专利名称：一种快速灌制聚丙烯酰胺凝胶的试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明所属领域为生物大分子检测领域，特别是涉及聚丙烯酰胺凝胶大分子检测领域。
背景技术：
在研究和诊断领域，聚丙烯酰胺凝胶是一种广泛运用的用于分离生物大分子(如脱氧核糖核酸(DNA)、核糖 核酸(RNA)、多肽、蛋白质以及它们的复合物等)的分离介质。运用此项技术的基本装置为一个两端开口的细管或一个三明治型的两块平板。细管和平板用具有一定的支持强度的材质制作，如玻璃和塑料等。首先将尚未凝固的聚丙烯酰胺溶液加入到上述形状的模具中，待聚丙烯酰胺凝固成胶后，可将生物样品加到凝胶的一端，凝胶的两端分别加上正负极电极，使生物样品分子在凝胶介质中移动。由于生物样品分子的移动速度不同，因而在一段时间后，不同移动速度的生物分子就能被有效分开。一般生物样品分子或经处理以后的生物样品分子带有负电荷，电泳过程中，它们从负极向正极移动。在一定电场下，生物分子在介质上的移动速率(泳动速率)取决于生物分子本身的电荷/质量比、生物分子的形状和大小以及介质的孔径。针对确定的样品，前两者是生物分子本身的特征，一般不会改变。操作者可以改变电泳介质的孔径来影响生物分子的泳动速率。聚丙烯酰胺凝胶的孔径首先取决于凝胶体系中丙烯酰胺单体及交联剂单体的总质量-体积浓度，即所谓的丙烯酰胺单体溶液的总质量-体积浓度，用％T表示，即％τ=(丙烯酰胺单体质量+交联剂单体质量)(克)+溶液总体积(毫升)X 100%。越高的％τ浓度，使形成的凝胶孔径越小，适合用于分离小分子量的生物分子。越低的％τ浓度，使形成的凝胶孔径越大，适合用于分离大分子量的生物分子。常用的分离生物分子的聚丙烯酰胺凝胶浓度为4%-30%不等。影响聚丙烯酰胺凝胶的另一个因素是交联剂单体质量占所有单体的质量百分t匕,用％c表示，即％C=交联剂单体质量+ (丙烯酰胺单体质量+交联剂单体质量)X 100%。在总的单体浓度(％τ)确定的情况下，使用越少的交联剂(％c越小)获得的凝胶孔径越大，反之亦然。常用的用于核酸分子分离的凝胶的％c为5% ;用于蛋白分子分离的凝胶的％C为
3.3%或2. 6%。此外还有其他一些原因可能会带来孔径大小的变化，如不完全的凝结和凝胶的水解等。凝胶介质中还含有用于调节pH值、离子强度等的缓冲液体系。一般用于核酸电泳,凝胶的缓冲液常为TAE(40mMTris-乙酸，IOmM EDTA)和TBE(90mM的Tris碱，90mM的硼酸和2mM的EDTA)。在非变性核酸电泳时，电泳过程保持在较低的温度，以维持核酸的结构，特别是用于分离核酸和蛋白质复合物的时候。如要使得分离的核酸分子变性(双链DNA解链；单链DNA和RNA 二级结构解体)，常在缓冲体系中加入足量的变性剂，如尿素和甲酰胺等，并维持较高的电泳温度。其它用于核酸电泳的缓冲液体系还有Tris/磷酸和Tris/双甘氨肽等。电泳缓冲液也使用同样成分的缓冲液，然而在核酸的变性电泳时，电泳缓冲液中常无需添加变性剂。蛋白分子表面由于没有大量的负电荷，大多数蛋白电泳都在变性条件下进行，在此条件下，蛋白在上样缓冲液中预先处理，使蛋白表面结合上大量带负电荷的SDS (十二烷基硫酸钠)分子基团，能够在电场力的驱动下有效泳动，即所谓的SDS-PAGE电泳。SDS-PAGE凝胶灌制的缓冲体系常用的是Laemmli体系(Laemmli, U. K. (1970) Nature,227，680-686.)。