植物药材鉴别方法及其数据库以及引子对的制作方法

植物药材鉴别方法及其数据库以及引子对的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种鉴别一植物药材种类的方法，包括：(a)获得一待测植物药材之DNA样本；(b)将该待测植物药材之DNA样本以至少一引子对进行一聚合酶链锁反应以获得一聚合酶链锁反应产物；(c)将该聚合酶链锁反应产物进行高解析双股分离动力分析以获得该待测植物药材的高解析双股分离动力分析图谱；以及(d)将待测植物药材的高解析双股分离动力分析图谱与一已知植物药材的高解析双股分离动力分析图谱进行比对。
【专利说明】植物药材鉴别方法及其数据库以及引子对
【技术领域】
[0001 ] 本发明系关于一种鉴别一植物药材种类的方法,且特别关于一种鉴别一植物药材种类的方法，其结合了使用特别设计之引子所进行的聚合酶链锁反应以及高解析双股分离动力分析(high-resolution melting analysis, HRMA),且此鉴别方法具有可快速并准确鉴别植物药材的优点。
【背景技术】
[0002]市售药材基原混杂，常有混用、代用与误用的情形，然而过去物种鉴定都必须由序列解析，并经由公开数据库搜寻比对才能完成鉴定，而如此耗费时间与成本，且无法达成快速鉴定。
[0003]用DNA辨识条形码来鉴别物种已广被国际认可，其中植物以转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)辨识度较高(Chen et al., 2010;Chiou etal.,2007;Heublj 2010;Shaw et al.，2002;Zhao et al.,2006;Ma et al., 2010;Miyamotoet al.，2006)。近年分析技术的进展逐渐以高解析双股分离动力分析(high-resolutionmelting analysis, HRMA)作为一种快速的辨识的方法(Zhou et al., 2011) ?
[0004]高解析双股分离动力分析(HRMA)的技术原理是利用在一定的温度范围内将聚合酶链锁反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增的产物先嵌入突光物质,而后进行高温解离，将双股变成单股，同时侦测放出的荧光讯号。荧光值随着温度变化而绘制出熔解曲线。利用辨识物种DNA片 段所具有独特的序列，因而形成独特的熔解曲线形状，如同DNA指纹图谱一样，具有很高的特异性、稳定性、重复性与鉴识度，可准确区别物种的同异，无需序列特异性探针或序列分析，被视为新一代的遗传扫描工具。
[0005]有鉴于植物物种鉴定所使用序列间的相近与相异，并考量应用性、成本、灵敏度及分辨率，因此目前鉴定物种之方法中，急需导入特定高效引子的组合并结合HRMA技术，以标准化的流程来快速厘清药材的基原。

【发明内容】

[0006]本发明提供一种鉴别一植物药材之种类的方法，包括:(a)获得一待测植物药材之DNA样本；(b)将该待测植物药材之DNA样本以至少一引子对进行一聚合酶链锁反应以获得一聚合酶链锁反应产物；(c)将该聚合酶链锁反应产物进行高解析双股分离动力分析以获得该待测植物药材的高解析双股分离动力分析图谱；以及(d)将待测植物药材的高解析双股分离动力分析图谱与一已知植物药材的高解析双股分离动力分析图谱进行比对。
[0007]本发明又提供一种建构用于鉴别一植物药材种类之数据库的方法，包括:(a)获得至少一种已知植物药材之DNA样本；(b)将该至少一种已知植物药材之DNA样本以相同之至少一引子对分别进行聚合酶链锁反应以获得分别之聚合酶链锁反应产物；(C)将该分别之聚合酶链锁反应产物进行高解析双股分离动力分析以获得该至少一种已知植物药材之分别的高解析双股分离动力分析图谱；以及(d)将该至少一种已知植物药材之分别的高解析双股分离动力分析图谱集合成一数据库。
[0008]本发明还提供一种用于鉴别一植物药材种类的数据库，其系根据上述之建构用于鉴别一植物药材种类之数据库的方法来建构。
[0009]本发明更提供一种用于鉴别一植物药材种类的引子对，包括:一顺向引子与一逆向引子的组合，其中该顺向引子系择自由下列所组成之群组:序列辨识号:1之引子、序列辨识号:2之引子、序列辨识号:3之引子、序列辨识号:4之引子、序列辨识号:5之引子、序列辨识号:6之引子及与序列辨识号:1、序列辨识号:2、序列辨识号:3、序列辨识号:4、序列辨识号:5或序列辨识号:6具70%以上序列相似度之引子，且其中该逆向引子系择自由下列所组成之群组:序列辨识号-J之引子、序列辨识号:8之引子、序列辨识号:9之引子、序列辨识号:10之引子、序列辨识号:11之引子、序列辨识号:12之引子及与序列辨识号:7、序列辨识号:8、序列辨识号:9、序列辨识号:10、序列辨识号:11或序列辨识号:12具70%以上序列相似度之引子。
【专利附图】

【附图说明】
[0010] 第1图显示本发明9对引子对分别对三七与黄芩之DNA样本聚合酶链锁反应所获得之产物进行电泳分析的结果。A JTR1-400F (序列辨识号:4) /ITR1-770R (序列辨识号:
8)；B:ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITR1-R2 (序列辨识号:7);C:1TRI_440F (序列辨识号:3)/ITR1-770R (序列辨识号:8) ；D:1TRI_440F (序列辨识号:3)/ITR1-R2 (序列辨识号:7) ；E:ITR1-530F (序列辨识号:2)/ITR1-770R (序列辨识号:8) ；F:ITR1-530F (序列辨识号:2) /ITR1-R2 (序列辨识号:7) ；G:1TRI_F2 (序列辨识号:I)/ITR1-550R (序列辨识号:
9)；H:ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITR1-470R (序列辨识号:10) ；1:1TRI_F2 (序列辨识号:I) /ITR1-210R (序列辨识号:12)。1:三七DNA样本；2:黄芩DNA样本；M:DNA分子量标准品O
[0011]第2a至2q图显示以引子对ITR1-F2 (序列辨识号:I)/ITRI_470R (序列辨识号:
10)对不同植物药材之DNA样本进行聚合酶链锁反应所获得之产物进行电泳分析的结果。
[0012]第3a至3q图显示以引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对不同植物药材之DNA样本进行聚合酶链锁反应所获得之产物进行电泳分析的结果。
[0013]第4图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:I) /ITR1-470R (序列辨识号:10)对十字花科之板蓝根Isatis indigotica所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0014]第5图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:I) /ITR1-470R (序列辨识号:10)对三白草科之蕺菜Houttuynia cordata所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0015]第6图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:I) /ITR1-470R (序列辨识号:10)对大戟科之扛香藤Mallotus repandus所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0016]第7图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:I) /ITR1-470R (序列辨识号:10)对小蘖科之柔毛淫羊藿Epimedium pubescens所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图
-1'TfeP曰。
[0017]第8图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:I) /ITR1-470R (序列辨识号:10)对山茱萸科之山茱萸Cornus offcinalis所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0018]第9图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对川续断科之川续断Dipsacus asperoides所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0019]第10图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1) /ITR1-470R (序列辨识号:10)对五加科之刺五加Acanthopanax senticosus所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图
-1'TfeP曰。
[0020]第11图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对天南星科之水半夏Typhonium flagelIiforme所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图
-1'TfeP曰。
[0021]第12图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITR1-470R (序列辨识号:10)对木通科之石月Stauntonia obovatifoliola所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图
-1'TfeP曰。
[0022]第13图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对木犀科之女贞Ligustrum Iucidus所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0023]第14图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对木兰科之八角茴香Illici um verum所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0024]第15图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对毛茛科之牡丹Paeonia suffruticosa所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0025]第16图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对水龙骨科之鹅掌金星蕨Phymatodes hastata所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图
-1'TfeP曰。
[0026]第17图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对冬青科之岗梅Ilex asprella Champ所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0027]第18图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITR1-470R (序列辨识号:10)对玄参科之玄参Scrophularia ningpoensis所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图
-1'TfeP曰。
[0028]第19图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对山柑科之山柑Capparis formosana所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0029]第20图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对禾本科之淡竹叶Lophatherum gracile所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0030]第21图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对列当科之肉灰蓉Cistanche deserticola所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0031]第22图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITR1-470R (序列辨识号:10)对百合科之平贝母FritiIlaria ussuriensis所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图
-1'TfeP曰。
