专利名称：一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产dha的方法
技术领域：
本发明涉及发酵生产DHA的方法，特别涉及一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产DHA的方法。
背景技术：
二十二碳六烯酸(Docosahexenoic acid, 22:6 A 4, 7, 10, 13, 16, 19,简称 DHA)俗称“脑黄金”，属于《_3型多不饱和脂肪酸，具有补脑健脑，预防老年性痴呆症；提高视力，防治近视；预防高血压、动脉硬化、关节炎及治疗癌症等生理功能。因此，DHA作为新一代功能性保健因子具有广阔的市场前景。随着市场需求量的扩大，对DHA品质的要求也越来越高，DHA生产研究逐渐向利用生物技术合成方向发展，传统鱼油来源的DHA已逐渐被藻油DHA所取代。藻油DHA是指通过微生物发酵获得的含有DHA等长链多不饱和脂肪酸的油脂，其中DHA生产菌主要有裂殖壶菌、破囊壶菌、隐甲藻等。裂殖壶菌又称裂壶藻，属于真菌门、卵菌纲、水霉目、破囊壶菌科的一类类藻的海洋真菌，单细胞、球形。细胞累积大量对人体有用的活性物质，如油脂、色素(类胡萝卜素、叶黄素、虾青素)、角鲨烯等，其中总脂肪酸中DHA含量高达35% 45%，且细胞中90%以上的油脂以人体易吸收的中性油脂——甘油三酯形式存在，是DHA的理想生产菌株。中国专利CN101575584公开一种裂殖弧菌及利用其生产DHA油脂的方法，该方法提供一种从渗透压和元素供应角度优化菌株发酵培养基，并结合流加策略，实现裂殖壶菌高密度发酵，采用传统的发酵方法，从甘油保存种接入摇瓶活化一一级种子液一摇瓶二级种子液一一级种子罐一二级种子罐一发酵，最终细胞干重达到70g/L，油脂含量达31.5g/L，DHA占总脂肪酸含量高于35%。中国专利CN101519676公开一种采用含微量元素的发酵培养基进行发酵生产DHA的发酵生产工艺，采用传 统方法培养菌种裂殖壶菌，即斜面活化培养、然后转接入摇瓶扩大培养、再经一级扩大培养得到发酵用种子液；或菌种经斜面活化培养、然后转接入摇瓶扩大培养、再经一级扩大培养和二级扩大培养后得到发酵用种子液，IOT罐发酵95h生物量为53g/L，油脂含量72%，DHA含量50%。而传统的种子培养和发酵方法涉及的发酵级数较多，工艺较繁琐，培养周期长，投资成本高。因此，改进种子制备方式，简化扩种工艺，降低生产成本，有利于DHA的工业化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供可简化扩种工艺，缩短种子培养和发酵周期，减少投资，节约成本，固料培养基营养丰富，富含多种生长因子，更利于种子的生长，菌种细胞的生长活力强、同步性较好，培养固料种子阶段产生的废水、废渣少，环境污染小的一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产DHA的方法。本发明米用的菌种为裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)KDff-12,已于2012年11月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCCN0.6843，地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编为100101。
本发明包括如下步骤:
I)菌种活化与菌悬液制备:将裂殖壶菌菌种接种于斜面培养基上培养活化,培养到期斜面加入质量百分数为0.85%的生理盐水洗涤菌体，获得菌悬液；
在步骤I)中，所述斜面培养基的配方可为:葡萄糖20 30g/L,蛋白胨10 15g/L，酵母粉3 5g/L，海水晶15 20g/L，琼脂粉20g/L，pH值6 7，121°C灭菌30min ;所述培养活化的温度可为25 28°C，培养活化的时间可为2 3天；所述菌悬液的菌体浓度可为 1.0 2.5 X IO6 个/mL。
