
发明内容
本发明涉及一种管状细菌纤维素的制备方法，采用双层透氧材料嵌套的方式，构造出内外双层气/液界面，将细菌纤维素在培养过程中，内部有氧区与碳源区重叠区域为现有技术的两倍，将制备周期由2周甚至更长时间缩短至10天以内。在现有公开技术的基础上，本发明通过精确调节中空透氧模具内管内部压力气体以及外管外部气体的压力，使中空透氧模具的内管与外管都能够沿径向产生收缩/舒张，周期性的交替变化。由于中空透氧模具内管与外管的径向收缩/舒张幅度很小，一般不超过5%，因此这种制备管状细菌 纤维素的过程是一个“准静态”的过程。不会因为径向变化幅度过大而使材料产生物理分层或部分黏连的情况。通过调节中空透氧模具内管内部与外管外部的氧气体积浓度，能够控制材料内部纤维素的疏密程度，快速构筑出一个内腔致密光滑、外壁缝合性良好、沿径向纤维素微纤丝取向规整的具备差异化结构的管状细菌纤维素材料。同时，在静置培养过程中，本发明在现有技术基础上，将缓释微球分散于接入菌种的发酵培养液中，一方面能够使细菌分泌纤维素微纤丝并逐步形成纤维素network三维网状结构的过程中将缓释微球原位包覆在管状细菌纤维素内部；另一方面，由于缓释微球在静置培养过程中能够缓慢释放内部包覆的过氧化物或细菌生物合成纤维素时所需要的碳源，因此静置培养过程中，中空透氧模具内部的有氧区域不仅仅局限于内管与外管的表面，而是整个中空透氧模具的内部区域。这样能够大大提高细菌生物合成纤维素的效率，缩短培养周期。本发明采用生物相容性良好的明胶、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、壳聚糖或胶原作为缓释微球的囊壁材料，使缓释微球在24 72小时内将内部物质释放完毕后，能够以溶解或降解的方式消失，形成管状细菌纤维素内部的多孔贯穿结构。细菌纤维素(Bacterial Cellulose，也称微生物纤维素)是一种纳米纤维材料。其以细菌细胞内部作为生物合成反应器，将葡萄糖小分子在酶催化作用下经过一系列复杂的变构过程最终通过β -I, 4-糖苷键结合形成β -I, 4-葡萄糖链由细菌系细胞侧面的催化位点挤出。β -I, 4-葡萄糖链彼此之间通过分子内与分子间氢键作用，逐步、分层地形成脂多糖层、类晶团聚体、纤维素微纤并最终形成纤维素。这一系列的细胞外(Extracellular)成形过程被称为“纤维素的自组装”。正是这个独特的微生物参与的过程赋予了细菌纤维素良好的理化性能超细三维网状结构；良好的吸湿、保湿以及透气性能；超高的持水性与湿态强度；高抗张强度与弹性模量等等。大量研究表明细菌纤维素材料具有良好的体内、体外生物相容性，加上其优异的形状可调控性与形状维持性使其在构建体内、体外组织工程支架材料具有得天独厚的优势。本发明一种管状多孔细菌纤维素的制备方法，采用中空透氧模具培养细菌纤维素，所述的中空透氧模具是由同轴的外管和内管嵌套组成，所述的外管内径与所述的内管外径差为I IOmm;所述的内管中通入压力气体，所述的内管外壁与外管内壁间充满接入菌种的培养液和缓释微球；所述的中空透氧模具外部为气体。如上所述的一种管状多孔细菌纤维素的制备方法，所述的中空透氧模具的内管与外管均由透氧材料根据所需修复的人体组织的实际形状、直径以及大小制作得到的；所述的中空透氧模具在外形上与人体乳内动脉、隐静脉、尿道、十二指肠或胆管的形状一致。其中所述的透氧材料是指在常温常压下的氧气透过速率为100 IOOOmL. m_2. s_S孔隙均一度偏差〈±0. 3的材料。所述的透氧材料是指通过针织、机织或编织的方法将棉、纱、聚乙烯纤维、聚丙烯纤维和/或PET纤维制成的中空多孔材料，或通过模具一次成型将硅橡胶、膨体聚四氟乙烯、乳胶或陶瓷透氧材料制成的中空透氧支架。
所述的菌种是指能够生物合成纤维素的微生物，包括木醋杆菌、产醋杆菌、醋化杆菌、巴氏醋杆菌、葡萄糖杆菌、农杆菌、根瘤菌、八叠球菌、洋葱假单胞菌、椰毒假单胞菌或空肠弯曲菌中的一种或几种。所述的缓释微球为具有皮芯结构，外径为50 250 μ m ;其中，缓释微球内部含有过氧化合物、葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇；缓释微球囊壁材料为明胶、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、壳聚糖或胶原。所述的缓释微球在24 72小时内持续释放缓释微球内部物质，并在内部物质释放完毕后的72小时内，缓释微球囊壁以溶解或降解的方式消失。所述的中空透氧模具内管内部压力气体与中空透氧模具外管外部气体均指氧气体积浓度在10 100%范围内，压力在I I. 5个标准大气压范围内的气体。所述的周期性的交替变化是指内管内部压力气体压力以及外管外部气体压力在设定下限与设定上限之间交替转换的气体，设定上限最大不超过I. 5个标准大气压，设定下限最小不低于I个标准大气压，转换频率为65 165次/分钟。本发明还提供了一种具备多孔结构的管状细菌纤维素及其制备方法，包括以下步骤I)发酵培养液的调配；发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇2 5，蛋白胨O. 05 O. 5，酵母膏O. 05 O. 5，柠檬酸O. 01 O. 1，磷酸氢二钠O. 02 O. 2，磷酸二氢钾O. 01 O. I,余量为水；发酵培养液的pH为4. O 6. O ;将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；2)菌种扩培；将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度菌种细胞数目在2X105 2X107个/ml。3)静置培养；将扩培后的菌液与调配好的发酵培养液以及缓释微球均匀混合后，灌入中空透氧模具内管外壁与外管内壁间的区域，置于恒温环境内，28 32°C静置培养。
通过在培养过程中向中空透氧模具内管充入压力气体，同时调节恒温环境内的气体压力，培养管状细菌纤维素；通过缓释微球，使细菌纤维素在形成过程中原位包覆缓释微球，微球降解后，形成内部多孔结构；通过缓释微球在培养过程中缓慢释放氧气或糖源，提高细菌纤维素生产效率。所述的向中空透氧模具内管充入压力气体分为三种情况I)内管内压力气体的压力在培养过程中恒定不变。最大不超过I. 5个标准大气压，最小不低于I个标准大气压；氧气体积浓度为10 50% ；2)内管内压力气体在培养过程中，在压力设定上限和压力设定下限间不断交替变换。设定上限最大不超过I. 5个标准大气压，最小要高于I. 3个标准大气压；设定下限最大不超过I. 3个标准大气压，最小要高于I个标准大气压；氧气体积浓度为10 50% ；3)内管内压力气体的压力在培养过程中逐渐增加至设定上限。设定上限最大不超过I. 5个标准大气压，最小要高于I个标准大气压；氧气体积浓度为10 50% ；、所述的逐渐增加分为连续性增压和阶段性增压两种形式。连续性增压是指每分钟使内管内压力气体的压力上升O. 1%个标准大气压，直至内管内压力气体的压力达到设定上限为止。阶段性增压是指每小时是内管内压力气体的压力增加1%个标准大气压，直至内管内压力气体的压力达到设定上限为止。所述的调节恒温环境内气体压力分为三种情况I)恒温环境内气体的压力在培养过程中恒定不变。最大不超过I. 5个标准大气压，最小不低于I个标准大气压；氧气体积浓度为10 50% ；2)恒温环境内气体在培养过程中，在压力设定上限和压力设定下限间不断交替变换。设定上限最大不超过I. 5个标准大气压，最小要高于I. 3个标准大气压；设定下限最大不超过I. 3个标准大气压，最小要高于I个标准大气压；氧气体积浓度10 50% ；3)恒温环境内气体的压力在培养过程中逐渐增加至设定上限。设定上限最大不超过I. 