[0032]第23图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对忍冬科之吕宋荚迷Viburnum Iuzonicum所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0033]第24图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对杜仲科之杜仲Eucommia ulmoides所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0034]第25图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对豆科之刺桐Erythrina variegata所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。[0035]第26图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对车前草科之车前Plantago asiatica所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0036]第27图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对防己科之粉防己Stephania tetrandra所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0037]第28图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对使君子科之使君子Quisqualis indica所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0038]第29图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对芸香科之黄柏Phellodendron chinense var.glabriusculum所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0039]第30图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对虎耳草科之常山Dichroa febrifuga所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0040]第31图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对金粟兰科之九节茶Chloranthus glabra所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0041]第32图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对金 丝桃科之地耳草Hypericum japonicum所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0042]第33图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对柳叶菜科之水丁香Ludwigia octovalvis所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0043]第34图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对苦木科之鸭胆子Brucea javanica所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0044]第35图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对茄科之白毛藤Solanum Iyratum所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0045]第36图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对香蒲科之水烛香蒲Typha angustifolia所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0046]第37图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对唇形科之丹参Salivia miltiorrhiza所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0047]第38图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对桔梗科之桔梗Platycodon grandif1rum所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0048]第39图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对桑科之桑Morus alba所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0049]第40图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:I)/ITR1-470R (序列辨识号:10)对桑寄生科之桑寄生TaxiIlus chinensis所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0050]第41图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对胡麻科之白芝麻Sesamum orientale所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0051]第42图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对马3?铃科之关木通Aristolochia manshuriensis所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0052]第43图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对马钱科之白埔姜Buddleia asiatica所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0053]第44图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对马鞭草科之蔓荆Vitex trifolia所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0054]第45图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对茜草科之白花蛇舌草Hedyotis diffusa所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0055]第46图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对商陆科之商陆Phytolacca asiatica所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0056]第47图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对旋花科之英丝子Cuscuta chinensis所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0057]第48图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对莎草科之莎草Cyperus rotundus所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0058]第49图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对苋科之川牛膝Cyathula officinalis所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0059]第50图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对蛇郝科之穗花蛇郝Balanophora laxif1ra所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0060]第51图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对无患子科之蒸枝Litchi chinensis所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0061]第52图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对紫金牛科之珠砂根Ardisia crenata所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0062]第53图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对紫草科之硬紫草Lithospermum erythrorrhizon所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0063]第54图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对紫董科之紫花地丁 Viola yedoensis所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0064]第55图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对菊科之云木香Aucklandia Iappa所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0065]第56图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对瑞香科之芫花Daphne genkwa所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0066]第57图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITR1-470R (序列辨识号:10)对葫芦科之绞股蓝Gynostemma pentaphyllum所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0067]第58图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对葡萄科之白蔹Ampelopsis japonica所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0068]第59图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对鼠李科之酸率仁Ziziphus jujube var.spinosa所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0069]第60图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对睡莲科之莲Nelumbo nucifera所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0070]第61图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对远志科之远志Polygala tenuifolia所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。[0071]第62图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对鸢尾科之射干Belamcanda chinensis所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0072]第63图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对蒺藜科之蔡藜Tribulus terrestris所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0073]第64图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对蝶形花科之鸡冠刺桐Erythrina crista-galli所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0074]第65图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITR1-470R (序列辨识号:10)对卫矛科之雷公藤Tripterygium wilfordii所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图
-1'TfeP曰。
[0075]第66图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对寥科之唐古特大黄Rheum tanguticum所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0076]第67图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对泽泻科之泽泻Alisma orientalis所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0077]第68图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对锦葵科之山芙蓉Hibiscus taiwanensis所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。 [0078]第69图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITR1-470R (序列辨识号:10)对爵床科之穿心莲Andrographis paniculata所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图
-1'TfeP曰。