2)—级种子制备:将步骤I)获得的菌悬液按质量分数为1%的接种量接种至固料培养基上培养，制成一级固料种子；或
将步骤I)获得的菌悬液按质量分数为1%的接种量接种至液体种子培养基，摇瓶培养，制成一级液体种子；
在步骤2)中，所述固料培养基包括固态组分和液体营养液组分，所述固态组分为谷物，含量为250 400g/L，所述谷物可选自米类、麦类和玉米等中的至少一种，所述米类可选自大米、小米、糙米等中的至少一种，所述麦类可选自大麦、小麦、燕麦等中的至少一种；
所述液体营养液组分包括组分I和组分2，所述组分I的组成为:葡萄糖2 5g/L,七水硫酸镁0.2 0.6g/L，磷酸氢二钾1.0 5.0g/L,海盐0.1 0.8g/L，甘氨酸0.2 0.6g/L,苏氨酸1.5 1.8g/L,蛋氨酸2 3.5g/L,苹果酸3 6g/L,加水定容,调节pH值为 6 7 ;所述组分 2 的组成为:La3+10 15mg/L, Ce3+I 4mg/L, Sm3+2 6mg/L, Nd3+8 12mg/L, Mn2+0.6 1.2mg/L, Co2+0.05 0.lmg/L,生物素 0.2 0.6mg/L,浅蓝菌素 0.1 0.3mg/L，赤霉素 GA2 5mg/L, VB120.5 1.0mg/L,叶酸 0.01 0.05mg/L,余量为水；
所述固料培养基的制备方法可为:固态组分与液体营养液组分I混合均匀，将谷物蒸或煮至谷物中心无白心，且含水率为50% 65%，获得固料培养基原料；将固料培养基原料与液体营养液组分2混合均匀，装于固态发酵K瓶中，厚度0.2 1.0cm, 121°C灭菌30min，制得固料培养基；
所述固态组分与液 体营养液组分I按质量/体积的配比可为(5 10) g: (2 5)mL，其中固态组分按质量计算，液体营养液组分I按体积计算；
所述固料培养基原料与液体营养液组分2按质量/体积的配比可为(10 15)g:(3 6)mL，其中固料培养基原料按质量计算，液体营养液组分2按体积计算；
所述液体种子培养基的组成可为:葡萄糖20 25g/L，氯化钠20 25g/L，磷酸二氢钾0.2 0.5g/L，酵母粉3 5g/L，七水硫酸镁8 12g/L，海盐0.1 0.8g/L，谷氨酸0.2 0.6g/L, pH 值 6 7，121°C灭菌 30min ；
所述培养的温度可为25 28°C，培养的时间可为I天；所述摇瓶的转速可为180 220rpm ;摇瓶培养的温度可为25 28°C，摇瓶培养的时间可为I天。
3) 二级固料种子的制备:一级固料种子以质量百分数为0.85%的生理盐水根据I: I (ff/ν)比例洗涤菌体，制成菌悬液；
在无菌条件下:
按质量分数为10% 20%的接种量在固料培养基中接入一级固料种子液；或
按质量分数为8% 15%的接种量在固料培养基中接入一级液体种子，摇动K瓶混合均匀，25 28°C，培养2 3天；制得二级固料种子；4) 二级固料种子发酵罐扩大培养:二级固料种子加入1:3 5 (W/V)无菌水振荡洗下菌体，按质量分数为10% 20%的接种量接种至发酵罐扩大培养，发酵前48h温度控制在25 28°C，利用搅拌转 速保持30% 50%的溶氧，48h至发酵结束温度控制在18 22°C，发酵3 5天，通过重量百分比为28%的氨水控制发酵pH6.0 6.5，整个发酵过程自动流加经118°C灭菌25min的浓度为580g/L的葡萄糖溶液控制发酵葡萄糖浓度在4 8g/L ；在步骤4)中，所述扩大培养采用的液体发酵培养基的组成可为:葡萄糖30 60g/L, NaCl 15 20g/L, MgSO4.7H204 8g/L,酵母粉 3 8g/L, KH2PO40.5 1.0g/L,(NH4)2SO40.2 0.5g/L, NaHCO30.8 1.2g/L, CoCl2L 0 ~ 2.0 u g/L, MnSO40.5 1.0 y g/L，VB10.05 0.lmg/L, VB120.001 0.01mg/L，初始pH6.0 7.0 ;所述发酵最好溶氧维持在8% 12%。