专利名称：产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAP5融合蛋白基因工程菌株及其构建方法
技术领域：
本发明涉及一种基因工程菌株及其构建方法。
背景技术：
降钙素基因相关肽(CGRP)是Rosenfeld等于1983年发现的一种生物活性肽，它与降钙素(CT)均来源于位于11号染色体的CT/CGRP基因，由于CT/CGRP基因不同的RNA编码而翻译成CGRP和CT，CGRP是应DNA基因重组和分子生物技术研究发现的一种由37个氨基酸组成的生物活性多肽，是迄今发现的最强的内源性扩血管肽类物质，对神经、心血管、呼吸、消化、骨骼肌、泌尿、生殖以及免疫等系统具有重要作用。CGRP的舒张冠状血管的作用远强于P物质，心钠素和去甲肾上腺素(NE)，比乙酰胆碱(Ach)、5-羟色胺(5-HT)等强10000倍左右，比异丙肾上腺素强10-100倍。 犬钩虫抗凝血肽(anticoagulant peptide, AcAPs)是犬钩虫吸血时,其头腺分泌一种具有抗凝血活性的物质，该物质本质是一种蛋白水解酶，具有延长血浆凝血酶原时间、抑制血液凝固以及促进纤维蛋白溶解的作用。AcAPs目前应用的有AcAP5，AcAP6，AcAPc2三种重组蛋白。其中rAcAP5由77个氨基酸组成，含10个半胱氨酸，形成5对二硫键(C6-C50，C15-C42，C21-C37，C25-C69，C50-C63)，主要由二硫键决定其二级结构，从而决定其生物活性。它是Xa因子(凝血因子)的高效特异性抑制剂，阻断凝血的共同途径，达到抗凝血作用。AcAPs的抗凝血、抗血栓作用，使其在临床上成为一种新的抗凝剂和抗血栓药物。然而目前这两种蛋白单独作用，效果单一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAP5融合蛋白基因工程菌株及其构建方法，该菌株可以生产CGRP-AcAP5融合蛋白，CGRP_AcAP5融合蛋白具有治疗高血压和抗血栓双重作用。本发明产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAP5融合蛋白基因工程菌株含有融合蛋白CGRP/AcAP5基因。所述融合蛋白CGRP/AcAP5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。上述产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAP5融合蛋白基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进行一、在CGRP和AcAP5融合基因内设计一个Kpn I酶切位点，合成核苷酸序列如SEQID NO :1所示的融合蛋白CGRP/AcAP5基因，并在融合蛋白CGRP/AcAP5基因两端分别添加BamHI和EcoR I酶切位点，然后克隆在pUC57载体上，获得pUC (CGRP/AcAP5)载体；二、将步骤一获得的pUC (CGRP/AcAP5)载体用BamHI和EcoR I双酶切，再与同样经BamHI和EcoR I双酶切的表达载体pGEX_6P_l连接，获得融合蛋白CGRP/AcAP5基因重组表达载体 pGEX-CGRP/AcAP5 ；
三、然后将载体pGEX-CGRP/AcAP5转化到大肠杆菌BL21 (DE3 )中，随机挑取转化菌37 °C过夜培养，采用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，用Kpn I单酶切，并用空白质粒PGEX-6P-1作为对照，将含有Kpn I酶切位点的质粒进行基因测序，测序结果正确的即为阳
性重组菌。本发明的有益效果本发明基因工程菌株可以生产CGRP_AcAP5融合蛋白，降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAP5之间作用互补且协同增效，CGRP-AcAP5融合蛋白具有抗血栓和治疗高血压双重作用。本发明基因工程菌株生产的融合蛋白的纯度为98%，融合蛋白表达量为38. 1%。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAP5融合蛋白基因工程菌株含有融合蛋白CGRP/AcAP5基因。
具体实施方式
二具体实施方式
一所述融合蛋白CGRP/AcAP5基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO 1 所示。
具体实施方式
三具体实施方式
一所述产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAP5融合蛋白基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进行一、在CGRP和AcAP5融合基因内设计一个Kpn I酶切位点，由上海生工公司合成核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示的融合蛋白CGRP/AcAP5基因，并在融合蛋白CGRP/AcAP5基因两端分别添加BamHI和EcoR I酶切位点，然后克隆在pUC57载体上，获得pUC (CGRP/AcAP5)载体；二、将步骤一获得的pUC (CGRP/AcAP5)载体用BamHI和EcoR I双酶切，再与同样经BamHI和EcoR I双酶切的表达载体pGEX_6P_l连接，获得融合蛋白CGRP/AcAP5基因重组表达载体 pGEX-CGRP/AcAP5 ；三、然后将载体pGEX-CGRP/AcAP5转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，随机挑取转化菌37°C过夜培养，采用质粒提取试剂盒(购买自北京艾德莱生物科技有限公司)提取质粒DNA，用Kpn I单酶切，并用相应的空白质粒PGEX-6P-1作为对照，将含有Kpn I酶切位点的质粒进行基因测序，测序结果正确的即为阳性重组菌；其中大肠杆菌BL21 (DE3)为购买得到；步骤二中pUC (CGRP/AcAP5)载体用BamHI和EcoR I双酶切的体系如下