[0079]第70图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对姜科之草豆蘧Alpinia katsumadai所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0080]第71图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:I)/ITR1-470R (序列辨识号:10)对蔷薇科之毛叶木瓜Chaenomeles cathayensis所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0081]第72图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对伞形科重齿毛当归Angelica pubescens f.biserrata所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0082]第73图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对罂粟科之元胡Corydalis yanhusuo所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0083]第74图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对弥猴桃科之元阔叶猕猴桃Actinidia Iatifolia所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0084]第75图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对兰科之白芨Bletilla striata所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0085]第76图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对萝摩科之芫花叶白前Cynanchum glaucescens所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图
-1'TfeP曰。
[0086]第77图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITR1-470R (序列辨识号:10)对茶茱萸科之青脆枝Nothapodytes foetida所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图P曰。
[0087]第78图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对雨久花科之布袋莲Eichhornia crassipe所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0088]第79图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对柿树科之柿子Diospyros kaki所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0089]第80图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对桃金娘科之澳洲茶树Melaleuca alternifolia所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0090]第81图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对龙脑香科之登吉红柳桉Shorea polysperma所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图
-1'TfeP曰。
[0091]第82图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对木麻黄科之木贼叶木麻黄Casuarina equisetfolia所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0092]第83图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对景天科之匙叶伽蓝菜Kalanchoe spathulata所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图
-1'TfeP曰。
[0093]第84图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对夹竹桃科之海檬果Cerbera manghas所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0094]第85图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对石蒜科之文珠兰Crinum asiaticum所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0095]第86图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对杨梅科之青杨梅Myrica adenophora所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0096]第87图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对松萝科之长松萝Usnea 1ngissima所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0097]第88图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对菠萝科之菠萝Ananas comosus所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0098]第89图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对漆树科之钝叶大果漆Semecarpus cuneiformis所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0099]第90图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITR1-470R (序列辨识号:10)对梧桐科之台湾梭稷树Reevesia formosana所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图
-1'TfeP曰。
[0100]第91图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对清风藤科之笔罗子Meliosma rigida所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0101]第92图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对槭树科之尖叶槭Acer kawakamii所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0102]第93图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITR1-470R (序列辨识号:10)对悬铃木科之英国梧桐Platanus acerifolia所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图P曰。
[0103]第94图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对番蒸枝科之里白瓜馥木Fissistigma glaucescen所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0104]第95图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对七叶树科之欧洲七叶树Aesculus hippocastanum所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0105]第96图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITR1-470R (序列辨识号:10)对胡桃科之黄杞Engelhardtia roxburghiana所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图
-1'TfeP曰。
[0106]第97图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对旅人蕉科之旅人蕉Ravenala madagascariensis所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0107]第98图显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:1)/ITRI_470R (序列辨识号:10)对龙舌兰科之棒叶虎尾兰Sansevieria cylindrical所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0108]第99图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4) /ITR1-R2 (序列辨识号:7)对十字花科之板蓝根Isatis in digotica所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0109]第100图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对三白草科之蕺菜Houttuynia cordata所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0110]第101图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对大戟科之扛香藤Mallotus repandus所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0111]第102图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4) /ITR1-R2 (序列辨识号:7)对小蘖科之柔毛淫羊藿Epimedium pubescens所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图
-1'TfeP曰。
[0112]第103图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对山茱萸科之山茱萸Cornus offcinalis所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0113]第104图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对川续断科之川续断Dipsacus asperoides所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0114]第105图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4) /ITR1-R2 (序列辨识号:7)对五加科之刺五加Acanthopanax senticosus所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图
-1'TfeP曰。
[0115]第106图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对天南星科之水半夏Typhonium flagelIiforme所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图
-1'TfeP曰。
[0116]第107图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4) /ITR1-R2 (序列辨识号:7)对木通科之石月Stauntonia obovatifoliola所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图
-1'TfeP曰。
[0117]第108图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对木犀科之女贞Ligustrum Iucidus所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0118]第109图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对木兰科之八角茴香Illicium verum所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0119]第110图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对毛茛科之牡丹Paeonia suffruticosa所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0120]第111图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对水龙骨科之鹅掌金星蕨Phymatodes hastate所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图
-1'TfeP曰。
[0121]第112图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对冬青科之岗梅Ilex asprella所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0122]第113图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4) /ITR1-R2 (序列辨识号:7)对玄参科之玄参Scrophularia ningpoensis所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图
-1'TfeP曰。