5个标准大气压，最小要高于I个标准大气压；氧气体积浓度为10 50% ；所述的逐渐增加分为连续性增压和阶段性增压两种形式。连续性增压是指每分钟使内管内压力气体的压力上升O. 1%个标准大气压，直至恒温环境内气体的压力达到设定上限为止。阶段性增压是指每小时是内管内压力气体的压力增加1%个标准大气压，直至恒温环境内气体的压力达到设定上限为止。所述静置培养直至中空透氧模具内管外壁与外管内壁间培养液收干为止。4)后处理；培养结束后，将上述的细菌纤维素浸泡至浓度为I 10wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2 10小时，用纯净水清洗至pH为7. 0，材料内毒素〈O. 5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素高压灭菌并包装低温封存。如上所述的一种具备多孔结构的管状细菌纤维素机器制备方法，所述的缓释微球为具有皮芯结构，外径为50 250 μ m ;其中，缓释微球内部含有过氧化合物、葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇；缓释微球囊壁材料为明胶、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、壳聚糖或胶原。将缓释微球均匀分散在经过灭菌处理，调配好并接入菌液的发酵培养液中。所述的缓释微球在静置培养阶段，在24 72小时内持续释放缓释微球内部物质，并在内部物质释放完毕后的48小时内，缓释微球囊壁以溶解或降解的方式消失。
如上所述的一种管状细菌纤维素的制备方法，其特征在于，所述的高压蒸汽灭菌后紫外辐照是指将所述发酵培养液置于高压灭菌锅内121°C灭菌处理30分钟后取出置于紫外灯下辐照冷却至室温。如上所述的一种管状细菌纤维素的制备方法，其特征在于，所述的通纯氧是指将医用氧以lL/min的速度通入上述的培养液中，并维持30分钟；所述的接种是指用灭菌后的接种环钩取适量保存于4°C下试管中的菌种，并转移至上述的发酵培养液中；所述的扩培是指将接入菌种后的发酵培养液于28 32°C下摇床培养8 24小时；细菌纤维素作为一种新型的天然水凝胶具有其独特的物理、化学和机械性质超细网状结构；高抗张强度和弹性模量；高亲水性，良好的透气、吸水、透水性能，并有非凡的持水性和高湿强度。细菌纤维素的微纤丝束直径为3 4nm，而由微纤维束连接成的纤维丝带宽度为70 80nm,长度为I 9 μ m,是目前最细的天然纤维。有益效果 与现有技术相比，本发明的有益效果是(I)通过透氧材料嵌套的方式，在培养过程中人为创造双层气/液界面，使细菌纤维素内部“有效区域”扩充一倍，提高了纤维素的产率，缩短了管状细菌纤维素的制备周期。(2)通过使中空透氧模具内管与外管产生周期性的收缩/舒张交替变化，使得到的管状细菌纤维素内部纤维素微纤丝沿径向取向，使材料在径向具有更好的力学强度，能够满足更广的应用需求。(3)双层气/液界面使管状细菌纤维素的外壁更致密，提高了材料在临床应用时的缝合性能，降低了植入人体后，由于与周围组织顺应性不足而发生内膜增生与血栓的机率。(4)将缓释微球加入到培养液中，使从细菌细胞体内挤出的纤维素微纤丝在包覆透氧材料形成管状细菌纤维素的过程中将缓释微球颗粒原位包覆在管状细菌纤维素内部。缓释微球能够在24 72小时内持续释放缓释微球内部物质，并在内部物质释放完毕后的72小时内，缓释微球囊壁以溶解或降解的方式消失。解决了传统利用致孔剂构筑材料内部多孔结构时存在的致孔剂清洗过程复杂的问题；缓释微球采用生物相容性良好的明胶、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、壳聚糖或胶原作为囊壁，内部包覆过氧化合物或细菌生物合成纤维素所需的碳源，能够在形成多孔结构的同时，提高细菌生物合成纤维素的效率，结合培养装置的双层气/液界面特点，能够大大缩短培养周期。(5)通过精确控制培养过程中，中空透氧模具内管内压力气体与外管外气体的氧气体积浓度，能够得到内腔、外壁致密平滑，内部多孔贯穿的三明治对称结构的多孔管状细菌纤维素。(6) 一种具有多孔结构的管状细菌纤维素的制备方法成型过程简单，材料制备周期短，制备过程绿色环保、简便快速、制备成本低廉，是一种理想的生物医用支架材料。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。本发明涉及一种管状细菌纤维素的制备方法。采用双层透氧材料嵌套组成中空透氧模具培养细菌纤维素。在现有公开技术的基础上，通过精确调节中空透氧模具内管内部压力气体与外管外部气体的压力以及氧气体积浓度，是中空透氧模具的内管与外管能够沿径向 产生收缩/舒张的周期性交替变化。由于径向形变的幅度很小，不超过5%，因此培养过程是一个“准静态”的过程。本发明将细菌纤维素内部“有效区域”扩充一倍，缩短管状细菌纤维素的培养周期，同时，使管状细菌纤维素外壁更致密，提高材料的缝合性，降低了植入人体后在缝合处发生内膜增生与血栓的机率。本发明的一种管状多孔细菌纤维素的制备方法，采用中空透氧模具培养细菌纤维素，所述的中空透氧模具是由同轴的外管和内管嵌套组成，所述的外管内径与所述的内管外径差为I IOmm;所述的内管中通入压力气体，所述的内管外壁与外管内壁间充满接入菌种的培养液和缓释微球；所述的中空透氧模具外部为气体。如上所述的一种管状多孔细菌纤维素的制备方法，所述的中空透氧模具的内管与外管均由透氧材料根据所需修复的人体组织的实际形状、直径以及大小制作得到的；所述的中空透氧模具在外形上与人体乳内动脉、隐静脉、尿道、十二指肠或胆管的形状一致。其中所述的透氧材料是指在常温常压下的氧气透过速率为100 IOOOmL. m_2. s_S孔隙均一度偏差〈±0. 3的材料。所述的透氧材料是指通过针织、机织或编织的方法将棉、纱、聚乙烯纤维、聚丙烯纤维和/或PET纤维制成的中空多孔材料，或通过模具一次成型将硅橡胶、膨体聚四氟乙烯、乳胶或陶瓷透氧材料制成的中空透氧支架。所述的中空透氧模具内管内部压力气体与中空透氧模具外管外部气体均指氧气体积浓度在10 100%范围内，压力在I I. 5个标准大气压范围内的气体。所述的周期性的交替变化是指内管内部压力气体压力以及外管外部气体压力在设定下限与设定上限之间交替转换的气体，设定上限最大不超过I. 5个标准大气压，设定下限最小不低于I个标准大气压，转换频率为65 165次/分钟。所述的接入菌种的培养液是指含菌种的发酵培养液。所述的缓释微球为具有皮芯结构，外径为50 250 μ m ;其中，缓释微球内部含有过氧化合物、葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇；缓释微球囊壁材料为明胶、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、壳聚糖或胶原。所述的缓释微球在24 72小时内持续释放缓释微球内部物质，并在内部物质释放完毕后的72小时内，缓释微球囊壁以溶解或降解的方式消失。实施例II)发酵培养液的调配；发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇2，蛋白胨O. 05，酵母膏O. 05，柠檬酸O. 01，磷酸氢二钠O. 02，磷酸二氢钾O. 01，余量为水发酵培养液的pH为4. O ;将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；2)菌种扩培；将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度菌种细胞数目在2X105个/ml。