5)发酵结束后，收集菌体细胞，提取DHA油脂。经测定，发酵液中细胞干重达105 160g/L，DHA含量达20 35g/L。本发明还适用于除裂殖壶菌(Schizochytrium sp.) KDW-12以外的其它裂殖壶菌种属的生产，包括可以从美国典型培养物收集中心、日本大阪发酵工程研究所等保藏机构获得的裂殖壶菌菌种。本发明摒弃传统的种子培养工艺流程，直接由固料发酵获得的种子液进行液体发酵培养:斜面活化一一级固料种子/摇瓶液体种子一二级固料种子液一液体发酵。本发明改进种子制备方式，简化扩种工艺，缩短种子培养和发酵周期，可减少投资，节约成本；同时固料培养基营养丰富，富含多种生长因子，更利于种子的生长，菌种细胞的生长活力强、同步性较好；培养固料种子阶段产生的废水、废渣少，环境污染小。本发明的有益效果是:克服传统发酵方法种子扩培级数较多的缺陷，改进DHA发酵用种子液的制备，可简化DHA生产工艺过程；固料培养基营养丰富，种子饱满活力强，可缩短种子上罐后延迟期，提高DHA产量，降低生产成本，保持稳定的生产能力；培养固料种子阶段产生的废水、废渣少，环境污染小；发酵得到的DHA可作为营养强化剂，为人类和动物提供所需长链多不饱和脂肪酸。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例中用到的菌种为:裂殖壶菌(Schizochytriumsp.) KDff-12 (CGMCCN0.6843)；裂殖壶菌(Schizochytriumsp.) S31 (ATCC N0.20888)裂殖壶菌(Schizochytriumsp.) S8 (ATCC N0.20889)裂殖壶菌Schizochytrium aggregatum(ATCC N0.28209)实施例1:将裂殖壶菌(Schizochytrium sp.) KDW-12菌种接种于斜面培养基上培养活化，温度为25°C，培养2天。斜面培养基配方为(g/L):葡萄糖20，蛋白胨15，酵母粉3，海水晶15，琼脂粉20，pH值6.5，121 °C灭菌30min。培养到期斜面加入质量百分数为0.85%的生理盐水洗涤菌体，获得菌悬液，控制菌体浓度为2.5 X IO6个/mL。
获得的菌悬液按质量分数为1%的接种量直接接种至灭菌的固料培养基上，25°C培养I天，制得一级固料种子。
在无菌条件下，按质量分数为10%的接种量在固料培养基中接入一级固料种子(用于接种的一级固料种子以质量百分数为0.85%的生理盐水根据1:1(W/V)比例洗涤菌体，制成菌悬液)，摇动K瓶混合均匀，25°C，培养2.5天，制得二级固料种子。
二级固料种子加入1:4 (W/V)无菌水振荡洗下菌体，按质量分数为15%的接种量接种至50L发酵罐扩大培养，接后体积32L。发酵前48h温度控制在25°C，利用搅拌转速保持40%的溶氧，48h至发酵结束温度控制在22°C，溶氧维持在10%左右，发酵4天。通过重量百分比为28%的氨水控制发酵pH6.5，整个发酵过程自动流加经118°C灭菌25min的浓度为580g/L的葡萄糖溶液控制发酵葡萄糖浓度在8g/L。
固料培养基的制备方法为:由固态组分和液体营养液组分组成，其中固态组分为小米，含量为375g/L，小米与液体营养液组分I按8:3 (W/V)比例混合均匀，将谷物蒸煮至谷物中心无白心，且含水率为55%，获得固料培养基原料。固料培养基原料与液体营养液组分2按10:3 (W/V)比例混合均匀，装于固态发酵K瓶中，厚度0.3挪，1211:灭菌301^11，制得固料培养基。