[0123]第114图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对山柑科之山柑Capparis formosana所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。 [0124]第115图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对禾本科之淡竹叶Lophatherum gracile所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0125]第116图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对列当科之肉灰蓉Cistanche deserticola所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0126]第117图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4) /ITR1-R2 (序列辨识号:7)对百合科之平贝母Friti I laria ussuriensis所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图
-1'TfeP曰。
[0127]第118图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对忍冬科之吕宋荚迷Viburnum Iuzonicum所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0128]第119图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对杜仲科之杜仲Eucommia ulmoides所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0129]第120图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对豆科之刺桐Erythrina variegata所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0130]第121图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对车前草科之车前Plantago asiatica所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0131]第122图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对防己科之粉防己Stephania tetrandra所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0132]第123图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对使君子科之使君子Quisqualis indica所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0133]第124图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对芸香科之黄柏Phellodendron chinense var.glabriusculum所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0134]第125图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对虎耳草科之常山Dichroa febrifuga所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。[0135]第126图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对金粟兰科之九节茶Chloranthus glabra所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0136]第127图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对金丝桃科之地耳草Hypericum japonicum所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0137]第128图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对柳叶菜科之水丁香Ludwigia octovalvis所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0138]第129图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对苦木科之鸭胆子Brucea javanica所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0139]第130图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对茄科之白毛藤(白英)Solanum Iyratum所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0140]第131图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对香蒲科之水烛香蒲Typha angustifolia所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0141]第132图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对唇形科之丹参Salivia miltiorrhiza所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0142]第133图引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对桔梗科之桔梗Platycodon grandiflorum所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0143]第134图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对桑科之桑Morus alba所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0144]第135图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对桑寄生科之桑寄生Taxillus chinensis所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0145]第136图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对胡麻科之白芝麻Sesamum orientale所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0146]第137图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对马3?铃科之关木通Aristolochia manshuriensis所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0147]第138图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对马钱科之白埔姜Buddleia asiatica所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0148]第139图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对马鞭草科之蔓荆Vitex trifolia所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0149]第140图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对茜草科之白花蛇舌草Hedyotis diffusa所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0150]第141图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对商陆科之商陆Phytolacca asiatica所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0151]第142图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对旋花科之英丝子Cuscuta chinensis所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0152]第143图显示显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对莎草科之莎草Cyperus rotundus所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0153] 第144图显示显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对觅科之川牛膝Cyathula officinalis所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。[0154]第145图显示显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对蛇郝科之穗花蛇郝Balanophora laxif1ra所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0155]第146图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对无患子科之蒸枝Litchi chinensis所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0156]第147图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对紫金牛科之珠砂根Ardisia crenata所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0157]第148图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对紫草科之硬紫草Lithospermum erythrorrhizon所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0158]第149图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对紫董科之紫花地丁 Viola yedoensis所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0159]第150图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对菊科之云木香Aucklandia Iappa所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0160]第151图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对瑞香科之芫花Daphne genkwa所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0161]第152图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4) /ITR1-R2 (序列辨识号:7)对葫芦科之绞股蓝Gynostemma pentaphyllum所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图 -1'TfeP曰。
[0162]第153图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对葡萄科之白蔹Ampelopsis japonica所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0163]第154图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对鼠李科之酸率仁Ziziphus jujube var.spinosa所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0164]第155图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对睡莲科之莲Nelumbo nucifera所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0165]第156图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对远志科之远志Polygala tenuifolia所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0166]第157图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对鸢尾科之射干Belamcanda chinensis所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0167]第158图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对蒺藜科之蔡藜Tribulus terrestris所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0168]第159图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对蝶形花科之鸡冠刺桐Erythrina crista-galli所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0169]第160图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4) /ITR1-R2 (序列辨识号:7)对卫矛科之雷公藤Tripterygium wilfordii所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图
