从嗜热细菌中分离的编码dna聚合酶的dna的制作方法
【专利摘要】本发明属于基因工程领域，涉及从嗜热细菌中分离的编码DNA聚合酶的DNA及其编码的DNA聚合酶，更具体的涉及从Thermococcus?gammatolerans分离得到的编码DNA聚合酶的DNA及其编码的DNA聚合酶。本发明采用从嗜热细菌中分离出的编码DNA聚合酶的DNA，其具有如下序列之一：（i）具有序列表中SEQ?ID?NO.1所述的核苷酸序列；（ii）在（i）限定的核苷酸序列中缺失、插入、替换一个或多个核苷酸；其编码出的蛋白质即DNA聚合酶在PCR反应中具有较高的保真能力、较高的扩增效率以及耐高温性能。
【专利说明】从嗜热细菌中分离的编码DNA聚合酶的DNA
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，涉及从嗜热细菌中分离的编码DNA聚合酶的DNA及其编码的DNA聚合酶,更具体的涉及从Thermococcus gammatoIerans分离得到的编码DNA聚合酶的DNA及其编码的DNA聚合酶。
【背景技术】[0002]聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction),简称PCR,是一种在体外模拟体内核酸复制的分子生物学技术。其利用微量模板，在DNA聚合酶的作用下，沿引物的5’-3’方向不断添加与模板互补的核苷酸，重复该循环过程，实现在广3小时内将待扩增目的基因放大几百万倍的目的。该方法广泛应用于核酸检测、基因克隆、疾病诊断、分子标记育种等各个领域。影响PCR反应结果的主要因素，除模板和引物外，所使用的DNA聚合酶和反应体系直接决定了 PCR是否成功以及结果的可靠性，DNA聚合酶本身的耐热性、扩增效率、保真性、抗抑制剂等性能是评判其优劣的主要指标。在耐热DNA聚合酶出现以前，PCR主要通过大肠杆菌DNA聚合酶或噬菌体DNA聚合酶来实现，由于PCR反应需要高温变性、低温退火的过程，其操作繁琐、结果不稳定，直到从耐热微生物Thermus aquaticus YTl中分离得到能耐受高温变性的TaqDNA聚合酶(美国专利号:4，889，818)，才使得该技术成为分子生物学的一种常用手段。但Taq DNA聚合酶由于缺少3' _5’校正活性，其扩增过程中极易发生突变，且扩增特异性较差，严重影响下游实验。后来从Pyrococcus furiosus中分离出更耐热且具有校正活性的Pfu DNA聚合酶，其扩增突变率大大降低且特异性得到很大提高，扩增保真度是其他有校正活性DNA聚合酶的2-6倍；然而该酶效率低、扩增产物少、延伸时间长(lkb/2min)，限制了其在很多实验中的应用(美国专利号:5，545，552)。目前另一种DNA聚合酶KOD,来自鹿儿岛县小宝岛的含硫气孔中的超嗜热原始菌ThermococcuskodakaraensisKODl,其具有极强的3’ -5’外切酶活性、更快的延伸速度(lkb/30s),但由于其过强的外切活性，容易导致模板和引物的降解，产生非特异扩增且不适宜扩增长片段，通过突变减弱其外切活性又导致保真度极大的降低(美国专利号:6，033，859)。
【发明内容】
[0003]有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种从嗜热细菌中分离出的编码DNA聚合酶的DNA，其编码出的蛋白质即DNA聚合酶在PCR反应中具有较高的保真能力、较高的扩增效率以及耐高温性能。
[0004]为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案:
[0005]从嗜热细菌中分离出的编码DNA聚合酶的DNA，其具有如下序列之一:
[0006](i)具有序列表中SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列；
[0007](ii)在(i)限定的核苷酸序列中缺失、插入、替换一个或多个核苷酸。
[0008]本发明还提供一种DNA聚合酶，其具有如下氨基酸序列:
[0009](i)具有序列表中SEQ ID N0.2所不的氣基酸序列；[0010](ii)在(i)限定的氨基酸序列中缺失、插入、替换一个或多个氨基酸。