液体营养液组分I (g/L):葡萄糖3，七水硫酸镁0.2，磷酸氢二钾3.0,海盐0.6，甘氨酸0.6，苏氨酸1.5，蛋氨酸2，苹果酸4，加水定容至所需体积，调节pH值6.5。组分2(mg/L):La3+15，Ce3+2，Sm3 +3，Nd3+8，Mn2+L O, Co2+0.08，生物素 0.2，浅蓝菌素 0.1，赤霉素 GA5，VB12LO,叶酸0.03，余量为水。
液体发酵培养基组成:葡萄糖30g/L，NaC120g/L, MgSO4.7H205g/L,酵母粉3g/L，KH2PO4L Og/L, (NH4)2SO40.4g/L, NaHCO3L 2g/L, CoC122.0 μ g/L, MnSO40.7 μ g/L, VB10.06mg/L, VB120.005mg/L,初始 pH6.5。
发酵结束，收集菌体细胞，测定发酵液中细胞干重达125g/L，DHA含量达25g/L。提取的DHA可作为营养强化剂，为人类和动物提供所需长链多不饱和脂肪酸。
实施例2:
将裂殖壶菌(Schizochytrium sp.) KDW-12菌种接种于斜面培养基上培养活化，温度为28°C，培养2天。斜面培养基配方为(g/L):葡萄糖25，蛋白胨12，酵母粉3，海水晶16，琼脂粉20，pH值6.0，121°C灭菌30min。培养到期斜面加入质量百分数为0.85%的生理盐水洗涤菌体，获得菌悬液，控制菌体浓度为1.0 X IO6个/mL。
获得的菌悬液直接接种至摇瓶液体培养基上，接种量1%，摇瓶转速220rpm，28°C培养I天，制得一级液体种子。摇瓶液体种子培养基组成(g/L):葡萄糖25，氯化钠20，磷酸二氢钾0.2，酵母粉5，七水硫酸镁10，海盐0.4，谷氨酸0.4，pH值6.0，121°C灭菌30min。
在无菌条件下，按质量分数为10%的接种量在固料培养基中接入一级液体种子，摇动K瓶混合均匀，26°C，培养3天，制得二级固料种子。
二级固料种子加入1:3 (W/V)无菌水振荡洗下菌体，按质量分数为20%的接种量接种至100L发酵罐扩大培养，接后体积60L。发酵前48h温度控制在28°C，保持30%的溶氧，48h至发酵结束温度控制在18°C，溶氧维持在10%左右。发酵5天。通过重量百分比为28%的氨水控制发酵pH6.0，整个发酵过程自动流加经118°C灭菌25min的浓度为580g/L的葡萄糖溶液控制发酵葡萄糖浓度在7g/L。固料培养基的制备方法为:由固态组分和液体营养液组分组成，其中固态组分为小米，含量为300g/L，小米与液体营养液组分I按8:3 (W/V)比例混合均匀，将谷物蒸煮至谷物中心无白心，且含水率为60%，培养基原料与液体营养液组分2按10:4 (W/V)比例混合均匀，装于固态发酵K瓶中，厚度0.5cm，121°C灭菌30min，制得固料培养基。液体营养液组分I (g/L):葡萄糖5，七水硫酸镁0.4，磷酸氢二钾2.0，海盐0.5，甘氨酸0.3，苏氨酸1.5，蛋氨酸3.5，苹果酸6，加水定容至所需体积,调节pH值6.0。组分2(mg/L):La3+10，Ce3+4，Sm3+5，Nd3+9，Mn2+0.8，Co2+0.06，生物素 0.2，浅蓝菌素 0.1，赤霉素 GA2，VB120.8，叶酸0.03，余量为水。液体发酵培养基组成:葡萄糖40g/L，NaC115g/L, MgSO4.7H204g/L,酵母粉5g/L，KH2PO40.5g/L, (NH4)2SO40.2g/L, NaHCO30.8g/L, CoCl2L 5 u g/L, MnSO4L 0 u g/L, VB10.lmg/L,VB120.01mg/L，初始 pH6.0。发酵结束，收集菌体细胞，测定发酵液中细胞干重达159g/L，DHA含量达34.5g/L。提取的DHA可作为营养强化剂，为人类和动物提供所需长链多不饱和脂肪酸。实施例3:将裂殖壶菌(Schizochytrium sp.) KDW-12菌种接种于斜面培养基上培养活化，温度为28°C，培养3天。斜面培养基配方为(g/L):葡萄糖30，蛋白胨12，酵母粉3，海水晶15，琼脂粉20，pH值6.5，121 °C灭菌30min。