3)静置培养；将扩培后的菌液与调配好的发酵培养液均匀混合后，灌入中空透氧模具内管外壁与外管内壁间的区域，置于恒温环境内，28°C静置培养。通过在培养过程中向中空透氧模具内管充入压力气体，同时调节恒温环境内的气体压力，培养管状细菌纤维素；通过缓释微球，使细菌纤维素在形成过程中原位包覆缓释微球，微球降解后，形成内部多孔结构；通过缓释微球在培养过程中缓慢释放氧气或糖源，提高细菌纤维素生产效率。所述的向中空透氧模具内管充入压力气体为第一种情况内管内压力气体的压力在培养过程中恒定不变。最大不超过I. 5个标准大气压，最小不低于I个标准大气压；氧气分压为10%所述的调节恒温环境内气体压力为第一种情况恒温环境内气体的压力在培养过程中恒定不变。最大不超过I. 5个标准大气压，最小不低于I个标准大气压；氧气分压为10%直至中空透氧模具内管外壁与外管内壁间培养液收干为止。4)后处理培养结束后，将上述的细菌纤维素浸泡至浓度为lwt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2小时，用纯净水清洗至pH为7. 0，材料内毒素〈O. 5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素高压灭菌并包装低温封存。实施例2I)发酵培养液的调配；发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨O. 5，酵母膏O. 5，柠檬酸O. I，磷酸氢二钠O. 2，磷酸二氢钾O. I，余量为水；发酵培养液的pH为6. O ;将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；2)菌种扩培；将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度菌种细胞数目在2X107个/ml。3)静置培养；将扩培后的菌液与调配好的发酵培养液均匀混合后，灌入中空透氧模具内管外壁与外管内壁间的区域，置于恒温环境内，32°C静置培养。通过在培养过程中向中空透氧模具内管充入压力气体，同时调节恒温环境内的气体压力，培养管状细菌纤维素；通过缓释微球，使细菌纤维素在形成过程中原位包覆缓释微球，微球降解后，形成内部多孔结构；通过缓释微球在培养过程中缓慢释放氧气或糖源，提高细菌纤维素生产效率。所述的向中空透氧模具内管充入压力气体为第一种情况内管内压力气体的压力在培养过程中恒定不变。最大不超过I. 5个标准大气压，最小不低于I个标准大气压；氧气分压为50%所述的调节恒温环境内气体压力为第一种情况恒温环境内气体的压力在培养过程中恒定不变。最大不超过I. 5个标准大气压，最小不低于I个标准大气压；氧气分压为50%直至中空透氧模具内管外壁与外管内壁间培养液收干为止。4)后处理培养结束后，将上述的细菌纤维素浸泡至浓度为10wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持10小时，用纯净水清洗至pH为7. 0，材料内毒素〈O. 5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素高压灭菌并包装低温封存。实施例3I)发酵培养液的调配；发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇3，蛋白胨O. 3，酵母膏O. 3，柠檬酸O. 05，磷酸氢二钠O. 1，磷酸二氢钾O. 05，余量为水； 发酵培养液的pH为5. O ;将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；2)菌种扩培；将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度菌种细胞数目在2X106个/ml。3)静置培养；将扩培后的菌液与调配好的发酵培养液均匀混合后，灌入中空透氧模具内管外壁与外管内壁间的区域，置于恒温环境内，30°C静置培养。通过在培养过程中向中空透氧模具内管充入压力气体，同时调节恒温环境内的气体压力，培养管状细菌纤维素；通过缓释微球，使细菌纤维素在形成过程中原位包覆缓释微球，微球降解后，形成内部多孔结构；通过缓释微球在培养过程中缓慢释放氧气或糖源，提高细菌纤维素生产效率。所述的向中空透氧模具内管充入压力气体为第一种情况内管内压力气体的压力在培养过程中恒定不变。最大不超过I. 5个标准大气压，最小不低于I个标准大气压；氧气分压为30%所述的调节恒温环境内气体压力为第一种情况恒温环境内气体的压力在培养过程中恒定不变。最大不超过I. 5个标准大气压，最小不低于I个标准大气压；氧气分压为30%直至中空透氧模具内管外壁与外管内壁间培养液收干为止。4)后处理培养结束后，将上述的细菌纤维素浸泡至浓度为2wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持4小时，用纯净水清洗至pH为7. 0，材料内毒素〈O. 5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素高压灭菌并包装低温封存。实施例4I)发酵培养液的调配；发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨O. 5，酵母膏O. 5，柠檬酸O. I，磷酸氢二钠O. 2，磷酸二氢钾O. I，余量为水；发酵培养液的pH为5. O ;将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；2)菌种扩培；将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度菌种细胞数目在2X107个/ml。3)静置培养；将扩培后的菌液与调配好的发酵培养液均匀混合后，灌入中空透氧模具内管外壁与外管内壁间的区域，置于恒温环境内，30°C静置培养。
通过在培养过程中向中空透氧模具内管充入压力气体，同时调节恒温环境内的气体压力，培养管状细菌纤维素；通过缓释微球，使细菌纤维素在形成过程中原位包覆缓释微球，微球降解后，形成内部多孔结构；通过缓释微球在培养过程中缓慢释放氧气或糖源，提高细菌纤维素生产效率。所述的向中空透氧模具内管充入压力气体为第一种情况内管内压力气体的压力在培养过程中恒定不变。最大不超过I. 5个标准大气压，最小不低于I个标准大气压；氧气体积分压为10%所述的调节恒温环境内气体压力为第二种情况恒温环境内气体在培养过程中，在压力设定上限和压力设定下限间不断交替变换。设定上限最大不超过I. 5个标准大气压，最小要高于I. 3个标准大气压；设定下限最大不超过I. 3个标准大气压，最小要高于I个标准大气压；氧气体积分压为10%直至中空透氧模具内管外壁与外管内壁间培养液收干为止。4)后处理培养结束后，将上述的细菌纤维素浸泡至浓度为lwt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2小时，用纯净水清洗至pH为7. 0，材料内毒素〈O. 5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素高压灭菌并包装低温封存。实施例5I)发酵培养液的调配；发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨O. 5，酵母膏O. 5，柠檬酸O. I，磷酸氢二钠O. 2，磷酸二氢钾O. I，余量为水；发酵培养液的pH为5. O ;将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；2)菌种扩培；将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度菌种细胞数目在2X107个/ml。3)静置培养；将扩培后的菌液与调配好的发酵培养液均匀混合后，灌入中空透氧模具内管外壁与外管内壁间的区域，置于恒温环境内，30°C静置培养。通过在培养过程中向中空透氧模具内管充入压力气体，同时调节恒温环境内的气体压力，培养管状细菌纤维素；通过缓释微球，使细菌纤维素在形成过程中原位包覆缓释微球，微球降解后，形成内部多孔结构；通过缓释微球在培养过程中缓慢释放氧气或糖源，提高细菌纤维素生产效率。所述的向中空透氧模具内管充入压力气体为第一种情况