[0011]本发明的第三个目的是提供一种包含前述编码DNA聚合酶的DNA的表达载体。
[0012]本发明的第四个目的是提供一种制备前述DNA聚合酶的方法，包括用包含前述编码DNA聚合酶的DNA的表达载体转化宿主细胞，培养转化体，获得DNA聚合酶。具体步骤如下:
[0013](I)扩增如SEQ ID N0.1所述的基因片段，构建至含启动子的表达载体；
[0014](2)将表达载体转化至宿主菌，得到能生产适用于PCR反应的DNA聚合酶的重组细胞；
[0015](3)扩大培养该重组细胞，诱导后用于制备该DNA聚合酶；
[0016](4)利用凝胶介质，例如镍和肝素层析柱依次纯化该DNA聚合酶。
[0017]本发明的第五个目的是提供一种前述的DNA聚合酶在核酸扩增中的应用。
[0018]本发明的第六个目的是提供一种PCR扩增试剂盒，其包含有前述的DNA聚合酶。
[0019]另外，本发明还提供一种含有前述的DNA聚合酶的PCR反应体系，具体包括有:
[0020](I)反应的缓冲环境，包含 Tris-HCl，pH7.4-8.8;
[0021](2)反应体系中的K+离子浓度:l_30mMKCl ；
[0022](3)反应体系中的 NH4+ 离子浓度:0.5-14mM (NH4) 2S04 ；
[0023](4)反应体系中的Mg2+离子浓度:1.5-8.5mM MgCl2。
[0024]本发明人经过大量的研究发现，从某些细菌中尤其是本发明所述嗜热细菌中分离得到的能够编码DNA聚合酶的cDNA，核苷酸序列如序列表SEQ IDN0.1所示，其编码获得的DNA聚合酶，氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示，其在PCR反应中具有较高的保真能力、较高的扩增效率以及耐高温性能。
[0025]本发明所述嗜热细菌是指Thermococcus gammato Ierans,该细菌购自日本微生物菌种保藏中心(保藏编号:JCM: 11827)，其原始来源是从墨西哥瓜伊马斯(27° 01' N, 111° 24' W)超高温烟囱中分离得到的古细菌，其最适生长温度为88°C，最适pH为6.0。菌株的分离地具有高于地表数百倍的放射性，因此菌株能耐受高达30kG Y的Y 射线(Edmond Jolivet 等，IJSEM，2003，53 (3):847_851)。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1示DNA聚合酶Tga纯化产物SDS-PAGE检测结果。泳道I为处理后上清；泳道2为镍柱流穿产物；泳道3为肝素柱以含200mM NaCl洗脱产物；泳道4为肝素柱以含400mMNaCl洗脱产物。
[0027]图2不DNA聚合酶Tga扩增高GC复杂模板的应用。扩增Thermus thermophilusHB8GC含量为72.3%的1.5kb片段和GC含量71%的2kb片段。泳道I和7为Tga扩增1.5kb结果，2和8为Taq扩增1.5kb结果，3和9为Pfu扩增1.5kb结果；4和10为Tga扩增2kb结果，5和11为Taq扩增2kb结果，6和12为Pfu扩增2kb结果。
[0028]图3示DNA聚合酶Tga保真性。以蓝白斑方式测试不同DNA聚合酶保真性。
[0029]图4示DNA聚合酶Tga在快速PCR扩增中的应用。测试不同DNA聚合酶的延伸速度，以程序 98°C 2min, (98°C 10s, 68°C 5s、30s、lmin) 30Cycles 扩增 ADNA5kb 片段。泳道
1、5、9为Taq DNA聚合酶不同延伸时间扩增，2、6、10为Pfu DNA聚合酶扩增，3、7、11为KODDNA聚合酶扩增，4、8、12为Tga DNA聚合酶扩增。
【具体实施方式】
[0030]为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
[0031]实施例1.Thermococcus gammatolerans DNA聚合酶基因的克隆与表达