Laemmli体系包括分离胶和浓缩胶(也称为积层胶)两部分分离胶的缓冲液为O. 375M的Tris (用HCl滴定到ρΗ8· 8)，浓缩胶的缓冲液为O. 125Μ的Tris (用HCl滴定到ρΗ6· 8)。正负极电泳缓冲液为O. 024Μ的Tris, O. 192Μ的甘氨酸和O. 1%的SDS0另一种常用的缓冲液体系(Schaegger 体系)(Schaegger, H. and van Jagow, G. , (1987) Anal.Biochem. 166，368-379)为浓缩胶缓冲液含O. 75MTris，HCl滴定到ρΗ8· 45 ;分离胶缓冲液含 O. 9MTris, HCl 滴定到 pH8. 45 ;负极缓冲液为 O.1MTris 和 O. lMTricine，含 O. 1%SDS。正极缓冲液为O. 2MTris。其它缓冲液包括磷酸盐缓冲体系、Bis-Tris缓冲体系、Tris-乙酸体系、双甘氨酸肽-NaOH体系、PIPES-磷酸钠体系、HEPES/MOPS/MES/Bicine_NaOH体系、MOPS-KOH体系等。如要在非变性条件下分离蛋白质分子，则需在凝胶和缓冲液中忽略SDS。
凝胶在灌制后需要凝固才能作为有效的分离介质。丙烯酰胺单体在催化剂存在的情况下可以聚合成长的线性聚丙烯酰胺，如果体系中存在甲叉双丙烯酰胺、1，4-二丙烯酰基哌嗪、N，N’-双(丙烯酰)胱胺、酒石酸双丙烯酰胺或它们的混合物等交联剂，则在这些线性聚丙烯酰胺之间，可以通过交联剂形成桥连接体，由此构成网状聚丙烯酰胺。实验中一般使用过硫酸铵与N，N，N’，N’ -四甲基乙二胺(TEMED)组成的催化体系。由于上述两种物质均不稳定，因此操作者可在凝胶配制前临时加入新鲜上述试剂，即可使丙烯酰胺单体快速聚合。聚合后的聚丙烯酰胺即可用于电泳分离生物大分子等实验。凝胶分离介质可分为连续和不连续两种缓冲体系。连续缓冲体系是指整个凝胶使用一种缓冲体系配制，不连续缓冲体系是指凝胶的不同部位使用不同的缓冲体系。如Laemmli体系等。此外，聚丙烯酰胺凝胶的浓度可以是均一浓度，也可以是梯度渐变的浓度。常常后者分离的分子量范围更广，而前者更容易配制。如上所述聚丙烯酰胺凝胶电泳一般在碱性条件下进行。由于丙烯酰胺在碱性条件下会缓慢水解，所以灌制好的胶一般只能在4度存放一周左右。丙烯酰胺的缓慢水解会使得凝胶的分辨率和分离效果急剧下降。所以，聚丙烯酰胺凝胶一般现用现配。由于目前的生命科学和医学研究中极为常用，实验室自制凝胶需要较多的时间，因此在此环节，广大研究人员浪费了大量的时间。尽管，市场上有商业化的预制胶，但进口预制胶的价格极为昂贵。国产的替代品，由于质量不稳定，分离效果差而未得到广泛认可。因此该应用领域很需要一种可以大为缩减凝胶配制时间，而价格又相对低廉的介于自制凝胶和预制胶中间的产品。目前使用的凝胶均为无色透明。无色透明的凝胶其样品加样槽常常难以辨别，需要借助于光的折射来辨别，对于不熟练的实验人员具有一定的难度。由于难以辨别加样槽的位置，为加样操作也带来不便，使加样操作的效率降低。目前市场上虽有对应于加样槽的塑料框架销售，由于是塑料制品，因此只有少量固定的规格，当凝胶规格和塑料框架不匹配时，就不能提供任何帮助。此外，实验人员常常需要同时操作多块凝胶，每块凝胶含有不同的样品或样品组合，为标记不同的凝胶，一般使用记号笔在凝胶外侧的玻璃板上标上记号，但由于电泳缓冲液中的浸泡，标注的记号极易被洗刷掉，为后期不同凝胶的识别带来不便。