内管内压力气体的压力在培养过程中恒定不变。最大不超过I. 5个标准大气压，最小不低于I个标准大气压；氧气体积分压为10%所述的调节恒温环境内气体压力为第三种情况恒温环境内气体的压力在培养过程中逐渐增加至设定上限。设定上限最大不超过I. 5个标准大气压,最小要高于I个标准大气压；氧气体积分压为10 50%所述的逐渐增加为连续性增压。连续性增压是指每分钟使内管内压力气体的压力上升O. 1%个标准大气压，直至恒温环境内气体的压力达到设定上限为止。直至中空透氧模具内管外壁与外管内壁间培养液收干为止。4)后处理
培养结束后，将上述的细菌纤维素浸泡至浓度为lwt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2小时，用纯净水清洗至pH为7. 0，材料内毒素〈O. 5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素高压灭菌并包装低温封存。实施例6I)发酵培养液的调配；发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨O. 5，酵母膏O. 5，柠檬酸O. I，磷酸氢二钠O. 2，磷酸二氢钾O. I，余量为水；发酵培养液的pH为5. O ;将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；2)菌种扩培；将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度菌种细胞数目在2X107个/ml。3)静置培养；将扩培后的菌液与调配好的发酵培养液均匀混合后，灌入中空透氧模具内管外壁与外管内壁间的区域，置于恒温环境内，30°C静置培养。通过在培养过程中向中空透氧模具内管充入压力气体，同时调节恒温环境内的气体压力，培养管状细菌纤维素；通过缓释微球，使细菌纤维素在形成过程中原位包覆缓释微球，微球降解后，形成内部多孔结构；通过缓释微球在培养过程中缓慢释放氧气或糖源，提高细菌纤维素生产效率。所述的向中空透氧模具内管充入压力气体为第一种情况内管内压力气体的压力在培养过程中恒定不变。最大不超过I. 5个标准大气压，最小不低于I个标准大气压；氧气体积分压为10%所述的调节恒温环境内气体压力为第三种情况恒温环境内气体的压力在培养过程中逐渐增加至设定上限。设定上限最大不超过I. 5个标准大气压，最小要高于I个标准大气压；氧气体积分压为10%所述的逐渐增加为阶段性增压。阶段性增压是指每小时是内管内压力气体的压力增加1%个标准大气压，直至恒温环境内气体的压力达到设定上限为止。直至中空透氧模具内管外壁与外管内壁间培养液收干为止。4)后处理培养结束后，将上述的细菌纤维素浸泡至浓度为lwt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2小时，用纯净水清洗至pH为7. O，材料内毒素〈O. 5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素高压灭菌并包装低温封存。实施例7I)发酵培养液的调配；发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨O. 5，酵母膏O. 5，柠檬酸O. I，磷酸氢二钠O. 2，磷酸二氢钾O. I，余量为水；发酵培养液的pH为5. O ;将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；
2)菌种扩培；将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度菌种细胞数目在2X107个/ml。3)静置培养；将扩培后的菌液与调配好的发酵培养液均匀混合后，灌入中空透氧模具内管外壁与外管内壁间的区域，置于恒温环境内，30°C静置培养。通过在培养过程中向中空透氧模具内管充入压力气体，同时调节恒温环境内的气体压力，培养管状细菌纤维素；通过缓释微球，使细菌纤维素在形成过程中原位包覆缓释微球，微球降解后，形成内部多孔结构；通过缓释微球在培养过程中缓慢释放氧气或糖源，提高细菌纤维素生产效率。所述的向中空透氧模具内管充入压力气体为第二种情况内管内压力气体在培养过程中，在压力设定上限和压力设定下限间不断交替变换。设定上限最大不超过I. 5个标准大气压，最小要高于I. 3个标准大气压；设定下限最大不超过I. 3个标准大气压，最小要高于I个标准大气压；氧气体积分压为10%所述的调节恒温环境内气体压力为第一种情况恒温环境内气体的压力在培养过程中恒定不变。最大不超过I. 5个标准大气压，最小不低于I个标准大气压；氧气体积浓度为10%直至中空透氧模具内管外壁与外管内壁间培养液收干为止。4)后处理培养结束后，将上述的细菌纤维素浸泡至浓度为lwt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2小时，用纯净水清洗至pH为7. 0，材料内毒素〈O. 5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素高压灭菌并包装低温封存。实施例8I)发酵培养液的调配；发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨O. 5，酵母膏O. 5，柠檬酸O. I，磷酸氢二钠O. 2，磷酸二氢钾O. I，余量为水；发酵培养液的pH为5. O ;将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；2)菌种扩培；将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度菌种细胞数目在2X107个/ml。
3)静置培养；将扩培后的菌液与调配好的发酵培养液均匀混合后，灌入中空透氧模具内管外壁与外管内壁间的区域，置于恒温环境内，30°C静置培养。通过在培养过程中向中空透氧模具内管充入压力气体，同时调节恒温环境内的气体压力，培养管状细菌纤维素；通过缓释微球，使细菌纤维素在形成过程中原位包覆缓释微球，微球降解后，形成内部多孔结构；通过缓释微球在培养过程中缓慢释放氧气或糖源，提高细菌纤维素生产效率。所述的向中空透氧模具内管充入压力气体为第二种情况内管内压力气体在培养过程中，在压力设定上限和压力设定下限间不断交替变换。设定上限最大不超过I. 5个标准大气压，最小要高于I. 3个标准大气压；设定下限最大不超过I. 3个标准大气压，最小要高于I个标准大气压；氧气体积分压为10%、