-1'TfeP曰。
[0170]第161图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对寥科之唐古特大黄Rheum tanguticum所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0171]第162图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对泽泻科之泽泻Alisma orientalis所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0172]第163图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对锦葵科之山芙蓉Hibiscus taiwanensis所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0173]第164图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4) /ITR1-R2 (序列辨识号:7)对爵床科之穿心莲Andrographis paniculata所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图
-1'TfeP曰。
[0174]第165图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对姜科之草豆蘧Alpinia katsumadai所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0175]第166图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对蔷薇科之毛叶木瓜Chaenomeles cathayensis所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图
-1'TfeP曰。
[0176]第167图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对伞形科重齿毛当归Angel ica pubescens f.biserrata所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0177]第168图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对罂粟科之元胡Corydalis yanhusuo所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0178]第169图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对弥猴桃科之元阔叶猕猴桃Actinidia Iatifolia所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0179]第170图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对兰科之白芨Bletilla striata所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0180]第171图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对萝摩科之芫花叶白前Cynanchum glaucescens所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图
-1'TfeP曰。
[0181]第172图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4) /ITR1-R2 (序列辨识号:7)对茶茱萸科之青脆枝Nothapodytes foetida所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图
-1'TfeP曰。
[0182]第173图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对雨久花科之布袋莲Eichhornia crassipe所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0183]第174图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对柿树科之柿子Diospyros kaki所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0184]第175图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对桃金娘科之澳洲茶树Melaleuca alternifolia所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0185]第176图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4) /ITR1-R2 (序列辨识号:7)对龙脑香科之登吉红柳桉Shorea polysperma所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图
-1'TfeP曰。[0186]第177图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对木麻黄科之木贼叶木麻黄Casuarina equisetfolia所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0187]第178图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对景天科之匙叶伽蓝菜Kalanchoe spathulata所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图
谱
[0188]第179图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对夹竹桃科之海檬果Cerbera manghas所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0189]第180图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对石蒜科之文珠兰Crinum asiaticum所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0190]第181图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对杨梅科之青杨梅Myrica adenophora所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0191]第182图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对松萝科之长松萝Usnea 1ngissima所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0192]第183图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对菠萝科之菠萝Ananas comosus所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0193]第184图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对漆树科之钝叶大果漆Semecarpus cuneiformis所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0194]第185图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4) /ITR1-R2 (序列辨识号:7)对梧桐科之台湾梭稷树Reevesia formosana所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图
-1'TfeP曰。
[0195]第186图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对清风藤科之笔罗子Meliosma rigida所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0196]第187图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对槭树科之尖叶槭Acer kawakamii所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0197]第188图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4) /ITR1-R2 (序列辨识号:7)对悬铃木科之英国梧桐Platanus acerifolia所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图
-1'TfeP曰。
[0198]第189图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对番蒸枝科之里白瓜馥木Fissistigma glaucescen所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0199]第190图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对七叶树科之欧洲七叶树Aesculus hippocastanum所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0200]第191图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4) /ITR1-R2 (序列辨识号:7)对胡桃科之黄杞Engelhardtia roxburghiana所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图
-1'TfeP曰。
[0201]第192图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对旅人蕉科之旅人蕉Ravenala madagascariensis所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0202]第193图显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对龙舌兰科之棒叶虎尾兰Sansevieria cylindrica所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0203]第194(a)至(f)图分别显示引子对ITR1-F2 (序列辨识号:I)/ITR1-470R (序列辨识号:10)对白薇与白前、墨旱莲与红旱莲、蒙古黄耆与红耆、川牛膝与怀牛膝、川木香与云木香，以及半夏与水半夏混用植物药材所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。[0204] 第195(a)至(f)图分别显示引子对ITR1-400F (序列辨识号:4)/ITRI_R2 (序列辨识号:7)对白薇与白前、墨旱莲与红旱莲、蒙古黄耆与红耆、川牛膝与怀牛膝、川木香与云木香，以及半夏与水半夏混用植物药材所复制出之片段的高解析双股分离动力分析图谱。
[0205]第196图显示同一批怀牛膝之DNA样本与同一批川牛膝之DNA样本分别进行多次聚合酶链锁反应后之高解析双股分离动力分析的结果。
[0206]为了让本发明之上述和其它目的、特征、和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附图示，作详细说明如下:
【具体实施方式】
[0207]本发明一实施例中，本发明提供一种鉴别一植物药材种类的方法。本发明之鉴别一植物药材种类的方法可包括下述步骤，但不限于此。
[0208]首先获得一待测植物药材之DNA样本。在一实施例中，获得待测植物药材之DNA样本的方式可以一般DNA萃取方法来进行，例如以十六烷基三甲基溴化铵(hexadecy I trimethyl ammonium bromide, CTAB)等试剂来对植物药材进行DNA萃取,但不限于此。
[0209]接着，可将所获得之待测植物药材之DNA样本以至少一引子对进行一聚合酶链锁反应以获得一聚合酶链锁反应产物。
[0210]上述至少一引子对可根据在植物基因体DNA序列之转录18S核糖体RNA区域至转录28S区域核糖体RNA区域之间的序列所设计，而植物基因体DNA序列之转录18S核糖体RNA区域至转录28S区域核糖体RNA区域之间的序列包括转录18S核糖体RNA区域之序列、转录间隔区(internal transcribed spacer) I (ITSl)之序列、转录5.8S核糖体RNA区域之序列、转录间隔区2(ITS2)之序列与转录28S核糖体RNA区域之序列。对于植物基因体DNA序列之转录18S核糖体RNA区域至转录28S区域核糖体RNA区域之间的转录间隔区I(ITSl)与转录间隔区2而言，不同种类之植物的序列差异度大，因此在一实施例中，可以转录18S核糖体RNA之保守区域、转录28S核糖体RNA之保守区域或转录间隔区I(ITSl)与转录间隔区2(ITS2)较保守区域为设计引子之区域。此外，于本发明之鉴别一植物药材之种类的方法中所使用之至少一引子对，对各种不同之植物皆可进行聚合酶链锁反应并获得具专一性的聚合酶链锁反应，具备优良之功效。
[0211]在一实施例中，上述至少一引子对可包括至少一顺向引子与至少一逆向引子的组合。[0212]上述至少一顺向引子可择自由下列所组成之群组，但不限于此:序列辨识号:1之引子、序列辨识号:2之引子、序列辨识号:3之引子、序列辨识号:4之引子、序列辨识号:5之引子、序列辨识号:6之引子及与序列辨识号:1、序列辨识号:2、序列辨识号:3、序列辨识号:4、序列辨识号:5或序列辨识号:6具70%、80%或90%以上序列相似度之引子。