[1S
pUC (CGRP/AcAP5)载体 20μΕ IOXM buffer6I^L
BamHI3 I^L
EcoR I3I^L
权利要求
1.产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAP5融合蛋白基因工程菌株，其特征在于该基因工程菌株含有融合蛋白CGRP/AcAP5基因。
2.根据权利要求1所述的产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAP5融合蛋白基因工程菌株，其特征在于所述融合蛋白CGRP/AcAP5基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
3.权利要求1所述的产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAP5融合蛋白基因工程菌株的构建方法，其特征在于该方法按以下步骤进行 一、在CGRP和AcAP5融合基因内设计一个KpnI酶切位点，合成核苷酸序列如SEQID NO :1所示的融合蛋白CGRP/AcAP5基因，并在融合蛋白CGRP/AcAP5基因两端分别添加BamHI和EcoR I酶切位点，然后克隆在pUC57载体上，获得pUC (CGRP/AcAP5)载体； 二、将步骤一获得的pUC(CGRP/AcAP5)载体用BamHI和EcoR I双酶切，再与同样经BamHI和EcoR I双酶切的表达载体pGEX_6P_l连接，获得融合蛋白CGRP/AcAP5基因重组表达载体 pGEX-CGRP/AcAP5 ； 三、然后将载体pGEX-CGRP/AcAP5转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，随机挑取转化菌37°C过夜培养，采用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，用Kpn I单酶切，并用空白质粒PGEX-6P-1作为对照，将含有Kpn I酶切位点的质粒进行基因测序，测序结果正确的即为阳性重组菌。
4.根据权利要求3所述的产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAP5融合蛋白基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤二中pUC (CGRP/AcAP5)载体用BamHI和EcoR I双酶切的体系如下 成分川黾 pUC (CGRP/AcAPS)载体20(iL IOxMbuffer6|iL BamEl3|iL EcoR I3|iL ddH2028|iL 酶切反应条件37°C水浴，IOh0
5.根据权利要求3所述的产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAP5融合蛋白基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤二中表达载体PGEX-6P-1双酶切的体系如下成分111 pGEX-6P-l20pL IO^M buffer%L·3 |JL \mJ EcoR I3|iL ddH2028jiL 酶切反应条件37°C水浴，IOh0
6.根据权利要求3所述的产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAP5融合蛋白基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤二中连接反应体系如下成分IIJ 5:1 _基_ CGRP/AcAP5OgL _切后 pGEX-6P-l 载体3nL T4 DNA 连接H2|iL10>-T4 DNA 连接_ buffer2pL 连接反应条件16°C水浴，8 12h。
全文摘要
产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAP5融合蛋白基因工程菌株及其构建方法，涉及一种基因工程菌株及其构建方法。本发明的目的在于提供一种产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAP5融合蛋白基因工程菌株及其构建方法，该菌株可以生产CGRP-AcAP5融合蛋白，该融合蛋白具有治疗高血压和抗血栓双重作用。该基因工程菌株含有融合蛋白CGRP/AcAP5基因。方法一、融合蛋白CGRP/AcAP5基因的合成；二、重组表达载体的构建；三、将重组表达载体转化到大肠杆菌中，提取转化菌质粒DNA，用KpnⅠ单酶切，基因测序，测序结果正确的为阳性重组菌。本发明用于生产具有抗血栓和治疗高血压双重作用的融合蛋白。
文档编号C12N15/70GK103013902SQ20121058566
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者余琼 申请人:黑龙江大学