所述的调节恒温环境内气体压力为第二种情况恒温环境内气体在培养过程中，在压力设定上限和压力设定下限间不断交替变换。设定上限最大不超过I. 5个标准大气压，最小要高于I. 3个标准大气压；设定下限最大不超过I. 3个标准大气压，最小要高于I个标准大气压；氧气体积分压为10%需要指出的是，中空透氧模具内管与外管应同时处于收缩或同时处于舒张状态。直至中空透氧模具内管外壁与外管内壁间培养液收干为止。4)后处理培养结束后，将上述的细菌纤维素浸泡至浓度为lwt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2小时，用纯净水清洗至pH为7. 0，材料内毒素〈O. 5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素高压灭菌并包装低温封存。实施例9I)发酵培养液的调配；发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨O. 5，酵母膏O. 5，柠檬酸O. I，磷酸氢二钠O. 2，磷酸二氢钾O. I，余量为水；发酵培养液的pH为5. O ;将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；2)菌种扩培；将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度菌种细胞数目在2X107个/ml。3)静置培养；将扩培后的菌液与调配好的发酵培养液均匀混合后，灌入中空透氧模具内管外壁与外管内壁间的区域，置于恒温环境内，30°C静置培养。通过在培养过程中向中空透氧模具内管充入压力气体，同时调节恒温环境内的气体压力，培养管状细菌纤维素；通过缓释微球，使细菌纤维素在形成过程中原位包覆缓释微球，微球降解后，形成内部多孔结构；通过缓释微球在培养过程中缓慢释放氧气或糖源，提高细菌纤维素生产效率。所述的向中空透氧模具内管充入压力气体为第二种情况内管内压力气体在培养过程中，在压力设定上限和压力设定下限间不断交替变换。设定上限最大不超过I. 5个标准大气压，最小要高于I. 3个标准大气压；设定下限最大不超过I. 3个标准大气压，最小要高于I个标准大气压；氧气体积分压为10%所述的调节恒温环境内气体压力为第三种情况恒温环境内气体的压力在培养过程中逐渐增加至设定上限。设定上限最大不超过I. 5个标准大气压,最小要高于I个标准大气压；氧气体积分压为10 50%所述的逐渐增加为连续性增压。连续性增压是指每分钟使内管内压力气体的压力上升O. 1%个标准大气压，直至恒温环境内气体的压力达到设定上限为止。直至中空透氧模具内管外壁与外管内壁间培养液收干为止。4)后处理
培养结束后，将上述的细菌纤维素浸泡至浓度为lwt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2小时，用纯净水清洗至pH为7. 0，材料内毒素〈O. 5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素高压灭菌并包装低温封存。实施例10I)发酵培养液的调配；发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨O. 5，酵母膏O. 5，柠檬酸O. I，磷酸氢二钠O. 2，磷酸二氢钾O. I，余量为水；发酵培养液的pH为5. O ;将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；2)菌种扩培；将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度菌种细胞数目在2X107个/ml。3)静置培养；将扩培后的菌液与调配好的发酵培养液均匀混合后，灌入中空透氧模具内管外壁与外管内壁间的区域，置于恒温环境内，30°C静置培养。通过在培养过程中向中空透氧模具内管充入压力气体，同时调节恒温环境内的气体压力，培养管状细菌纤维素；通过缓释微球，使细菌纤维素在形成过程中原位包覆缓释微球，微球降解后，形成内部多孔结构；通过缓释微球在培养过程中缓慢释放氧气或糖源，提高细菌纤维素生产效率。所述的向中空透氧模具内管充入压力气体为第二种情况内管内压力气体在培养过程中，在压力设定上限和压力设定下限间不断交替变换。设定上限最大不超过I. 5个标准大气压，最小要高于I. 3个标准大气压；设定下限最大不超过I. 3个标准大气压，最小要高于I个标准大气压；氧气体积分压为10 50%所述的调节恒温环境内气体压力为第三种情况恒温环境内气体的压力在培养过程中逐渐增加至设定上限。设定上限最大不超过I. 5个标准大气压,最小要高于I个标准大气压；氧气体积分压为10 50%所述的逐渐增加为阶段性增压。阶段性增压是指每小时是内管内压力气体的压力增加1%个标准大气压，直至恒温环境内气体的压力达到设定上限为止。直至中空透氧模具内管外壁与外管内壁间培养液收干为止。4)后处理
培养结束后，将上述的细菌纤维素浸泡至浓度为lwt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2小时，用纯净水清洗至pH为7. 0，材料内毒素〈O. 5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素高压灭菌并包装低温封存。实施例11I)发酵培养液的调配；发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨O. 5，酵母膏O. 5，柠檬酸O. I，磷酸氢二钠O. 2，磷酸二氢钾O. I，余量为水；发酵培养液的pH为5. O ;将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵 培养液；2)菌种扩培；将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度菌种细胞数目在2X107个/ml。3)静置培养；将扩培后的菌液与调配好的发酵培养液均匀混合后，灌入中空透氧模具内管外壁与外管内壁间的区域，置于恒温环境内，30°C静置培养。 通过在培养过程中向中空透氧模具内管充入压力气体，同时调节恒温环境内的气体压力，培养管状细菌纤维素；通过缓释微球，使细菌纤维素在形成过程中原位包覆缓释微球，微球降解后，形成内部多孔结构；通过缓释微球在培养过程中缓慢释放氧气或糖源，提高细菌纤维素生产效率。所述的向中空透氧模具内管充入压力气体为第三种情况内管内压力气体的压力在培养过程中逐渐增加至设定上限。设定上限最大不超过I. 5个标准大气压，最小要高于I个标准大气压；氧气体积分压为10%所述的逐渐增加为连续性增压。连续性增压是指每分钟使内管内压力气体的压力上升O. 1%个标准大气压，直至内管内压力气体的压力达到设定上限为止。所述的调节恒温环境内气体压力为第一种情况I)恒温环境内气体的压力在培养过程中恒定不变。最大不超过I. 5个标准大气压，最小不低于I个标准大气压；氧气体积浓度为10%直至中空透氧模具内管外壁与外管内壁间培养液收干为止。4)后处理培养结束后，将上述的细菌纤维素浸泡至浓度为lwt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2小时，用纯净水清洗至pH为7. 0，材料内毒素〈O. 5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素高压灭菌并包装低温封存。实施例12I)发酵培养液的调配；发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨O. 5，酵母膏O. 5，柠檬酸O. I，磷酸氢二钠O. 2，磷酸二氢钾O. I，余量为水；发酵培养液的pH为5. O ;将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；