培养到期斜面加入质量百分数为0.85%的生理盐水洗涤菌体，获得菌悬液，控制菌体浓度为2.0 X IO6个/mL。获得的菌悬液按质量分数为1`%的接种量直接接种至摇瓶液体培养基上，摇瓶转速220rpm，28°C培养I天，制得一级液体种子。摇瓶液体种子培养基组成(g/L):葡萄糖20，氯化钠22，磷酸二氢钾0.2，酵母粉3，七水硫酸镁10，海盐0.3，谷氨酸0.6，pH值6.5，121°C灭菌30min。在无菌条件下，按质量分数为8%的接种量在固料培养基中接入一级液体种子，摇动K瓶混合均匀，26°C，培养3天，制得二级固料种子。二级固料种子加入1:3 (W/V)无菌水振荡洗下菌体，按质量分数为10%的接种量接种至100L发酵罐扩大培养，接后体积60L。发酵前48h温度控制在25°C，保持30%的溶氧，48h至发酵结束温度控制在20°C，溶氧维持在10%左右。发酵5天。通过重量百分比为28%的氨水控制发酵pH6.0，整个发酵过程自动流加经118°C灭菌25min的浓度为580g/L的葡萄糖溶液控制发酵葡萄糖浓度在8g/L。固料培养基的制备方法为:由固态组分和液体营养液组分组成，其中固态组分为小麦，含量为350g/L，小麦与液体营养液组分I按10:4 (W/V)比例混合均匀，将谷物蒸煮至谷物中心无白心，且含水率为55%，培养基原料与液体营养液组分2按15:4 (W/V)比例混合均匀，装于固态发酵K瓶中，厚度0.7cm，121 °C灭菌30min，制得固料培养基。液体营养液组分I (g/L):葡萄糖3.5，七水硫酸镁0.3，磷酸氢二钾3.0，海盐0.4，甘氨酸0.5,苏氨酸1.6,蛋氨酸3.5,苹果酸5,加水定容至所需体积,调节pH值6.0。组分2 (mg/L):La3+12，Ce3+4, Sm3+5, Nd3+8, Mn2+0.9，Co2+0.08，生物素 0.4，浅蓝菌素 0.1，赤霉素GA3，VB120.8，叶酸0.02，余量为水。
液体发酵培养基组成:葡萄糖40g/L，NaC116g/L, MgSO4.7H206g/L,酵母粉4g/L，KH2PO4L Og/L, (NH4)2SO40.5g/L, NaHCO3L 2g/L, CoC122.0 μ g/L, MnSO4L 0 μ g/L, VB10.05mg/L, VB120.005mg/L,初始 pH6.0。
发酵结束，收集菌体细胞，测定发酵液中细胞干重达132g/L，DHA含量达30.5g/L。提取的DHA可作为营养强化剂，为人类和动物提供所需长链多不饱和脂肪酸。
实施例4:
将裂殖壶菌(Schizochytrium sp.S31) (ATCC N0.20888)菌种接种于斜面培养基上培养活化，温度为28°C，培养2天。斜面培养基配方为(g/L):葡萄糖30，蛋白胨12，酵母粉3，海水晶15，琼脂粉20，pH值6.5，121°C灭菌30min。培养到期斜面加入质量百分数为0.85%的生理盐水洗涤菌体，获得菌悬液，控制菌体浓度为1.5 X IO6个/mL。
获得的菌悬液按质量分数为1%的接种量直接接种至摇瓶液体培养基上，摇瓶转速200rpm，28°C培养I天，制得一级液体种子。摇瓶液体种子培养基组成(g/L):葡萄糖20，氯化钠22，磷酸二氢钾0.2，酵母粉5，七水硫酸镁12，海盐0.3，谷氨酸0.6，pH值6.5，121°C灭菌30min。
在无菌条件下，按质量分数为15%的接种量在固料培养基中接入一级液体种子，摇动K瓶混合均匀，26°C，培养2天，制得二级固料种子。
二级固料种子加入1:3 (W/V)无菌水振荡洗下菌体，按质量分数为10%的接种量接种至100L发酵罐扩大培养，接后体积60L。发酵前48h温度控制在25°C，保持30%的溶氧，48h至发酵结束温度控制在20°C，溶氧维持在10%左右。发酵4.5天。通过重量百分比为28%的氨水控制发酵pH6.0，整个发酵过程自动流加经118°C灭菌25min的浓度为580g/L的葡萄糖溶液控制发酵葡萄糖浓度在6g/L。