因此，一种带有颜色的凝胶可有效解决以上的问题，并且颜色为凝胶的内在特征，因而不会因凝胶规格改变或电泳缓冲液的浸泡等原因使其失去其应有的功能。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种快速灌制聚丙烯酰胺凝胶的试剂盒，可以快速灌制聚丙烯酰胺凝胶，同时可长时间保存。另外本发明还公开了灌制碱性凝胶和酸性凝胶的试剂盒，包括含能产生颜色的物质的试剂盒。本发明还公开了试剂盒的应用。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种快速灌制聚丙烯酰胺凝胶的试剂盒，包括丙烯酰胺单体溶液和缓冲体系储备液。进一步，所述的丙烯酰胺单体溶液和缓冲体系储备液独立包装，所述丙烯酰胺单体溶液包括丙烯酰胺单体和交联剂单体，丙烯酰胺单体溶液的总质量-体积浓度(％T)为 2%-50%，优选为10%-40%。其中交联剂单体质量占总单体质量的百分比(％C)为1%-10%，更 优地为2-6%，丙烯酰胺单体溶液总质量-体积浓度是目标灌制凝胶浓度的1-10倍，优选为1-3倍，更优选为2倍，所述的缓冲液体系储存液的浓度为目标凝胶所使用的缓冲体系浓度的1-100倍，优选为1-20倍，更优选为1. 5-3倍，最优选为2倍。进一步，所述的丙烯酰胺单体溶液和缓冲体系储备液混合包装，所述丙烯酰胺单体溶液包括丙烯酰胺单体和交联剂单体，丙烯酰胺单体溶液的总质量-体积浓度(％T)为2%-50%，优选为10%-40%。其中交联剂单体质量占总单体质量的百分比(％C)为1%-10%，更优地为2-6%，丙烯酰胺单体溶液总质量-体积浓度是目标灌制凝胶浓度的1-10倍，优选为1-3倍，更优选为I倍，所述的缓冲液体系储存液的浓度为目标凝胶所使用的缓冲体系浓度的1-10倍，优选为1-3倍，最优选为I倍。进一步，所述的交联剂为甲叉双丙烯酰胺、1，4-二丙烯酰基哌嗪、N，N'-双(丙烯酰)胱胺、酒石酸双丙烯酰胺或它们的混合物。进一步，所述的缓冲体系储备液是TAE、TBE、Tris/磷酸、Tris/双甘氨肽、Laemmli体系、Schaegger体系、磷酸盐缓冲体系、Bis-Tris缓冲体系、Tris-乙酸体系、双甘氨酸肽-NaOH 体系、PIPES-磷酸钠体系、HEPES/MOPS/MES/Bicine_NaOH 体系或 MOPS-KOH 体系中的一种。进一步，所述的独立包装的丙烯酰胺单体溶液和/或缓冲体系储备液中包含能产生颜色物质，能产生颜色物质的浓度为O. 01 μ g/ml-lg/ml,优选为O.1 μ g/ml-0. lg/ml,更优选为I μ g/ml-10mg/ml，最优为10 μ g/ml-lmg/ml。进一步,所述的混合包装的丙烯酰胺单体溶液和缓冲体系储备液中包含能产生颜色物质，能产生颜色物质的浓度为O. 01 μ g/ml-lg/ml,优选为 O.1 μ g/ml-0. lg/ml,更优选为 I μ g/ml-lOmg/ml,最优为 10 μ g/ml-lmg/ml ο本发明所述试剂盒灌制的凝胶用于生物大分子的分离和分析，所述的生物大分子为脱氧核糖核酸(DNA )、核糖核酸(RNA )、多肽、蛋白质以及它们的复合物。本发明涉及的第一个方面为一套预混的灌胶缓冲液体系。由于丙烯酰胺在碱性条件下会水解，而目前绝大多数的电泳均在碱性条件下进行，因此如果将所有的灌胶试剂配制成单一的储存液，其中的丙烯酰胺就会发生水解，所以此种储存液的保存期十分短暂，一般不超过1-2周。