2)菌种扩培；将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度菌种细胞数目在2X107个/ml。3)静置培养；将扩培后的菌液与调配好的发酵培养液均匀混合后，灌入中空透氧模具内管外壁与外管内壁间的区域，置于恒温环境内，30°C静置培养。通过在培养过程中向中空透氧模具内管充入压力气体，同时调节恒温环境内的气体压力，培养管状细菌纤维素；通过缓释微球，使细菌纤维素在形成过程中原位包覆缓释微 球，微球降解后，形成内部多孔结构；通过缓释微球在培养过程中缓慢释放氧气或糖源，提高细菌纤维素生产效率。所述的向中空透氧模具内管充入压力气体为第三种情况内管内压力气体的压力在培养过程中逐渐增加至设定上限。设定上限最大不超过I. 5个标准大气压，最小要高于I个标准大气压；氧气体积分压为10%所述的逐渐增加为阶段性增压。阶段性增压是指每小时是内管内压力气体的压力增加1%个标准大气压，直至内管内压力气体的压力达到设定上限为止。所述的调节恒温环境内气体压力为第一种情况恒温环境内气体的压力在培养过程中恒定不变。最大不超过I. 5个标准大气压，最小不低于I个标准大气压；氧气体积浓度为10%直至中空透氧模具内管外壁与外管内壁间培养液收干为止。4)后处理培养结束后，将上述的细菌纤维素浸泡至浓度为lwt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2小时，用纯净水清洗至pH为7. 0，材料内毒素〈O. 5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素高压灭菌并包装低温封存。实施例13I)发酵培养液的调配；发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨O. 5，酵母膏O. 5，柠檬酸O. I，磷酸氢二钠O. 2，磷酸二氢钾O. I，余量为水；发酵培养液的pH为5. O ;将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；2)菌种扩培；将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度菌种细胞数目在2X107个/ml。3)静置培养；将扩培后的菌液与调配好的发酵培养液均匀混合后，灌入中空透氧模具内管外壁与外管内壁间的区域，置于恒温环境内，30°C静置培养。通过在培养过程中向中空透氧模具内管充入压力气体，同时调节恒温环境内的气体压力，培养管状细菌纤维素；通过缓释微球，使细菌纤维素在形成过程中原位包覆缓释微球，微球降解后，形成内部多孔结构；通过缓释微球在培养过程中缓慢释放氧气或糖源，提高细菌纤维素生产效率。所述的向中空透氧模具内管充入压力气体为第三种情况
内管内压力气体的压力在培养过程中逐渐增加至设定上限。设定上限最大不超过I. 5个标准大气压，最小要高于I个标准大气压；氧气体积分压为10% ；所述的逐渐增加为连续性增压。连续性增压是指每分钟使内管内压力气体的压力上升O. 1%个标准大气压，直至内管内压力气体的压力达到设定上限为止。所述的调节恒温环境内气体压力为第二种情况恒温环境内气体在培养过程中，在压力设定上限和压力设定下限间不断交替变换。设定上限最大不超过I. 5个标准大气压，最小要高于I. 3个标准大气压；设定下限最大不超过I. 3个标准大气压，最小要高于I个标准大气压；氧气体积分压为10% ;直至中空透氧模具内管外壁与外管内壁间培养液收干为止。4)后处理
培养结束后，将上述的细菌纤维素浸泡至浓度为lwt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2小时，用纯净水清洗至pH为7. 0，材料内毒素〈O. 5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素高压灭菌并包装低温封存。实施例14I)发酵培养液的调配；发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨O. 5，酵母膏O. 5，柠檬酸O. I，磷酸氢二钠O. 2，磷酸二氢钾O. I，余量为水；发酵培养液的pH为5. O ;将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；2)菌种扩培；将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度菌种细胞数目在2X107个/ml。3)静置培养；将扩培后的菌液与调配好的发酵培养液均匀混合后，灌入中空透氧模具内管外壁与外管内壁间的区域，置于恒温环境内，30°C静置培养。通过在培养过程中向中空透氧模具内管充入压力气体，同时调节恒温环境内的气体压力，培养管状细菌纤维素；通过缓释微球，使细菌纤维素在形成过程中原位包覆缓释微球，微球降解后，形成内部多孔结构；通过缓释微球在培养过程中缓慢释放氧气或糖源，提高细菌纤维素生产效率。所述的向中空透氧模具内管充入压力气体为第三种情况内管内压力气体的压力在培养过程中逐渐增加至设定上限。设定上限最大不超过I. 5个标准大气压，最小要高于I个标准大气压；氧气体积分压为10%所述的逐渐增加为阶段性增压。阶段性增压是指每小时是内管内压力气体的压力增加1%个标准大气压，直至内管内压力气体的压力达到设定上限为止。所述的调节恒温环境内气体压力为第二种情况恒温环境内气体在培养过程中，在压力设定上限和压力设定下限间不断交替变换。设定上限最大不超过I. 5个标准大气压，最小要高于I. 3个标准大气压；设定下限最大不超过I. 3个标准大气压，最小要高于I个标准大气压；氧气体积分压为10%直至中空透氧模具内管外壁与外管内壁间培养液收干为止。
4)后处理培养结束后，将上述的细菌纤维素浸泡至浓度为lwt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2小时，用纯净水清洗至pH为7. 0，材料内毒素〈O. 5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素高压灭菌并包装低温封存。实施例15I)发酵培养液的调配；发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨O. 5，酵母膏O. 5，柠檬酸O. I，磷酸氢二钠O. 2，磷酸二氢钾O. I，余量为水；发酵培养液的pH为5. O ;将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；2)菌种扩培；将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度菌种细胞数目在2X107个/ml。3)静置培养；将扩培后的菌液与调配好的发酵培养液均匀混合后，灌入中空透氧模具内管外壁与外管内壁间的区域，置于恒温环境内，30°C静置培养。通过在培养过程中向中空透氧模具内管充入压力气体，同时调节恒温环境内的气体压力，培养管状细菌纤维素；通过缓释微球，使细菌纤维素在形成过程中原位包覆缓释微球，微球降解后，形成内部多孔结构；通过缓释微球在培养过程中缓慢释放氧气或糖源，提高细菌纤维素生产效率。所述的向中空透氧模具内管充入压力气体为第三种情况内管内压力气体的压力在培养过程中逐渐增加至设定上限。设定上限最大不超过I. 5个标准大气压，最小要高于I个标准大气压；氧气体积分压为10% ；所述的逐渐增加为连续性增压。连续性增压是指每分钟使内管内压力气体的压力上升O. 1%个标准大气压，直至内管内压力气体的压力达到设定上限为止。所述的调节恒温环境内气体压力为第三种情况恒温环境内气体的压力在培养过程中逐渐增加至设定上限。设定上限最大不超过I. 5个标准大气压，最小要高于I个标准大气压；氧气体积分压为10% ；所述的逐渐增加为连续性增压。连续性增压是指每分钟使内管内压力气体的压力上升O. 1%个标准大气压，直至恒温环境内气体的压力达到设定上限为止。直至中空透氧模具内管外壁与外管内壁间培养液收干为止。4)后处理培养结束后，将上述的细菌纤维素浸泡至浓度为lwt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2小时，用纯净水清洗至pH为7. 0，材料内毒素〈O. 5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素高压灭菌并包装低温封存。实施例16I)发酵培养液的调配；发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨O. 5，酵母膏O. 5，柠檬酸O. I，磷酸氢二钠O. 2，磷酸二氢钾O. I，余量为水；发酵培养液的pH为5. O ;将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；2)菌种扩培；