[0032]菌种购买于日本微生物菌种保藏中心(保藏编号JCM11827)，将购买的菌种以 12000rpm 离心 5min,弃上清；细胞沉淀参照 Wizard* Genomic DNAPurificationkit (Promega公司)提取基因组DNA,简要步骤如下:细胞沉淀以600 μ L NucleiLysis Solution重悬，80°C水浴5min裂解细胞；冷却至室温后，加入200μ L ProteinPreciptitation Solution,震荡混匀，冰浴5min ;12000rpm离心5min ;吸取上清至另一个干净的离心管，加入600 μ L异丙醇，混匀后冰浴IOmin ;12000rpm离心5min ;核酸沉淀以700 μ L70%乙醇洗漆两次，12000rpm离心5min后,弃上清,室温干燥核酸沉淀IOmin至无酒精味，加入50 μ L TE溶解。
[0033]根据Thermococcus gammato lerans DNA聚合酶基因序列，设计并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物:TgaF:gtaGGATCCatgattctggataccgattacataaccgaaaacg, TgaR: gtaGTCGACtcatttcttgcctttcactttcagccacgcgcc0 下划线部分 GGATCC 代表 BamHI酶切位点，GTCGAC代表Sal I酶切位点。按以下体系配制PCR反应液，50 μ L体系中包含:基因组 DNA50ng，引物 TgaF400nM, TgaR400nM, dNTPs200 μ Μ, 5 x PrimeSTAR*' Buffer(Mg2+Plus) 10 μ L, PrinieSTAR11: HS0.5 μ L (宝生物公司)。PCR 扩增程序为:98°C 2min，(94°C IOs ；55°C 20s ；68°C 2.5min)30cycles，68°C延伸 5min。PCR产物电泳并回收约 2.5kb条带，以BamH I和Sal I酶切，连接至同样酶切的含T7启动子载体中，转化至DH5 α感受态细胞中。
[0034]通过菌液PCR和酶切鉴定，得到的阳性质粒测序验证后转化至表达菌Rosetta (DE3)细胞中。挑取单菌落培养至OD6tltl=0.4，加入0.1mM IPTG诱导4h，收集菌体超声波破碎，SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。
[0035]实施例2.DNA聚合酶Tga的纯化
[0036] 将能正确表达DNA聚合酶Tga的菌种按1:100接种至500mL含200mL LB培养基的锥形瓶中，加入终浓度30mg/L的卡那霉素和34mg/L氯霉素，37°C 200rpm振荡培养至OD6tltl=0.4，加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导目的蛋白表达，于30°C诱导4h ;收集诱导后菌液，12000rpm 离心 2min,弃上清，细胞用 20mL buffer A (20mM Tris-HCl (pH7.8), 0.1MKCl, 50mM NaCl)加30mM咪唑重悬，于_80°C冰箱中冻存12h ;37°C溶解细胞，超声波破碎后于70°C水浴锅处理30min，12000rpm离心10min ;上清过镍亲和介质(IDA，国家生化工程技术研究中心)，以含400mM咪唑的buffer A洗脱；洗脱液过肝素亲和介质(国家生化工程技术研究中心)，以含200mM、400mM、600mM、lM NaCl的bufferA洗脱；收集各蛋白峰经SDS-PAGE检测，含200mM NaCl的bufferA能洗脱部分目的蛋白，含400mM的buffer A大量洗脱目的蛋白，纯度达到95%以上。将得到的产物透析至Storage buffer:20mM TrisHCl (ρΗ7.4)，0.1mM EDTA, 0.l%Tween20, 0.5%Nonidet P40, 0.1M KCl, 50% 甘油。[0037]实施例3.DNA聚合酶Tga反应体系测试