因此必须牺牲一定的便利性，将碱性试剂和丙烯酰胺单体分放在不同的预制储存液中。按照人所熟知的常识，可以在物体内掺入可产生颜色的固体、液体、胶体、气体等物质使该物体着色，也可以在物体表面附上可产生颜色的固体、液体、胶体、气体等物质使该物体着色。本发明所述的凝胶灌制储存液中可预先加入可产生颜色的物质，使用可产生颜色的储存液灌制的凝胶凝结成固体凝胶后也带有相应颜色。本发明所涉及的凝胶灌制的储存液中可以预先掺入各种能使储存液带有颜色的物质，这些物质包括所有能使储备液带上颜色的固体，液体，胶体或气体。产生的的颜色包括红、黄、蓝以及由此三原色配伍出来的任何颜色。灌制凝胶的两个储备液中，可以在其中任一种储备液中加入可产生颜色的物质，也可以在两种储存液中都加入可产生颜色的物质。可产生颜色的物质在储存液中的质量浓度范围为O. 01 μ g/ml-lg/ml，各种有色物质加入量因其色度不同需要个别优化，合适的加入量应能使得形成的凝胶颜色清晰可辨。本发明具有的优点和积极效果是由于采用上述技术方案，储备液长期保存不降低质量，而且可以快速的配置聚丙酰胺凝胶，即满足快速配置的要求，又保证了配制凝胶的检测效果。配制有颜色的凝胶使凝胶外形轮廓较传统透明凝胶更易于分辨，保证了检测过 程的操作方便性。
具体实施例方式实施例1两个分离的储存液用于灌制核酸的凝胶。其中一个储存液为丙烯酰胺单体溶液体系。丙烯酰胺体系的PH〈7，即为酸性条件。在酸性条件下，丙烯酰胺不会发生水解，因而产品的保质期在4摄氏度条件下至少达12个月。丙烯酰胺的单体总浓度(％T)为40%，丙烯酰胺单体的浓度为目标凝胶的使用2倍。其中甲叉双丙烯酰胺所占的比例(％C)为5%，用于核酸的分离检测，另一个储存液为凝胶的缓冲体系，缓冲体系的浓度目标凝胶所使用的缓冲体系浓度的2倍，所述缓冲体系储备液的pH8. 8，用于核酸分子分离缓冲体系包括但不限于TAE、TBE、Tris/磷酸和Tris/双甘氨肽等可用于核酸分子分离分析的缓冲液。实施例2两个分离的储存液用于灌制蛋白分离凝胶的分离胶部分。丙烯酰胺的单体总浓度(%T)为30%，丙烯酰胺单体的浓度为目标凝胶的使用浓度(％Τ)的2倍。其中甲叉双丙烯酰胺所占的比例(％C)为3. 3%，用于蛋白质的检测。该独立储存液中还含有凝胶的缓冲体系，缓冲体系的浓度目标凝胶所使用的缓冲体系浓度的2倍。在Iaemmli体系中，分离胶的缓冲液为O. 375M的Tris，用HCl滴定到pH8. 8。用于蛋白质分子的分离缓冲液体系包括但不限于Laemmli体系、Schaegger体系、磷酸盐缓冲体系、Bis-Tris缓冲体系、Tris-乙酸体系、双甘氨酸肽-NaOH 体系、PIPES-磷酸钠体系、HEPES/MOPS/MES/Bicine-NaOH 体系、MOPS-KOH体系等。实施例3—个独立的储存液用于灌制蛋白分离凝胶浓缩胶部分。丙烯酰胺的单体总浓度(%T)为5%，丙烯酰胺单体的浓度为目标凝胶的使用浓度(％Τ)的I倍。其中甲叉双丙烯酰胺所占的比例(％C)为3. 3%，用于蛋白质的检测。该独立储存液中还含有凝胶的缓冲体系，缓冲体系的浓度目标凝胶所使用的缓冲体系浓度的I倍。在Iaemmli体系中，浓缩胶的缓冲液为O. 125M的Tris，用HCl滴定到pH6. 8。用于蛋白质分子的分离缓冲液体系包括但不限于Laemmli体系、Schaegger体系、磷酸盐缓冲体系、Bis-Tris缓冲体系、Tris-乙酸体系、双甘氨酸肽-NaOH 体系、PIPES-磷酸钠体系、HEPES/MOPS/MES/Bicine-NaOH 体系、MOPS-KOH体系等。