将所述的发酵培养液接种和扩 培；扩培程度菌种细胞数目在2X107个/ml。3)静置培养；将扩培后的菌液与调配好的发酵培养液均匀混合后，灌入中空透氧模具内管外壁与外管内壁间的区域，置于恒温环境内，30°C静置培养。通过在培养过程中向中空透氧模具内管充入压力气体，同时调节恒温环境内的气体压力，培养管状细菌纤维素；通过缓释微球，使细菌纤维素在形成过程中原位包覆缓释微球，微球降解后，形成内部多孔结构；通过缓释微球在培养过程中缓慢释放氧气或糖源，提高细菌纤维素生产效率。所述的向中空透氧模具内管充入压力气体为第三种情况内管内压力气体的压力在培养过程中逐渐增加至设定上限。设定上限最大不超过I. 5个标准大气压，最小要高于I个标准大气压；氧气体积分压为10%所述的逐渐增加为连续性增压。连续性增压是指每分钟使内管内压力气体的压力上升O. 1%个标准大气压，直至内管内压力气体的压力达到设定上限为止。所述的调节恒温环境内气体压力为第三种情况恒温环境内气体的压力在培养过程中逐渐增加至设定上限。设定上限最大不超过I. 5个标准大气压，最小要高于I个标准大气压；氧气体积分压为10%所述的逐渐增加为阶段性增压。阶段性增压是指每小时是内管内压力气体的压力增加1%个标准大气压，直至恒温环境内气体的压力达到设定上限为止。直至中空透氧模具内管外壁与外管内壁间培养液收干为止。4)后处理培养结束后，将上述的细菌纤维素浸泡至浓度为lwt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2小时，用纯净水清洗至pH为7. 0，材料内毒素〈O. 5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素高压灭菌并包装低温封存。实施例17I)发酵培养液的调配；发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨O. 5，酵母膏O. 5，柠檬酸O. I，磷酸氢二钠O. 2，磷酸二氢钾O. I，余量为水；发酵培养液的pH为5. O ;将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；2)菌种扩培；将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度菌种细胞数目在2X107个/ml。3)静置培养；将扩培后的菌液与调配好的发酵培养液均匀混合后，灌入中空透氧模具内管外壁与外管内壁间的区域，置于恒温环境内，30°C静置培养。通过在培养过程中向中空透氧模具内管充入压力气体，同时调节恒温环境内的气体压力，培养管状细菌纤维素；通过缓释微球，使细菌纤维素在形成过程中原位包覆缓释微球，微球降解后，形成内部多孔结构；通过缓释微球在培养过程中缓慢释放氧气或糖源，提高细菌纤维素生产效率。所述的向中空透氧模具内管充入压力气体为第三种情况内管内压力气体的压力在培养过程中逐渐增加至设定上限。设定上限最大不超过I. 5个标准大气压，最小要高于I个标准大气压；氧气体积分压为10%所述的逐渐增加为阶段性增压。阶段性增压是指每小时是内管内压力气体的压力增加1%个标准大气压，直至内管内压力气体的压力达到设定上限为止。所述的调节恒温环境内气体压力为第三种情况 恒温环境内气体的压力在培养过程中逐渐增加至设定上限。设定上限最大不超过I. 5个标准大气压，最小要高于I个标准大气压；氧气体积分压为10%所述的逐渐增加分为连续性增压。连续性增压是指每分钟使内管内压力气体的压力上升O. 1%个标准大气压，直至恒温环境内气体的压力达到设定上限为止。直至中空透氧模具内管外壁与外管内壁间培养液收干为止。4)后处理培养结束后，将上述的细菌纤维素浸泡至浓度为lwt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2小时，用纯净水清洗至pH为7. 0，材料内毒素〈O. 5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素高压灭菌并包装低温封存。实施例18I)发酵培养液的调配；发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨O. 5，酵母膏O. 5，柠檬酸O. I，磷酸氢二钠O. 2，磷酸二氢钾O. I，余量为水；发酵培养液的pH为5. O ;将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；2)菌种扩培；将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度菌种细胞数目在2X107个/ml。3)静置培养；将扩培后的菌液与调配好的发酵培养液均匀混合后，灌入中空透氧模具内管外壁与外管内壁间的区域，置于恒温环境内，30°C静置培养。通过在培养过程中向中空透氧模具内管充入压力气体，同时调节恒温环境内的气体压力，培养管状细菌纤维素；通过缓释微球，使细菌纤维素在形成过程中原位包覆缓释微球，微球降解后，形成内部多孔结构；通过缓释微球在培养过程中缓慢释放氧气或糖源，提高细菌纤维素生产效率。所述的向中空透氧模具内管充入压力气体为第三种情况内管内压力气体的压力在培养过程中逐渐增加至设定上限。设定上限最大不超过I. 5个标准大气压，最小要高于I个标准大气压；氧气体积分压为10% ；
所述的逐渐增加为阶段性增压。阶段性增压是指每小时是内管内压力气体的压力增加1%个标准大气压，直至内管内压力气体的压力达到设定上限为止。所述的调节恒温环境内气体压力为第三种情况恒温环境内气体的压力在培养过程中逐渐增加至设定上限。设定上限最大不超过I. 5个标准大气压，最小要高于I个标准大气压；氧气体积分压为10% ；所述的逐渐增加为阶段性增压。阶段性增压是指每小时是内管内压力气体的压力增加1%个标准大气压，直至恒温环境内气体的压力达到设定上限为止。直至中空透氧模具内管外壁与外管内壁间培养液收干为止。4)后处理 培养结束后，将上述的细菌纤维素浸泡至浓度为lwt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2小时，用纯净水清洗至pH为7. 0，材料内毒素〈O. 5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素高压灭菌并包装低温封存。
权利要求
1.一种管状多孔细菌纤维素的制备方法，其特征是采用中空透氧模具培养细菌纤维素，所述的中空透氧模具是由同轴的外管和内管嵌套组成，所述的外管内径与所述的内管外径差为I IOmm;所述的内管中通入压力气体，所述的内管外壁与外管内壁间充满接入菌种的培养液和缓释微球；所述的中空透氧模具外部为气体。
2.根据权利要求I所述的一种管状多孔细菌纤维素的制备方法，其特征在于，所述的中空透氧模具的内管与外管均由透氧材料根据所需修复的人体组织的实际形状、直径以及大小制作得到的；所述的中空透氧模具在外形上与人体乳内动脉、隐静脉、尿道、十二指肠或胆管的形状一致。