[0213]又，上述至少一逆向引子可择自由下列所组成之群组，但也不限于此:序列辨识号:7之引子、序列辨识号:8之引子、序列辨识号:9之引子、序列辨识号:10之引子、序列辨识号:11之引子、序列辨识号:12之引子及与序列辨识号:7、序列辨识号:8、序列辨识号:
9、序列辨识号:10、序列辨识号:11或序列辨识号:12具70%、80%或90%以上序列相似度之引子。[0214]而在一实施例中，上述至少一引子对可包括，但不限于序列辨识号:1之引子与序列辨识号:9之引子的组合、序列辨识号:1之引子与序列辨识号:10之引子的组合、序列辨识号:1与序列辨识号:12之引子的组合、序列辨识号:2之引子与序列辨识号:7之引子的组合、序列辨识号:2之引子与序列辨识号:8之引子的组合、序列辨识号:3之引子与序列辨识号:7之引子的组合、序列辨识号:3之引子与序列辨识号:8之引子的组合、序列辨识号:4之引子与序列辨识号:7之引子的组合及/或序列辨识号:4之引子与序列辨识号:8之引子的组合等。
[0215]在一特定之实施例中，上述至少一引子对可为序列辨识号:1之引子与序列辨识号:10之引子的组合。又，另一特定实施例中，上述至少一引子对可为序列辨识号:4之引子与序列辨识号:7之引子的组合。
[0216]然后，在获得上述聚合酶链锁反应产物之后，将上述聚合酶链锁反应产物进行高解析双股分离动力分析(high-resolution melting analysis, HRMA)以获得上述待测植物药材的高解析双股分离动力分析图谱。
[0217]再来，将上述待测植物药材的高解析双股分离动力分析图谱与一已知植物药材的高解析双股分离动力分析图谱进行比对，其中若上述待测植物药材的高解析双股分离动力分析图谱与上述已知植物药材的高解析双股分离动力分析图谱一致，则确认上述待测植物药材与上述已知植物药材相同,而若上述待测植物药材的高解析双股分离动力分析图谱与上述已知植物药材的高解析双股分离动力分析图谱不一致，则确认上述待测植物药材与上述已知植物药材不同或混有其它药材。
[0218]上述已知植物药材的高解析双股分离动力分析图谱，可由上述已知植物药材之DNA根据与上述相同之至少一引子对而产生的聚合酶链锁反应产物进行高解析双股分离动力分析所获得。
[0219]在一实施例中，上述已知植物药材的高解析双股分离动力分析图谱可获自一数据库，但不限于此。上述数据库可由将至少一种已知植物药材之DNA分别根据与上述相同之至少一引子而产生的聚合酶链锁反应产物进行高解析双股分离动力分析所分别获得的高解析双股分离动力分析图谱所组成。
[0220]在另一实施例中，将待测植物药材之DNA样本以上述至少一引子对来进行聚合酶链锁反应之时，可同时将已知植物药材之DNA样本以相同之至少一引子对来进行另一聚合酶链锁反应，以一并获得已知植物药材之聚合酶链锁反应产物。又，将上述待测植物药材之聚合酶链锁反应产物进行高解析双股分离动力分析而获得上述待测植物药材的高解析双股分离动力分析图谱之时，可一并将已知植物药材之聚合酶链锁反应产物进行高解析双股分离动力分析以获得已知植物药材之高解析双股分离动力分析图谱。
[0221]再者，如上所述，由于本发明之鉴别一植物药材之种类的方法中所使用之至少一引子对，对各种不同之植物皆可进行聚合酶链锁反应并获得具专一性的聚合酶链锁反应，因此本发明之鉴别一植物药材之种类的方法可用于鉴别各种不同植物。在一实施例中，适用于上述鉴别植物药材的方法之植物药材的科别的例子可包括，例如，十字花科、三白草科、大戟科、小蘖科、山茱萸科、川续断科、五加科、天南星科、木通科、木犀科、木兰科、毛茛科、水龙骨科、冬青科、玄参科、山柑科、禾本科、列当科、百合科、忍冬科、杜仲科、豆科、车前草科、防己科、使君子科、芸香科、虎耳草科、金粟兰科、金丝桃科、柳叶菜科、苦木科、茄科、香蒲科、唇形科、桔梗科、桑科、桑寄生科、胡麻科、马3?铃科、马钱科、马鞭草科、菌草科、商陆科、旋花科、莎草科、苋科、蛇菰科、无患子科、紫金牛科、紫草科、紫董科、菊科、瑞香科、葫芦科、葡萄科、鼠李科、睡莲科、远志科、鸢尾科、蒺藜科、蝶形花科、卫矛科、寥科、泽泻科、锦葵科、锦葵科、爵床科、姜科、蔷薇科、伞形科、罂粟科、猕猴桃科、兰科、萝摩科、茶茱萸科、雨久花科、柿树科、桃金娘科、龙脑香科、木麻黄科、景天科、夹竹桃科、石蒜科、杨梅科、松萝科、菠萝科、漆树科、梧桐科、清风藤科、槭树科、悬铃木科、番荔枝科、七叶树科、胡桃科、旅人蕉科与龙舌兰科等，但不限于此。
[0222]十字花科之植物可包括，但不限于，板蓝根(Isatis indigotica)等。三白草科之植物可包括，但不限于，蕺菜(Houttuynia cordata)等。大戟科植物的例子可包括，但不限于扛香藤(Mallotus repandus)、甘遂(Euphorbia Kansui)、大戟(Euphorbiapekinensis)等。小蘖科植物的例子可包括,但不限于朝鲜淫羊藿(Epimediium koreamun)、柔毛淫羊藿(Epimedium pubescens)、八角莲(Dysosma pleiantha)、十大功劳(Mahoniajaponica)等。山茱萸科之植物可包括,但不限于，山茱萸(Cornus offcinalis)等。川续断科之植物可包括，但不限于，川续断(Dipsacus asperoides)等。五加科之植物的例子可包括，例如三七(P anax notoginseng)、西洋参(Panax quinquefolium)、刺五加 (Acanthopanax senticosus)、细柱五加 (Acanthopanax gracilistylus)、三叶五加(Eleutherococcus trifoliatus var.trifoliatus)> 人参(Panax ginseng)等，但不限于此。天南星科之植物可包括，但不限于异叶半夏(Pinellia pedatisecta)、水半夏(Typhonium flagelliforme)、半夏(Pinellia ternata)、独角莲(Typhonium giganteum)等。木通科之植物可包括石月(Stauntonia obovatifoliola)等，但不限于此。木犀科之植物可包括女贞(Ligustrum Iucidus)等，但不限于此。木兰科之植物的例子可包括，例如白玉兰(Michelia alba)、八角茴香(Illicium verum)、凹叶厚朴(Magnoliaofficinalis var.biloba) > 望春花(Magnolia biondii)、华叶五味子(Schisandrasphenanthera)等，但不限于此。毛茛科之植物可包括，但不限于小木通(ClematidisArmandii)、牡丹(Paeonia suffruticosa)、苟药(Paeonia Iactiflora)、乌头(Aconitumcarmichaeli)、黄连(Coptis chinensis)等。水龙骨科之植物的例子可包括鹅掌金星蕨(Phymatodes hastata)等，但不限于此。冬青科之植物可包括,但不限于岗梅(Ilexasprella)等。玄参科之植物可包括，但不限于，玄参(Scrophularia ningpoensis)、地黄(Rehmannia glutionsa)等。山柑科之植物可包括，例如山柑(Capparis formosana)等，但不限于此。禾本科之植物可包括，例如淡竹叶(Lophatherum gracile)等,但不限于此。列当科之植物可包括，但不限于野郝(Aeginetia indica)、肉灰蓉(Cistanchedeserticola)等。百合科之植物的例子可包括，例如菝契(Smilax china)、天冬(Asparaguscochinchinensis)、台湾黄精(Polygonatum altelobatum)、平贝母(Fritillariaussuriensis)、玉竹(Polygonatum odoratum)、多花黄精(Polygonatum cyrtonema)、百合(Lilum Iancifolium)、知母(Anemarrhena asphodeloides)等，但不限于此。忍冬科之植物的例子可包括，例如冇骨消(Sambucus chineasis)、红子荚迷(Viburnum formosanum)、吕宋荚迷(Viburnum luzonicum)等，但不限于此。杜仲科之植物可包括，但不限于杜仲(Eucommia ulmoides)等。豆科之植物的例子可包括，例如剌桐(Erythrina variegata)、兔尾草(Uraria crinita)、耳钩草(Heliotropium indicum)、毛鸡骨草(Abrus mollis)、甘草(Glycyrrhiza uralensis)、多序岩黄耆(Hedysarum polybotrys)、苦参(Sophoraf Iavescensa)、野葛(Puerraria 1bata)、越南槐(Sophora tonkinensis)、蒙古黄耆(Astragalus membranaceus var.mongholic)、一条根(Flemingia macrophylla)、台湾山豆根(Euchresta formosana)、白凤豆(Canavalia gladiata)等，但不限于此。车前草科之植物可包括车前(Plantago asiatica)等，但不限于此。防己科之植物可包括，但不限于，台湾土防己(Cyclea ochiaiana)、粉防已(Stephania tetrandra)等。使君子科之植物可包括使君子(Quisqualis indica)等，但不限于此。芸香科之植物的例子可包括，例如花椒(Zanthoxylum bungeanum)、黄桕(Phellodendron chinense var.glabriusculum)、酸禮(Citrus aurantium)、台湾黄薬(Phellodendron amurense var.wilsonii)等，但不限于此。虎耳草科之植物可包括，但不限于常山(Dichroa febrifuga)等。金粟兰科之植物可包括，但不限于九节荼(Chloranthus glabra)等。金丝桃科之植物可包括，但不限于地耳草(Hypericum japonicum)、红旱莲(Hypericum ascyron)等。柳叶菜科之植物可包括，水丁香(Ludwigia octovalvis)等，但不限于此。苦木科之植物可包括，但不限于鸭胆子(Brucea javanica)等。煎科之植物的例子可包括，例如中华枸杞(Lyciumchinense)、白毛藤(Solanum Iyratum)、黄水煎(Solanum incanum)、龙葵(Solanumnigrum)等，但不限于 此。香蒲科的植物可包括，但不限于水烛香蒲(Typha angustifolia)等。唇形科之植物的例子可包括，例如印度萝勒(Ocimum gratissimum)、丹参(Saliviamiltiorrhiza)、夏枯草(Prunella vulgaris)、紫苏(Perilla frutescens var.arguta)、黄苳(Scutellaria baicalensis)、猫须草(Asparagus cochinchinensis)等，但不限于此。桔梗科之植物的例子可包括，但不限于，半边莲(Lobelia chinensis)、台湾土党参(Cyclocodon Iancifolius)、桔梗(Platycodon grandiflorum)、党蕓(Codonopsispilosula)等。桑科之植物可包括桑(Morus alba)、台湾天仙果(Ficus formosana)等，但不限于此。桑寄生科之植物可包括桑寄生(Taxillus chinensis)、大叶桑寄生(TaxillusIiquidambaricola)等，但不限于此。胡麻科之植物可包括，但不限于白芝麻(Sesamumorientale)等。马览铃科之植物的例子可包括，例如马览铃(Aristolochia contorta)、关木通(Aristolochia mandshuriensis)等，但不限于此。马钱科之植物可包括，但不限于白埔姜(Buddleia asiatica)等。马鞭草科之植物可包括，但不限于蔓荆(Vitex trifolia)、海州常山(Clerodendrun trichotomum)等。菌草科之植物的例子，可包括，例如九节木(Psychotria rubra)、圆叶鸡屎树(Lasianthus wallichii)、白花蛇舌草(Hedyotisdiffusa)、伞花龙吐珠(Hedyotis corymbosa)、大叶钩藤(Uncaria macrophylla)、巴戟天(Morinda officinalis)、水栀子(Gardenia jasminoides var.grandiflora)、白钩藤(Uncaria sessilifructus)、菌草(Rubia cordifolia)等，但不限于此。商陆科之植物可包括，但不限于商陆(Phytolacca asiatica)等。旋花科之植物可包括，但不限于五爪金龙(Ipomoea cairica)、牵牛子(Pharbitis purpurea)、宽丝子(Cuscuta chinensis)等。莎草科之植物可包括，例如莎草(Cyperus rotundus)等，但不限于此。觅科之植物可包括，例如川牛膝(Cyathula officinalis)、怀牛膝(Achryanthes bidentata)等，但不限于此。蛇郝科植物可包括，但不限于穗花蛇郝(Balanophora Iaxiflora)等。无患子科之植物可包括，但不限于荔枝(Litchi chinensis)等。紫金牛科之植物可包括，但不限于珠砂根(Ardisia crenata)等。紫草科之植物可包括硬紫草(Lithospermum erythrorrhizon)等，但不限于此。紫董科的植物可包括，但不限于紫花地丁(Viola yedoensis)等，但不限于此。菊科之植物的例子可包括，例如云木香(Aucklandia lappa)、牛蒡子(Arctiumlappa)、白 Jtt (Atractylodes macrocephala)、艾(Artemisia argyi)、剌儿菜(Cirisiumsetosum)、红花(Carthamus tinctorius)、苍Jtt (Atractylodes Iancea)、茵陈(Artemisiacapillaris)、黄花蒿(Artemisia annua)、墨旱莲(Eclipta prostrata)、大蓟(Cirisiumjaponicum)、地胆草(Elephantopus mollis)、刀伤草(Ixeridium Iaevigatum)、小金英(兔仔菜)(Ixeris chinensis)、山防风(Echinops grijsii)、旱莲草(Eclipta prostrata)、(杭)菊(Dendranthema morifolium)、南一枝香(Vernonia cinerea)、螺虫其菊(Wedeliachinensis)等，但不限于此。瑞香科之植物可包括，但不限于芫花(Daphne genkwa)、南岭堯花(Wikstroemia indica)等，但不限于此。葫芦科之植物可包括，但不限于绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)等。