实施例4实施例1所述的储存液制成试剂盒，用于进行核酸电泳时快速制备凝胶。制备方法如下将2倍于目标凝胶浓度的丙烯酰胺单体储备液(如实施例1中为40%)与2倍于目标凝胶缓冲体系的缓冲液储备液(如2倍浓度的TBE缓冲液)等体积混合。加入1/100体积的新鲜配制的10%过硫酸铵溶液及1/1000体积的TEMED (N, N，N’，N’ -四甲基二乙胺)，混匀。再将混合液倒入制胶的模具中，模具的最上方插入加样槽的齿形模具。待浓缩胶凝固后，拔出齿形模具，即可用于电泳分离核酸。终浓度20%的凝胶适合用于分析小分子核酸，如寡核苷酸等。 实施例5实施例2、3所述的储存液制成试剂盒，用于进行蛋白质电泳时快速制备凝胶。制备方法如下第一步制备下层分离胶。将2倍于目标凝胶浓度的丙烯酰胺单体储备液(如实施例2中为30%)与2倍于目标凝胶缓冲体系的缓冲液储备液(如2倍浓度的Iaemmli体系分离胶缓冲液)等体积混合。加入1/100体积的新鲜配制的10%过硫酸铵溶液及1/1000体积的TEMED。将混合液倒入制胶模具中，用水封住混合液的表面，以使混合液与空气隔绝。待分离胶聚合凝固后，倒去水封。第二步制备上层浓缩胶。取适量独立包装的浓缩胶储备液(如实施例3)，加入1/100体积的新鲜配制的10%过硫酸铵溶液及1/1000体积的TEMED，混匀后注入制胶模具中的分离胶上方，模具的最上方插入加样槽的齿形模具。待浓缩胶凝固后，拔出齿形模具，即可用于电泳，分离胶终浓度为15%的凝胶适合分离小分子量蛋白质(如分子量为IOKD的小蛋白质等)。实施例6本发明所述试剂盒的稳定性测试。用于灌制碱性胶的丙烯酰胺储存液为20%(%T)的丙烯酰胺单体溶液，其中甲叉双丙烯酰胺的比例(%C)为分别为5%、3. 3%、2. 6%三种。用于灌制碱性胶的缓冲体系储存液为2倍浓度的Laemmli体系分离胶缓冲液，即O. 75M的Tris(pH8. 8)。另一用于灌制碱性核酸分离胶的缓冲液体系为2倍浓度TAE缓冲液。另一用于灌制碱性核酸分离胶的缓冲液体系为2倍浓度TBE缓冲液。所有上述溶液置一份于37摄氏度一个月时间，置一份于4摄氏度六个月时间。放置结束后，将上述缓冲液与丙烯酰胺单体溶液1:1混合，加入1/100体积的新鲜配制的10%过硫酸铵溶液及1/1000体积的TEMED(N，N，N’，N’ -四甲基二乙胺)，混匀，置于室温。丙烯酰胺的聚合均可在30分钟内完成，见表I。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶可正常用于电泳分离实验。表1.第一横行中为丙烯酰胺储存液，第一竖列中为缓冲体系储存液。任两行的交汇处为两种溶液1:1混合后,加入TEMED和过硫酸铵后，30分钟内的聚合反应结果。表I
权利要求
1.一种快速灌制聚丙烯酰胺凝胶的试剂盒，包括丙烯酰胺单体溶液和缓冲体系储备液。
2.根据权利要求1所述的一种快速灌制聚丙烯酰胺凝胶的试剂盒，其特征在于，所述的丙烯酰胺单体溶液和缓冲体系储备液独立包装，所述丙烯酰胺单体溶液包括丙烯酰胺单体和交联剂单体，丙烯酰胺单体溶液的总质量-体积浓度为2%-50%，优选为10%-40% ;其中交联剂单体质量占总单体质量的百分比为1%_10%，更优地为2-6%，丙烯酰胺单体溶液总质量-体积浓度是目标灌制凝胶浓度的1-10倍，优选为1-3倍，更优选为2倍，所述的缓冲液体系储存液的浓度为目标凝胶所使用的缓冲体系浓度的1-100倍，优选为1-20倍，更优选为1. 5-3倍，最优选为2倍。