3.根据权利要求I所述的一种管状多孔细菌纤维素的制备方法，其特征在于，所述的透氧材料是指在常温常压下的氧气透过速率为100 IOOOmLnT2. s—1，孔隙均一度偏差〈±0.3的材料。
4.根据权利要求2或3所述的一种管状多孔细菌纤维素的制备方法，其特征在于，所述的透氧材料是指通过针织、机织或编织的方法将棉、纱、聚乙烯纤维、聚丙烯纤维和/或PET纤维制成的中空多孔材料，或通过模具一次成型将硅橡胶、膨体聚四氟乙烯、乳胶或陶瓷透氧材料制成的中空透氧支架。
5.根据权利要求I所述的一种管状多孔细菌纤维素的制备方法，其特征在于，所述的压力气体指内管中气体压力在设定下限与设定上限之间交替转换的气体，设定上限最大不超过I. 5个标准大气压，设定下限最小不低于I个标准大气压，转换频率为65 165次/分钟，其中压力气体的氧气体积浓度在10 100%范围内。
6.根据权利要求I所述的一种管状多孔细菌纤维素的制备方法，其特征在于，所述的中空透氧模具外部的气体指中空透氧模具外部的气体压力在设定下限与设定上限之间交替转换的气体，设定上限最大不超过I. 5个标准大气压，设定下限最小不低于I个标准大气压，转换频率为65 165次/分钟，其中气体的氧气体积浓度在10 100%范围内。
7.根据权利要求I所述的一种管状多孔细菌纤维素的制备方法，其特征在于，所述的接入菌种的培养液是指含菌种的发酵培养液；所述的菌种是指能够生物合成纤维素的微生物，包括木醋杆菌、产醋杆菌、醋化杆菌、巴氏醋杆菌、葡萄糖杆菌、农杆菌、根瘤菌、八叠球菌、洋葱假单胞菌、椰毒假单胞菌或空肠弯曲菌中的一种或几种；所述的缓释微球为具有皮芯结构，外径为50 250 Pm;其中，缓释微球内部含有过氧化合物、葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇；缓释微球囊壁材料为明胶、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、壳聚糖或胶原；所述的缓释微球在24 72小时内持续释放缓释微球内部物质，并在内部物质释放完毕后的72小时内，缓释微球囊壁以溶解或降解的方式消失。
8.根据权利要求I所述的一种管状多孔细菌纤维素的制备方法，其特征在于，所述的制备方法具体包括以下步骤 I)发酵培养液的调配； 发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇2 5，蛋白胨0. 05 0. 5，酵母膏0. 05 0. 5，柠檬酸0. 01 0. I，磷酸氢二钠0. 02 0. 2，磷酸二氢钾0. 01 0. I,余量为水； 发酵培养液的pH为4. 0 6. 0 ; 将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液； 2)菌种扩培； 将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度菌种细胞数目在2 X IO5 2 X IO7个/ml ; 3)静置培养； 将扩培后的菌液与调配好的发酵培养液以及缓释微球均匀混合后，灌入中空透氧模具内管外壁与外管内壁间的区域，置于恒温环境内，28 32°C静置培养； 通过在培养过程中向中空透氧模具内管充入压力气体，同时调节恒温环境内的气体压力，培养管状细菌纤维素；通过缓释微球，使细菌纤维素在形成过程中原位包覆缓释微球，微球降解后，形成内部多孔结构；通过缓释微球在培养过程中缓慢释放氧气或糖源，提高细菌纤维素生产效率； 所述的向中空透氧模具内管充入压力气体分为三种情况 1)内管内压力气体的压力在培养过程中恒定不变；最大不超过I.5个标准大气压，最小不低于I个标准大气压；氧气体积浓度为10 50% ； 2)内管内压力气体在培养过程中，在压力设定上限和压力设定下限间不断交替变换；设定上限最大不超过I. 5个标准大气压，最小要高于I. 3个标准大气压；设定下限最大不超过I. 3个标准大气压，最小要高于I个标准大气压；氧气体积浓度为10 50% ； 3)内管内压力气体的压力在培养过程中逐渐增加至设定上限；设定上限最大不超过I. 5个标准大气压，最小要高于I个标准大气压；氧气体积浓度为10 50% ； 所述的逐渐增加分为连续性增压和阶段性增压两种形式；连续性增压是指每分钟使内管内压力气体的压力上升0. 1%个标准大气压，直至内管内压力气体的压力达到设定上限为止；阶段性增压是指每小时是内管内压力气体的压力增加1%个标准大气压，直至内管内压力气体的压力达到设定上限为止； 所述的调节恒温环境内气体压力分为三种情况 1)恒温环境内气体的压力在培养过程中恒定不变；最大不超过I.5个标准大气压，最小不低于I个标准大气压；氧气体积浓度为10 50% ； 2)恒温环境内气体在培养过程中，在压力设定上限和压力设定下限间不断交替变换；设定上限最大不超过I. 5个标准大气压，最小要高于I. 3个标准大气压；设定下限最大不超过I. 3个标准大气压，最小要高于I个标准大气压；氧气体积浓度10 50% ； 3)恒温环境内气体的压力在培养过程中逐渐增加至设定上限；设定上限最大不超过I.5个标准大气压，最小要高于I个标准大气压；氧气体积浓度为10 50% ； 所述的逐渐增加分为连续性增压和阶段性增压两种形式；连续性增压是指每分钟使内管内压力气体的压力上升0. 1%个标准大气压，直至恒温环境内气体的压力达到设定上限为止；阶段性增压是指每小时是内管内压力气体的压力增加1%个标准大气压，直至恒温环境内气体的压力达到设定上限为止； 所述静止培养直至中空透氧模具内管外壁与外管内壁间培养液收干为止； 4)后处理； 培养结束后，将上述的细菌纤维素浸泡至浓度为I 10wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2 10小时，用纯净水清洗至pH为7. 0，材料内毒素〈O. 5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素高压灭菌并包装低温封存。
9.根据权利要求8所述的一种管状细菌纤维素的制备方法，其特征在于，所述的高压蒸汽灭菌后紫外辐照是指将所述发酵培养液置于高压灭菌锅内121°c灭菌处理30分钟后取出置于紫外灯下辐照冷却至室温。
10.根据权利要求8所述的一种管状细菌纤维素的制备方法，其特征在于，所述的通纯氧是指将医用氧以lL/min的速度通入上述的培养液中，并维持30分钟；所述的接种是指用灭菌后的接种环钩取适量保存于4°C下试管中的菌种，并转移至上述的发酵培养液中； 所述的扩培是指将接入菌种后的发酵培养液于28 32°C下摇床培养8 24小时。
全文摘要
本发明涉及一种管状多孔细菌纤维素的制备方法，采用双层透氧材料嵌套组成中空透氧模具培养细菌纤维素，通过精确调节中空透氧模具内管内部压力气体与外管外部气体的压力以及氧气体积浓度，使模具的内管与外管能够沿径向产生收缩/舒张的周期性交替变化。同时在培养液中加入可以缓慢释放氧气或糖源的缓释微球，制备出一种管状多孔细菌纤维素。本发明将细菌纤维素内部“有效区域”扩充一倍以上，缩短培养周期，使管状细菌纤维素外壁更致密，提高材料的缝合性，降低了植入人体后在缝合处发生内膜增生与血栓的机率，形成的多孔结构有利于细胞、营养物质进入材料内部。本发明材料制备周期短，制备过程绿色环保、简便快速、制备成本低廉。
文档编号C12R1/02GK102978255SQ201210575539
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月26日 优先权日2012年12月26日
发明者杨敬轩, 李喆, 郑羿, 王利群, 王华平, 陈仕艳, 张云 申请人:东华大学