专利名称：磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶组合物及其制备方法
磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶组合物及其制备方法发明领域:
本发明涉及磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶组合物及其制备方法。
背景技术：
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本发明是在申请号为201110451901.9的在先专利的基础上进行的。
超氧化物歧化酶Orgotein (Superoxide Dismutase, S0D),别名肝蛋白、奥谷蛋白，简称:S0D，是1938年Marn等人首次从牛红血球中分离得到的。SOD是生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内，如动物，植物，微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。SOD在生物体内的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标；现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损 细胞，复原自由基造成的对细胞伤害。由于现代生活压力，环境污染，各种辐射和超量运动都会造成氧自由基大量形成；因此，生物抗氧化机制中SOD的地位越来越重要。
SOD具有非均化分解作为富于反应性的游离活性氧的超氧化物阴离子自由基的活性。期待可以将SOD用于抗风湿药物、自身免疫性疾病治疗剂、心肌梗塞治疗剂和脏器移植，以及用于除去脑梗塞后的抗血栓剂使用时在生物体内产生的自由基，还可期待将其用于各种炎症等(参照日本专利第3070980号公报)。
SOD体内半衰期短(6-10min)、稳定性差、难以进入细胞内、与细胞膜亲和力小、具有抗原性，直接药用存在疗效差和有一定的副作用等缺点，有必要进行结构修饰和改造。对SOD的分子修饰包括化学修饰和酶切修饰。目前国内外大多采用一些不具有免疫原性的水溶性高分子化合物对SOD的非活性部位的氨基酸残基进行修饰。修饰剂主要有聚乙二醇(PEG)、右旋糖酐、聚蔗糖、药用淀粉、粘多糖等。经过不同手段修饰后的SOD保留了天然酶活性，而且显示出体内半衰期延长、稳定性增加、抗原性降低、毒副作用降低等优点(Shimizu T, Iwanaga Μ, YasunagaA.Protective role of glutathione synthesis onradiation-1nduceDNA damage in rabbit brain[J].CeI1-Mo1-Neurobiol, 1998, 18(3):299-310)。
磷脂是膜的主要组成成分，对膜的结构完整、膜的离子传输和分子识别等功能的正常发挥以及依赖于磷脂的蛋白质系统的活性等都起着决定作用。人体所有细胞中都含有磷脂，它是维持生命活动的基础物质。磷脂对活化细胞，维持新陈代谢，基础代谢及荷尔蒙的均衡分泌，增强人体的免疫力和再生力，都能发挥重大的作用。概括的讲磷脂的基本功用是:增强脑力，安定神经，平衡内分泌，提高免疫力和再生力，解毒利尿，清洁血液，健美肌肤，保持年轻，延缓衰老。
磷脂酰乙醇胺(PE, phosphatidyl ethanolamine),又名脑磷脂,是磷脂的一种，由甘油、脂肪酸、磷酸和乙醇胺组成的一种磷脂。存在于脑、神经、大豆等中。新鲜制品是无色固体，空气中易变为红棕色。有吸湿性。不溶于水和丙酮，微溶于乙醇，溶于氯仿和乙醚。由于其含有极性部分和非极性部分，极适宜在体内降解，无毒性，无免疫原性。作为载体有降低药物毒性、提高疗效、减少副作用和药物剂量的作用。也可用作抗氧剂。
本发明使用磷脂酰乙醇胺对铜/锌配位的，111位半胱氨酸巯基被羟乙基取代的来自于人的SOD进行结构修饰，以提高稳定性和活性，增强细胞亲和力，降低抗原性和毒副作用，为其临床应用提供支持。
本发明中，未特别指明的，所述SOD均指铜/锌配位的，111位半胱氨酸巯基被羟乙基取代的来自于人的S0D，为了描述方便，以下均用SOD来表示。发明内容:
本发明的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶(PE - S0D)组合物的结构如下式(I)所示，
权利要求
1.一种磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶组合物，如下式(I)所示，
2.根据权利要求1所述的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶组合物，其特征在于，SOD为铜/锌配位的，111位半胱氨酸巯基被羟乙基取代的来自于人的超氧化物歧化酶。
3.根据权利要求1或2所述的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶组合物，其特征在于，η为广4的整数，η的平均值为1.5^2.4，该组合物由25 40摩尔％的η=1的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶，35 50摩尔％的n=2的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶，10^20摩尔％的n=3的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶，5 15摩尔％的n=4的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶组成。