3.根据权利要求1所述的一种快速灌制聚丙烯酰胺凝胶的试剂盒，其特征在于，所述的丙烯酰胺单体溶液和缓冲体系储备液混合包装，所述丙烯酰胺单体溶液包括丙烯酰胺单体和交联剂单体，丙烯酰胺单体溶液的总质量-体积浓度为2%-50%，优选为10%-40% ;其中交联剂单体质量占总单体质量的百分比为1%_10%，更优地为2-6%，丙烯酰胺单体溶液总质量-体积浓度是目标灌制凝胶浓度的1-10倍，优选为1-3倍，更优选为I倍，所述的缓冲液体系储存液的浓度为目标凝胶所使用的缓冲体系浓度的1-10倍，优选为1-3倍，最优选为I倍。
4.根据权利要求2或3任一权利要求所述的一种快速灌制聚丙烯酰胺凝胶的试剂盒，其特征在于，所述的交联剂为甲叉双丙烯酰胺、1，4- 二丙烯酰基哌嗪、N，N’ -双(丙烯酰)胱胺、酒石酸双丙烯酰胺中的一种或几种的混合物。
5.根据权利要求1-3任一权利要求所述的一种快速灌制聚丙烯酰胺凝胶的试剂盒，其特征在于，所述的缓冲体系储备液是TAE、TBE、Tris/磷酸、Tris/双甘氨肽、Laemmli体系、Schaegger体系、磷酸盐缓冲体系、Bis-Tris缓冲体系、Tris-乙酸体系、双甘氨酸肽-NaOH体系、PIPES-磷酸钠体系、HEPES/MOPS/MES/Bicine-NaOH体系或MOPS-KOH体系中的一种。
6.根据权利要求2所述的一种快速灌制聚丙烯酰胺凝胶的试剂盒，其特征在于，所述的独立包装的丙烯酰胺单体溶液和/或缓冲体系储备液中包含能产生颜色的物质，能产生颜色的物质的浓度为O. 01 μ g/ml-lg/ml,优选为O.1 μ g/ml-O. lg/ml,更优选为I μ g/ml-10mg/ml,最优为 10 μ g/ml-lmg/ml。
7.根据权利要求3所述的一种快速灌制聚丙烯酰胺凝胶的试剂盒，其特征在于，所述的混合包装的丙烯酰胺单体溶液和缓冲体系储备液中包含能产生颜色的物质，能产生颜色的物质的浓度为 O. 01 μ g/ml-lg/ml,优选为 O.1 μ g/ml-0. lg/ml,更优选为 I μ g/ml-10mg/ml,最优为 10 μ g/ml-lmg/ml ο
8.权利要求2或6任一权利要求所述的试剂盒用于灌制碱性凝胶。
9.权利要求3或7任一权利要求所述的试剂盒用于灌制酸性凝胶。
10.上述任一项权利要求所述试剂盒灌制的凝胶用于生物大分子的分离和分析，所述的生物大分子为脱氧核糖核酸、核糖核酸、多肽、蛋白质以及它们的复合物。
全文摘要
本发明公开了一种快速灌制聚丙烯酰胺凝胶的试剂盒，包括丙烯酰胺单体溶液和缓冲体系储备液。其中丙烯酰胺单体溶液和缓冲体系储备液独立包装，用于灌制碱性凝胶，也可以混合包装用于灌制酸性凝胶。本发明的丙烯酰胺单体溶液和缓冲体系储备液可以包括有色物质。制备本发明具有的优点和积极效果是由于采用上述技术方案，可以快速的配制聚丙酰胺凝胶，而且长期保存不降低质量，即满足快速配制的要求，又保证了配制凝胶的检测准确性。配制有颜色的凝胶使凝胶外形轮廓较传统透明凝胶更易于分辨，保证了检测过程的操作方便性。
文档编号C12N15/10GK103013982SQ20121058604
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月28日 优先权日2012年12月28日
发明者赵波涛, 蔡春海, 杨德华 申请人:上海启动元生物科技有限公司