葡萄科之植物可包括，小本山葡萄(Vitis ficifolia)、汉氏山葡萄(Ampelopsis brevipedunculata var.hancei)、白薇(Ampelopsis japonica)等，但不限于此。鼠李科之植物可包括，但不限于，桶钩藤(Rhamnus formosana)、酸麥仁(Ziziphus jujuba var.spinosa)等。睡莲科之植物可包括莲(Nelumbo nucifera)等，但不限于此。远志科之植物可包括远志(Polygala tenuifolia)等，但不限于此。鸾尾科之植物可包括，但 不限于射干(Belamcanda chinensis)等。瘈藜科之植物可包括瘈藜(Tribulus terrestris)等，但不限于此。蝶形花科之植物可包括，例如鸡冠剌桐(Erythrina crista-galli)等，但不限于此。卫矛科之植物可包括，但不限于雷公藤(Tripterygium wilfordii)、大叶南蛇藤(Celastrus kusanoi)等。蓼科之植物的例子可包括，例如何首乌(Polygonum multiflorum)、虎杖(Polygonum cuspidatum)、唐古特大黄(Rheum tanguticum)、药用大黄(Rheum officinale)等，但不限于此。泽湾科之植物可包括，但不限于泽?写(Alisma orientalis)等。锦葵科之植物可包括，例如山芙蓉(Hibiscustaiwanensis)、冬葵子(Malva verticillata)等，但不限于此。爵床科之植物的例子可包括，例如哈哼花(Staurogyne concinnula)、马蓝(Strobilanthes cusia)、九头狮子草(Peristrophe japonica)、舍即鱼胆(Hypoestes purpurea)、白鹤灵芝(Rhinacanthusnasutus)、穿心莲(Andrographis paniculata)等，但不限于此。姜科之植物的例子可包括，例如山奈(Kaempferia galanga)、郁金(Curcuma kwangsiensis)、益智(Alpiniaoxyphyl la)、草豆蘧(Alpinia katsumadai)、高良姜(Alpinia off icinarum)等，但不限于此。蔷薇科之植物的例子可包括，例如山杏(Prunus armenioca var.ansu)、山桃(Prunusdavidiana)、山里红(Crataegus pinnatifida var.major) Λ 毛叶木瓜(Chaenomelescathayensis)、蛇莓(Duchesnea indica)、玫瑰(Rosa rugosa)等，但不限于此。伞形科之植物，可包括，但不限于川弯(Ligusticum chuanxiong)、白]E (Angelica dahuricavar.formosana)、防风(Saposhnikovia divaricata)、宪活(Notopterygium incisum)、重齿毛当归(Angelica pubescens f.biserrata)、柴古月(Bupleurum chinense)、高氏柴古月(Bupleurum kaoi)、当归(Angelica sinensis)、雷公根(Centella asiatica)等,但不限于此。S粟科之植物可包括，但不限于元胡(Corydalis yanhusuo)等。称猴桃科之植物可包括，但不限于阔叶称猴桃(Actinidia Iatifolia)等。兰科植物之例子可包括,例如台湾金线莲(Anoectochilus formosanus)、天麻(Gastrodia elata) > [=3? (Bletilla striata)、台湾白及(Bletilla formosana)等,但不限于此。萝摩科之植物可包括，但不限于白薇(Cynanchum atratum)、芫花叶白前(Cynanchum glaucescens)、台湾牛弥菜(Marsdeniaformosana)等。茶茱萸科之植物可包括例如青脆枝(Nothapodytes foetida)等,但不限于此。雨久花科之植物可包括，例如布袋莲(Eichhornia crassipes),但不限于此。柿树科之植物可包括,例如柿子(Diospyros kaki)，但不限于此。桃金娘科之植物可包括，例如澳洲茶树(Melaleuca alternifolia)。龙脑香科之植物可包括,例如登吉红柳桉(Shoreapolysperma),但不限于此。木麻黄科之植物可包括，例如木贼叶木麻黄(Casuarinaequisetfolia),但不限于此。景天科之植物可包括，例如匙叶伽蓝菜(Kalanchoespathulata),但不限于此。夹竹桃科之植物可包括,例如海檬果(Cerbera manghas),但不限于此。石蒜科之植物可包括，例如文珠兰，但不限于此。杨梅科之植物可包括例如青杨梅(Myrica adenophora),但不限于此。松萝科之植物可包括,例如长松萝(Usnea1ngissima),但不限于此。菠萝科之植物可包括,例如菠萝(Ananas comosus),但不限于此。漆树科之植物可包括例如钝叶大果漆(Semecarpus cuneiformis),但不限于此。梧桐科之植物可包括，例如台湾梭稷树(Reevesia formosana),但不限于此。清风藤科之植物可包括，例如笔罗子(Meliosma rigida),但不限于此。槭树科之植物可包括,例如尖叶槭(Acerkawakamii),但不限于此。悬铃木科之植物可包括,例如英国梧桐(Platanus acerifolia),但不限于此。番蒸枝科之植物可包括，例如里白瓜馥木(Fissistigma glaucescens),但不限于此。七叶树科之 植物可包括，例如欧洲七叶树(Aesculus hippocastanum),但不限于此。胡桃科之植物可包括，例如黄杞(Engelhardtia roxburghiana),但不限于此。旅人蕉科之植物可包括，例如旅人蕉(Ravenala madagascariensis),但不限于此。龙舌兰科之植物可包括，例如棒叶虎尾兰(Sansevieria cylindrica),但不限于此。
[0223]在本发明另一实施例中，本发明提供一种建构用于鉴别一植物药材种类之数据库的方法。本发明之建构用于鉴别一植物药材种类之数据库的方法可包括，但不限于下述步骤。
[0224]首先，获得至少一种已知植物药材之DNA样本。在一实施例中，可藉由一般DNA萃取方法来获得至少一种已知植物药材之DNA样本，例如以十六烷基三甲基溴化铵等试剂来对植物药材进行DNA萃取，但不限于此。
[0225]接着，在获得上述至少一种已知植物药材之DNA样本之后，将所获得之上述至少一种已知植物药材之DNA样本以相同之至少一引子对分别进行聚合酶链锁反应以获得分别之聚合酶链锁反应产物。
[0226]上述至少一引子对可根据在植物基因体DNA序列之转录18S核糖体RNA区域至转录28S区域核糖体RNA区域之间的序列所设计，而植物基因体DNA序列之转录18S核糖体RNA区域至转录28S区域核糖体RNA区域之间的序列包括转录18S核糖体RNA区域之序列、转录间隔区I之序列、转录5.8S核糖体RNA区域之序列、转录间隔区2之序列与转录28S核糖体RNA区域之序列。对于植物基因体DNA序列之转录18S核糖体RNA区域至转录28S区域核糖体RNA区域之间的转录间隔区I与转录间隔区2而言，不同种类之植物的序列差异度大，因此在一实施例中，可以转录18S核糖体RNA之保守区域、转录28S核糖体RNA之保守区域或转录间隔区I与转录间隔区2较保守区域为设计引子之区域。此外，于本发明之鉴别一植物药材之种类的方法中所使用之至少一引子对，对各种不同之植物皆可进行聚合酶链锁反应并获得具专一性的聚合酶链锁反应，具备优良之功效。。
[0227]上述至少一引子对可包括至少一顺向引子与至少一逆向引子的组合。
[0228]上述至少一顺向引子可择自由下列所组成之群组，但不限于此:序列辨识号:1之引子、序列辨识号:2之引子、序列辨识号:3之引子、序列辨识号:4之引子、序列辨识号:5之引子、序列辨识号:6之引子及与序列辨识号:1、序列辨识号:2、序列辨识号:3、序列辨识号:4、序列辨识号:5或序列辨识号:6具70%、80%或90%以上序列相似度之引子。
[0229]此外，上述至少一逆向引子可择自由下列所组成之群组，但也不限于此:序列辨识号:7之引子、序列辨识号:8之引子、序列辨识号:9之引子、序列辨识号:10之引子、序列辨识号:11之引子、序列辨识号:12之引子及与序列辨识号:7、序列辨识号:8、序列辨识号:
9、序列辨识号:10、序列辨识号:11或序列辨识号:12具70%、80%或90%以上序列相似度之引子。
[0230]在一实施例中，上述至少一引子对可包括，但不限于序列辨识号:1之引子与序列辨识号:9之引子的组合、序列辨识号:1之引子与序列辨识号:10之引子的组合、序列辨识号:1与序列辨识号:12之引子的组合、序列辨识号:2之引子与序列辨识号:7之引子的组合、序列辨识号:2之引子与序列辨识号:8之引子的组合、序列辨识号:3之引子与序列辨识号-J之引子的组合、序列辨识号:3之引子与序列辨识号:8之引子的组合、序列辨识号:4之引子与序列辨识号:7之引子的组合及/或序列辨识号:4之引子与序列辨识号:8之引子的组合等。
[0231]在一特定之实施例中，上述至少一引子对可为序列辨识号:1之引子与序列辨识号:10之引子的组合。又，在另一特定实施例中，上述至少一引子对可为序列辨识号:4之引子与序列辨识号:7之引子的组合。
[0232]再来，将上述分别之聚合酶链锁反应产物进行高解析双股分离动力分析以获得上述至少一种已知植物药材之分别的高解析双股分离动力分析图谱。
[0233]最后，将上述至少一种已知植物药材之分别的高解析双股分离动力分析图谱集合成一数据库而完成用于鉴别一植物药材种类之数据库的建构。
[0234]在本发明又另一实施例中，本发明提供一种用于鉴别一植物药材种类的数据库。本发明之数据库可根据前述本发明之建构用于鉴别一植物药材种类之数据库的方法来建构，但不限于此。
[0235] 在一实施例中，于根据前述建构用于鉴别一植物药材种类之数据库的方法所建构的数据库中，至少一种已知植物药材的高解析双股分离动力分析图谱，系由上述至少一种已知植物药材之DNA样本，藉由使用包括下列之相同的至少一引子对所产生的分别之聚合酶链锁反应产物进行高解析双股分离动力分析图谱而得。所使用之相同的至少一引子对可包括:序列辨识号:1之引子与序列辨识号:9之引子的组合、序列辨识号:1之引子与序列辨识号:10之引子的组合、序列辨识号:1与序列辨识号:12之引子的组合、序列辨识号:2之引子与序列辨识号:7之引子的组合、序列辨识号:2之引子与序列辨识号:8之引子的组合、序列辨识号:3之引子与序列辨识号:7之引子的组合、序列辨识号:3之引子与序列辨识号:8之引子的组合、序列辨识号:4之引子与序列辨识号:7之引子的组合及/或序列辨识号:4之引子与序列辨识号:8之引子的组合。
[0236]在一特定实施例中，上述至少一引子对可为序列辨识号:1之引子与序列辨识号:10之引子的组合。在又另一特定实施例中，上述至少一引子对可为序列辨识号:4之引子与序列辨识号-J之引子的组合。[0237]又，适用本发明数据库来进行鉴别之植物药材的科别的例子，可包括，例如十字花科、三白草科、大戟科、小蘖科、山茱萸科、川续断科、五加科、天南星科、木通科、木犀科、木兰科、毛茛科、水龙骨科、冬青科、玄参科、山柑科、禾本科、列当科、百合科、忍冬科、杜仲科、豆科、车前草科、防己科、使君子科、芸香科、虎耳草科、金粟兰科、金丝桃科、柳叶菜科、苦木科、茄科、香蒲科、唇形科、桔梗科、桑科、桑寄生科、胡麻科、马兜铃科、马钱科、马鞭草科、茜草科、商陆科、旋花科、莎草科、苋科、蛇菰科、无患子科、紫金牛科、紫草科、紫董科、菊科、瑞香科、葫芦科、葡萄科、鼠李科、睡莲科、远志科、鸢尾科、蒺藜科、蝶形花科、卫矛科、寥科、泽泻科、锦葵科、锦葵科、爵床科、姜科、蔷薇科、伞形科、罂粟科、猕猴桃科、兰科、萝摩科、茶茱萸科、雨久花科、柿树科、桃金娘科、龙脑香科、木麻黄科、景天科、夹竹桃科、石蒜科、杨梅科、松萝科、菠萝科、漆树科、梧桐科、清风藤科、槭树科、悬铃木科、番荔枝科、七叶树科、胡桃科、旅人蕉科与龙舌兰科等，但不限于此。
[0238]另外，在本发明一实施例中，本发明提供一种用于鉴别一植物药材种类的引子对。
[0239]上述弓丨子对可包括一顺向引子与一逆向引子的组合。
[0240]上述顺向引子可择自由下列所组成之群组:序列辨识号:1之引子、序列辨识号:2之引子、序列辨识号:3之引子、序列辨识号:4之引子、序列辨识号:5之引子、序列辨识号:6之引子及与序列辨识号:1、序列辨识号:2、序列辨识号:3、序列辨识号:4、序列辨识号:5或序列辨识号:6具70%、80%或90%以上序列相似度之引子。又，上述逆向引子则可择自由下列所组成之群组:序列辨识号-J之引子、序列辨识号:8之引子、序列辨识号:9之引子、序列辨识号:10之引子、序列辨识号:11之引子、序列辨识号:12之引子及与序列辨识号:7、序列辨识号:8、序列辨识号:9、序列辨识号:10、序列辨识号:11或序列辨识号:12具70%,80%或90%以上序列相似度之引子，但也不限于此。
[0241]在一实施例中，上述引子对可包括，例如序列辨识号:1之引子与序列辨识号:9之引子的组合、序列辨识号:1之引子与序列辨识号:10之引子的组合、序列辨识号:1与序列辨识号:12之引子的组合、序列辨识号:2之引子与序列辨识号:7之引子的组合、序列辨识号:2之引子与序列辨识号:8之引子的组合、序列辨识号:3之引子与序列辨识号:7之引子的组合、序列辨识号:3之引子与序列辨识号:8之引子的组合、序列辨识号:4之引子与序列辨识号:7之引子的组合及/或序列辨识号:4之引子与序列辨识号:8之引子的组合，但不限于此。
[0242]在一特定实施例中，上述引子对可为序列辨识号:1之引子与序列辨识号:10之引子的组合。而在另一特定实施例中，上述引子对可为序列辨识号:4之引子与序列辨识号:7之引子的组合。
[0243]【实施例】
[0244]A.植物材料
[0245]于本实验中所使用之各种植物药材皆由财团法人医药工业技术发展中心所提供，并且皆经过北京中国科学院协和医院药用植物所与国内药材专家确认无误用情况。
[0246]B.实验方法
[0247]1.DNA 抽取:
[0248]使用十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyltrimethylammoniumbromide, CTAB)的DNA抽取方法:
[0249]取500mg至Ig样本置于研钵中，加入液态氮研磨成粉，再用刮杓秤取30_40mg之样本粉末加入入2mL微量离心管(Eppendorf tube)。接着，将700 μ L萃取缓冲溶液(Extraction buffer)(IOOmM Tris.HCl, pH8.0, 20mM EDTA, IM NaCl, 1%CTAB, l%PVP-40)加入上述微量离心管中与样本混合均匀。将微量离心管置入65°C恒温水浴槽30分钟后取出，再于其中加入等量的三氯甲烧-异戍醇(chloroform-1soamyl alcohol) (24:1),并上下轻晃，使微量离心管中之溶液呈乳状。再来，将微量离心管以4°C、17，OOOx g离心5分钟，之后取上清液500 μ L入新的1.5mL微量离心管，并加入ImL的95%乙醇及50 μ L醋酸钠(sodium acetat e) (NaOAc, 3M, pH5.2)。将此微量离心管放入_20°C冰箱约30分钟,之后取出以4°C、17，OOOx g离心20分钟，并移除上清液。接着再加入700 μ L75%乙醇于此微量离心管中，并以4°C、17，OOOx g离心5分钟，移除上清液，之后倒置干燥(37°C，IOmin)。于干燥后，加入100 μ L的TE buffer (IOmM Tris.HCl, pH8.0, ImM EDTA)于此微量离心管中以回溶DNA。最后将回溶之DNA置入_20°C冰箱保存备用。
[0250]2.引子设计:
[0251]在引子设计方面，以财团法人工业技术研究院所建置植物药材基因体DNA之转录18S核糖体RNA区域至转录28S区域核糖体RNA区域之间的DNA序列数据库，经过比对分析设计而成。所设计之引子可复制出涵盖植物基因体DNA序列之转录18S核糖体RNA区域之部分的序列、转录间隔区I (ITSl)的序列、转录5.8S核糖体RNA区域之序列、转录间隔区2 (ITS2)之序列及/或转录28S核糖体RNA区域之部分的序列，或涵盖转录18S核糖体RNA区域至转录28S区域核糖体RNA区域之间可供辨识的部份序列。
[0252]然后以不同组合，筛选出最有效率且可稳定复制出大部份药材的DNA片段以供高解析双股分离动力分析(high-resolution melting analysis, HRMA)图谱数据库建置的引子对。
[0253]3.聚合酶链锁反应(polymerase chain reaction, PCR):
[0254]将所设计引子不同组合以市售聚合酶套组PhireR Plant Direct PCR Kit (F-130)对各植物药材之DNA样本进行聚合酶链锁反应。
[0255]15yL反应液中包括1.5yL DNA(IOng-1mg)、7.5 μ L2 X聚合酶链锁反应反应缓冲液、顺向及逆向引子(10μΜ)0.75μ L,0.15yL(5units/μ L)TaqDNA 聚合酶(Phire)、
0.5 μ L DMS0> 1.5 μ L LCGreen plus+ (Idaho)及 2.35 μ L 无菌水。
[0256]聚合酶链锁反应之反应条件如下:[0257]步骤1:98 °C，2 分钟；
[0258]步骤2:下列(I)至⑶进行34次循环:
[0259](1)98°C，5 秒;
[0260](2)66°C，5 秒；
[0261](3) 72 °C，10 秒;
[0262]步骤3:72 °C，I 分钟。
[0263]4.高解析双股分离动力分析分析:
[0264]将上述聚合酶链锁反应之产物进行高解析双股分离动力分析。取聚合酶链锁反应产物10 μ L加入毛细管(Roche)中，再放入LS32样品孔中(LightScanner32, IdahoTechnology Inc.)。预熔解温度设定如下:99°C,30 秒；40°C, 30秒。溶解温度设定范围如下:65°C至99°C，温度变化速度0.30C /s。侦测上述温度范围中的突光变化，最后再以软件LightScamierw 32software releasel.0.0.23进行分析获得各
植物药材特定的辨识图谱。
[0265]5.电泳分析:
[0266]取3μ L上述 其与3 μ LlOObp分子量标准品(ladder marker)分别加载
1.2% 洋菜糖胶体(Agarose gel, Invitrogen),并于 I XTAE(0.04M Tris, 0.04M 醋酸盐(acetate), 0.0OlM EDTA)缓冲液中进行电泳(150Volts，20分钟)。电泳完成后，将胶体置于含溴化乙锭(ethidium bromide)的水溶液10分钟后置于UV灯下照相纪录。
[0267]C.实施例1
[0268]植物用引子对最优化:
[0269]根据植物基因体DNA序列之转录18S核糖体RNA区域至转录28S区域核糖体RNA区域之间的序列，设计出12条引子，如表1所示。
[0270]表1、本发明实施例之引子
[0271]
【权利要求】
1.一种鉴别一植物药材种类的方法，包括: (a)获得一待测植物药材之DNA样本； (b)将该待测植物药材之DNA样本以至少一引子对进行一聚合酶链锁反应以获得一聚合酶链锁反应产物； (c)将该聚合酶链锁反应产物进行高解析双股分离动力分析以获得该待测植物药材的高解析双股分离动力分析图谱；以及 (d)将待测植物药材的高解析双股分离动力分析图谱与一已知植物药材的高解析双股分离动力分析图谱进行比对。
2.权利要求1所述之一植物药材种类的方法其中该至少一引子对系根据在植物基因体DNA序列之转录18S核糖体RNA区域至转录28S区域核糖体RNA区域之间的序列所设计。
3.权利要求1所述之一植物药材种类的方法，其中该至少一引子对包括至少一顺向引子与至少一逆向引子的组合， 其中该至少一顺向引子系择自由下列所组成之群组: 序列辨识号:1之引子、序列辨识号:2之引子、序列辨识号:3之引子、序列辨识号:4之引子、序列辨识号: 5之引子、序列辨识号:6之引子及与序列辨识号:1、序列辨识号:2、序列辨识号:3、序列辨识号:4、序列辨识号:5或序列辨识号:6具70%以上序列相似度之引子， 且其中该至少一逆向引子系择自由下列所组成之群组: 序列辨识号:7之引子、序列辨识号:8之引子、序列辨识号:9之引子、序列辨识号:10之引子、序列辨识号:11之引子、序列辨识号:12之引子及与序列辨识号:7、序列辨识号:8、序列辨识号:9、序列辨识号:10、序列辨识号:11或序列辨识号:12具70%以上序列相似度之引子。
4.权利要求1所述之一植物药材种类的方法,其中该至少一引子对包括:序列辨识号:I之引子与序列辨识号:9之引子的组合、序列辨识号:1之引子与序列辨识号:10之引子的组合、序列辨识号:1与序列辨识号:12之引子的组合、序列辨识号:2之引子与序列辨识号:7之引子的组合、序列辨识号:2之引子与序列辨识号:8之引子的组合、序列辨识号:3之引子与序列辨识号:7之引子的组合、序列辨识号:3之引子与序列辨识号:8之引子的组合、序列辨识号:4之引子与序列辨识号-J之引子的组合及/或序列辨识号:4之引子与序列辨识号:8之引子的组合。
5.权利要求1所述之一植物药材种类的方法，其中该至少一引子对为序列辨识号:1之引子与序列辨识号:10之引子的组合。
6.权利要求1所述之一植物药材种类的方法，其中该至少一引子对为序列辨识号:4之引子与序列辨识号:7之引子的组合。
7.权利要求1所述之一植物药材种类的方法，其中该已知植物药材的高解析双股分离动力分析图谱系获自一数据库，其中该数据库系由至少一种已知植物药材之DNA分别根据该相同之至少一引子而产生的聚合酶链锁反应产物进行高解析双股分离动力分析所分别获得的高解析双股分离动力分析图谱所组成。
8.权利要求1所述之一植物药材种类的方法，其中该步骤(b)更包括，同时将该已知植物药材之DNA样本以该相同之至少一引子对进行另一聚合酶链锁反应以获得该已知植物药材之一聚合酶链锁反应产物，又该步骤(C)更包括，将该已知植物药材之聚合酶链锁反应产物进行高解析双股分离动力分析以获得该已知植物药材的高解析双股分离动力分析图谱。
9.权利要求1所述之一植物药材种类的方法，其中适用于该鉴别植物药材的方法之植物药材的科别包括十字花科、三白草科、大戟科、小蘖科、山茱萸科、川续断科、五加科、天南星科、木通科、木犀科、木兰科、毛茛科、水龙骨科、冬青科、玄参科、山柑科、禾本科、列当科、百合科、忍冬科、杜仲科、豆科、车前草科、防己科、防已科、使君子科、芸香科、虎耳草科、金粟兰科、金丝桃科、柳叶菜科、苦木科、茄科、香蒲科、唇形科、桔梗科、桑科、桑寄生科、胡麻科、马兜铃科、马钱科、马鞭草科、茜草科、商陆科、旋花科、莎草科、苋科、蛇菰科、无患子科、紫金牛科、紫草科、紫董科、菊科、瑞香科、葫芦科、葡萄科、鼠李科、睡莲科、远志科、鸢尾科、蒺藜科、蝶形花科、卫矛科、寥科、泽湾科、锦葵科、锦葵科、爵床科、姜科、蔷薇科、伞形科、罂粟科、猕猴桃科、兰科、萝摩科、茶茱萸科、雨久花科、柿树科、桃金娘科、龙脑香科、木麻黄科、景天科、夹竹桃科、石蒜科、杨梅科、松萝科、菠萝科、漆树科、梧桐科、清风藤科、槭树科、悬铃木科、番荔枝科、七叶树科、胡桃科、旅人蕉科或龙舌兰科。
10.一种建构用于鉴别一植物药材种类之数据库的方法，包括: (a)获得至少一种已知植物药材之DNA样本； (b)将该至少一种已知植物药材之DNA样本以相同之至少一引子对分别进行聚合酶链锁反应以获得分别之聚合酶链锁反应产物； (c)将该分别之聚合酶链锁反应产物进行高解析双股分离动力分析以获得该至少一种已知植物药材之分别的高解析双股分离动力分析图谱；以及 (d)将该至少一种已知植物药材之分别的高解析双股分离动力分析图谱集合成一数据库。
11.权利要求10所述之建构用于鉴别一植物药材种类之数据库的方法，其中该至少一引子对系根据在植物基因体DNA序列之转录18S核糖体RNA区域至转录28S区域核糖体RNA区域之间的序列所设计。
12.权利要求10所述之建构用于鉴别一植物药材种类之数据库的方法，其中该至少一引子对包括至少一顺向引子与至少一逆向引子的组合， 其中该至少一顺向引子系择自由下列所组成之群组: 序列辨识号:1之引子、序列辨识号:2之引子、序列辨识号:3之引子、序列辨识号:4之引子、序列辨识号:5之引子、序列辨识号:6之引子及与序列辨识号:1、序列辨识号:2、序列辨识号:3、序列辨识号:4、序列辨识号:5或序列辨识号:6具70%以上序列相似度之引子， 且其中该至少一逆向引子系择自由下列所组成之群组: 序列辨识号:7之引子、序列辨识号:8之引子、序列辨识号:9之引子、序列辨识号:10之引子、序列辨识号:11之引子、序列辨识号:12之引子及与序列辨识号:7、序列辨识号:8、序列辨识号:9、序列辨识号:10、序列辨识号:11或序列辨识号:12具70%以上序列相似度之引子。
13.权利要求10所述之建构用于鉴别一植物药材种类之数据库的方法，其中该至少一引子对包括:序列辨识号:1之引子与序列辨识号:9之引子的组合、序列辨识号:1之引子与序列辨识号:10之引子的组合、序列辨识号:1与序列辨识号:12之引子的组合、序列辨识号:2之引子与序列辨识号:7之引子的组合、序列辨识号:2之引子与序列辨识号:8之引子的组合、序列辨识号:3之引子与序列辨识号:7之引子的组合、序列辨识号:3之引子与序列辨识号:8之引子的组合、序列辨识号:4之引子与序列辨识号:7之引子的组合及/或序列辨识号:4之引子与序列辨识号:8之引子的组合。
14.权利要求10所述之建构用于鉴别一植物药材种类之数据库的方法，其中该至少一引子对为序列辨识号:1之引子与序列辨识号:10之引子的组合。
15.权利要求10所述之建构用于鉴别一植物药材种类之数据库的方法，其中该至少一引子对为序列辨识号:4之引子与序列辨识号:7之引子的组合。
16.一种用于鉴别一植物药材种类的数据库，其系根据权利要求10所述之建构用于鉴别一植物药材种类之数据库的方法来建构。
17.权利要求16所述之用于鉴别一植物药材种类的数据库，其中该至少一引子对包括:序列辨识号:1之引子与序列辨识号:9之引子的组合、序列辨识号:1之引子与序列辨识号:10之引子的组合、序列辨识号:1与序列辨识号:12之引子的组合、序列辨识号:2之引子与序列辨识号:7之引子的组合、序列辨识号:2之引子与序列辨识号:8之引子的组合、序列辨识号:3之引子与序列辨识号:7之引子的组合、序列辨识号:3之引子与序列辨识号:8之引子的组合、序列辨识号:4之引子与序列辨识号:7之引子的组合及/或序列辨识号:4之引子与序列辨识号:8之引子的组合。
18.权利要求16所述之用于鉴别一植物药材种类的数据库，其中该至少一引子对为序列辨识号:1之引子与序列辨识号:10之引子的组合。
19.权利要求16所述之用于鉴别一植物药材种类之数据库，其中该至少一引子对为序列辨识号:4之引子与序列辨识号-J之引子的组合。
20.权利要求16所述之用于鉴别一植物药材种类的数据库，其中适用该用于鉴别一植物药材种类之数据库来进行鉴别之植物药材的科别包括十字花科、三白草科、大戟科、小蘖科、山茱萸科、川续断科、五加科、天南星科、木通科、木犀科、木兰科、毛茛科、水龙骨科、冬青科、玄参科、山柑科、禾本科、列当科、百合科、忍冬科、杜仲科、豆科、车前草科、防己科、防已科、使君子科、芸香科、虎耳草科、金粟兰科、金丝桃科、柳叶菜科、苦木科、茄科、香蒲科、唇形科、桔梗科、桑科、桑寄生科、胡麻科、马兜铃科、马钱科、马鞭草科、茜草科、商陆科、旋花科、莎草科、苋科、蛇菰科、无患子科、紫金牛科、紫草科、紫董科、菊科、瑞香科、葫芦科、葡萄科、鼠李科、睡莲科、远志科、鸢尾科、蒺藜科、蝶形花科、卫矛科、寥科、泽泻科、锦葵科、锦葵科、爵床科、姜科、蔷薇科、伞形科、罂粟科、猕猴桃科、兰科、萝摩科、茶茱萸科、雨久花科、柿树科、桃金娘科、龙脑香科、木麻黄科、景天科、夹竹桃科、石蒜科、杨梅科、松萝科、菠萝科、漆树科、梧桐科、清风藤科、槭树科、悬铃木科、番荔枝科、七叶树科、胡桃科、旅人蕉科或龙舌兰科。
21.一种用于鉴别一植物药材种类的引子对，包括: 一顺向引子与一逆向引子的组合， 其中该顺向引子系择自由下列所组成之群组: 序列辨识号:1之引子、序列辨识号:2之引子、序列辨识号:3之引子、序列辨识号:4之引子、序列辨识号:5之引子、序列辨识号:6之引子及与序列辨识号:1、序列辨识号:2、序列辨识号:3、序列辨识号:4、序列辨识号:5或序列辨识号:6具70%以上序列相似度之引子， 且其中该逆向引子系择自由下列所组成之群组: 序列辨识号:7之引子、序 列辨识号:8之引子、序列辨识号:9之引子、序列辨识号:10之引子、序列辨识号:11之引子、序列辨识号:12之引子及与序列辨识号:7、序列辨识号:8、序列辨识号:9、序列辨识号:10、序列辨识号:11或序列辨识号:12具70%以上序列相似度之引子。
22.权利要求21所述之用于鉴别一植物药材种类的引子对，其中该引子对包括:序列辨识号:1之引子与序列辨识号:9之引子的组合、序列辨识号:1之引子与序列辨识号:10之引子的组合、序列辨识号:1与序列辨识号:12之引子的组合、序列辨识号:2之引子与序列辨识号:7之引子的组合、序列辨识号:2之引子与序列辨识号:8之引子的组合、序列辨识号:3之引子与序列辨识号:7之引子的组合、序列辨识号:3之引子与序列辨识号:8之引子的组合、序列辨识号:4之引子与序列辨识号:7之引子的组合及/或序列辨识号:4之引子与序列辨识号:8之引子的组合。
23.权利要求21所述之用于鉴别一植物药材种类的引子对，其中该引子对为序列辨识号:1之引子与序列辨识号:10之引子的组合。
24.权利要求21所述之用于鉴别一植物药材种类的引子对，其中该引子对为序列辨识号:4之引子与序列辨识号:7之引子的组合。
【文档编号】C12Q1/68GK103898204SQ201210590190
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2012年12月28日 优先权日:2012年12月28日
【发明者】邱淑娇, 陈惠玲, 唐瑞霜, 李承榆, 魏培萱 申请人:财团法人工业技术研究院