[0038]实施例2中得到的酶以72°C 30min掺入的核苷酸量确定活性，稀释为2.5u/ μ L，以荧光探针测试其3’-5’外切酶活性。以pUC19质粒为模板，设计引物PCR扩增约2.7kb片段确定DNA聚合酶Tga反应的最适pH及K+、NH4+、Mg2+离子浓度。配制IOXbuffer B: 500mMTris-HCl (pH7.4~8.8)，15mMMgCl2。反应体系为 20 μ L 含:10 X buffer B (pH7.4~8.8)2μ L,dNTPs(2.5mM) 1.6μ L,引物 PAs 及 PAa (10 μ Μ)各 0.5 μ L，Tga0.2 μ L，pUC19 (15ng/μ L)0.5μ L,按 94 °C 2min, (94°C 30s, 60 °C 30s, 72 °C 2min40s) 25cycles,最后 72。。延伸5min,电泳检测确定最适pH。同样流程测试PCR体系终浓度为lmM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM KCl 的扩增效果，含 0.5mM、2mM、4mM、6mM、8mM、10mM、12mM、14mM(NH4)2SO4 的扩增效果，含 1.5mM、2.5mM、3.5mM、4.5mM、5.5mM、6.5mM、7.5mM、8.5mMMgCl2 的扩增效果。结果 DNA 聚合酶 Tga 的最适反应 buffer 为:10 Xbuffer C4:500mM Tris-HCl (pH8.4), 150mMKCl，5mM (NH4)2SO4, 15mM MgCl2。
[0039]实施例4.DNA聚合酶Tga保真性测试
[0040]以pUC19质粒为模板，Taq DNA聚合酶(天根生化科技(北京)有限公司)、Pfu DNA聚合酶(天根生化科技(北京)有限公司)和Tga DNA聚合酶分别扩增，得到的片段以相同量加Dpn I消化去除模板，Aat II酶切扩增片段，自连后转化DH5 α细胞，涂布于含100 μ g/11^氨苄青霉素、4(^8/1111^-6&1、24118/1^ IPTG的平板，37°C培养过夜计数蓝白斑。按以下公式计算扩增错误率(Error rate, ER):ER=突变率/ (bpX扩增倍数)。计算结果，扩增错误率分别为:Taq DNA聚合酶1.40X 1(T5，Pfu DNA聚合酶4.13Χ 1(T6，Tga DNA聚合酶
4.26Χ 10_6，Tga与Pfu保真性能相当，高于Taq DNA聚合酶3倍。
[0041 ] 实施例5.DNA聚合酶Tga扩增高GC复杂模板和快速PCR的应用
[0042]扩增GC含量大于70%的复杂模板，结果Taq无法扩增得到任何条带；Pfu仅扩增得到少量产物，且存在非特异扩增现象；本发明的Tga DNA聚合酶能特异地扩增两种模板，在复杂模板扩增中有明显优势。
[0043]以不同延伸时间测试Taq、Pfu、KOD-Plus-Neo (TOYOBO)、Tga DNA聚合酶扩增ADNA5kb片段,设置两步法5s、30s、lmin延伸，结果Imin延伸Tga DNA聚合酶能扩增得到目的条带，其余酶均无扩增，说明本发明的TgaDNA聚合酶能简化PCR反应程序，缩短实验周期。
[0044]以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.从嗜热细菌中分离出的编码DNA聚合酶的DNA，其特征在于:其具有如下序列之一: (i)具有序列表中SEQID N0.1所示的核苷酸序列； (ii)在(i)限定的核苷酸序列中缺失、插入、替换一个或多个核苷酸。
2.—种DNA聚合酶，其特征在于:其具有如下氨基酸序列: (i)具有序列表中SEQID N0.2所示的氨基酸序列； (ii)在(i)限定的氨基酸序列中缺失、插入、替换一个或多个氨基酸。
3.包含权利要求1所述的DNA的表达载体。
4.制备权利要求2所述的DNA聚合酶的方法，其特征在于:包括用权利要求3所述的表达载体转化宿主细胞，培养转化体，获得DNA聚合酶。
5.权利要求2所述的DNA聚合酶在核酸扩增中的应用。
6.一种PCR扩增试剂盒，其特征在于包含有权利要求2所述的DNA聚合酶。
【文档编号】C12N9/12GK103898131SQ201210590758
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2012年12月31日 优先权日:2012年12月31日
【发明者】龙虎, 李春芳, 狄廷娣, 周裕程, 万强 申请人:思洛生物技术股份有限公司