4.根据权利要求1或2所述的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶组合物，其特征在于，R选自Cn，C13，C15，C17的烷基。
5.一种权利要求f 4任一所述的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶组合物的制备方法，其特征在于，包括以下反应步骤: (1)乙二醇在二氯甲烷中与对硝基苯基氯甲酸酯以及吡啶反应，生成化合物(II)，乙二醇:对硝基苯基氯甲酸酯:吡啶的摩尔比为1:2 4:4 8，反应温度为O 30° C，反应时间3 5小时； (2)惰性气体保护条件下，化合物(III)与化合物(II)以氯仿为溶剂在三乙胺的作用下生成化合物(IV)，化合物(III):三乙胺:化合物(II)的摩尔比为1:20 30:8 12，反应温度为20 40° C，反应时间12 24h ； (3)将SOD溶于适当的溶剂获得的SOD溶液，搅拌的同时向该溶液中添加磷脂酰乙醇胺衍生物(IV)，生成组合物(I)； (4)精制方法，将步骤(3)所得磷脂酰乙醇胺化超氧化物歧化酶组合物吸附于离子交换树脂后，用溶液A洗脱除去未反应的S0D，再用溶液B洗脱磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶组合物，浓缩洗脱液既得精制组合物(I);
6.根据权利要求5所述的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶组合物的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所用溶剂选自水或水和有机溶剂的混合溶剂，优选水和有机溶剂的混合溶齐U，作为水，选自精制水、离子交换水、蒸馏水或注射用水，有机溶剂，选自异丙醇、N，N —二甲基甲酰胺、N—甲基吡咯烷酮、N，N—二甲基乙酰胺、环丁砜、二甲亚砜、丙酮、1，4 一二噁烷、甲醇，优选异丙醇。
7.根据权利要求5所述的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶组合物的制备方法，其特征在于，步骤(3)中磷脂酰乙醇胺衍生物(IV)与SOD的摩尔比为1:0.05、.4，优选1:0.1 0.25。
8.根据权利要求5所述的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶组合物的制备方法，其特征在于，步骤(3)的反应温度为(T30°C，反应时间为0.5 72小时，优选2 24小时。
9.根据权利要求5所述的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶组合物的制备方法，其特征在于，步骤(3)的搅拌速度为50 500rpm，优选100 300rpm。
10.根据权利要求5所述的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶组合物的制备方法，其特征在于，步骤⑷所用溶液A由无机盐浓度为5 IOOmmol，pH6 9的缓冲液和有机溶剂组成，缓冲液为20 90体积％，有机溶剂为10 80体积％ ;溶液B由无机盐浓度为150 400mmol, pH6 9的缓冲液和有机溶剂组成，缓冲液为20 90体积％，有机溶剂为10 80体积％。
11.根据权利要求10所述的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶组合物的制备方法，其特征在于，溶液A、B所用有机溶剂选自异丙醇、N, N 一二甲基甲酰胺、N —甲基吡咯烷酮、N,N-二甲基乙酰胺、环丁砜、二甲亚砜、丙酮、1，4 一二噁烷、甲醇，优选甲醇。
全文摘要
本发明涉及如式(I)所示的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶组合物及其制备方法，铜/锌配位的，111位半胱氨酸巯基被羟乙基取代的来自于人的超氧化物歧化酶(SOD)的一个以上的氨基被磷脂酰乙醇胺残基取代，式中n为取代基个数，n为1~4的整数，n的平均值为1.5~2.4，式中的R为C11，C13，C15，C17的烷基。如式(I)所示的组合物由25~40摩尔%的n=1的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶，35~50摩尔%的n=2的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶，10~20摩尔%的n=3的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶，5~15摩尔%的n=4的磷脂酰乙醇胺基超氧化物歧化酶组成。经过磷脂酰乙醇胺修饰后的SOD显示出稳定性增加、活性提高等优点。
文档编号C12N9/02GK103184196SQ20121057495
公开日2013年7月3日 申请日期2012年12月26日 优先权日2011年12月30日
发明者徐庆春, 秦玉霞, 黄海 申请人:辽宁中海康生物药业有限公司