固料培养基的制备方法为:由固态组分和液体营养液组分组成，其中固态组分为小米，含量为350g/L，小米与液体营养液组分I按10:4 (W/V)比例混合均匀，将谷物蒸煮至谷物中心无白心，且含水率为55%，培养基原料与液体营养液组分2按10:4 (W/V)比例混合均匀，装于固态发酵K瓶中，厚度0.3cm，121 °C灭菌30min，制得固料培养基。
液体营养液组分I (g/L):葡萄糖3，七水硫酸镁0.5，磷酸氢二钾5.0，海盐0.8，甘氨酸0.2，苏氨酸1.6，蛋氨酸3.5，苹果酸3，加水定容至所需体积,调节pH值6.0。组分2(mg/L):La3+15, Ce3+4, Sm3+5, Nd3+IO,Mn2+0.9, Co2+0.1,生物素 0.4,浅蓝菌素 0.2,赤霉素 GA2,VB12LO,叶酸0.02，余量 为水。
液体发酵培养基组成:葡萄糖40g/L，NaC120g/L, MgSO4.7H206g/L,酵母粉4g/L，KH2PO4L Og/L, (NH4)2SO40.5g/L, NaHCO30.8g/L, CoC122.0 μ g/L, MnSO40.5 μ g/L, VB10.05mg/L, VB120.005mg/L,初始 pH6.0。
发酵结束，收集菌体细胞，测定发酵液中细胞干重达115g/L，DHA含量达22.7g/L。提取的DHA可作为营养强化剂，为人类和动物提供所需长链多不饱和脂肪酸。
实施例5:
将裂殖壶菌(Schizochytrium sp.S8) (ATCC20889)菌种接种于斜面培养基上培养活化，温度为28°C，培养2天。斜面培养基配方为(g/L):葡萄糖20，蛋白胨12，酵母粉3，海水晶20，琼脂粉20，pH值6.5，121°C灭菌30min。培养到期斜面加入质量百分数为0.85%的生理盐水洗涤菌体，获得菌悬液，控制菌体浓度为2.5 X IO6个/mL。
获得的菌悬液按质量分数为1%的接种量直接接种至摇瓶液体培养基上，摇瓶转速220rpm，28°C培养I天，制得一级液体种子。摇瓶液体种子培养基组成(g/L):葡萄糖25，氯化钠22，磷酸二氢钾0.5，酵母粉5，七水硫酸镁12，海盐0.3，谷氨酸0.6，pH值6.5，121°C灭菌30min。在无菌条件下，按质量分数为12%的接种量在固料培养基中接入一级液体种子，摇动K瓶混合均匀，28°C，培养3天，制得二级固料种子。二级固料种子加入1:4 (W/V)无菌水振荡洗下菌体，按质量分数为18%的接种量接种至1000L发酵罐扩大培养，接后体积600L。发酵前48h温度控制在28°C，保持30%的溶氧，48h至发酵结束温度控制在20°C，溶氧维持在10%左右。发酵5天。通过重量百分比为28%的氨水控制发酵pH6.5，整个发酵过程自动流加经118°C灭菌25min的浓度为580g/L的葡萄糖溶液控制发酵葡萄糖浓度在8g/L。固料培养基的制备方法为:由固态组分和液体营养液组分组成，其中固态组分为大米，含量为300g/L，大米与液体营养液组分I按8:5 (W/V)比例混合均匀，将谷物蒸煮至谷物中心无白心，且含水率为50%，培养基原料与液体营养液组分2按15:3 (W/V)比例混合均勻，厚度0.5cm。液体营养液组分I (g/L):葡萄糖3，七水硫酸镁0.5，磷酸氢二钾5.0，海盐0.8，甘氨酸0.2，苏氨酸1.6，蛋氨酸3.5，苹果酸3，加水定容至所需体积,调节pH值6.0。组分2(mg/L):La3+15,Ce3+4,Sm3+5, Nd3+IO,Mn2+L 2, Co2+0.1,生物素 0.4,浅蓝菌素 0.2,赤霉素 GA2,VB12LO,叶酸0.02，余量为水。液体发酵培养基组成:葡萄糖40g/L，NaC120g/L, MgSO4.7H206g/L,酵母粉4g/L，KH2PO4L Og/L, (NH4)2SO40.5g/L, NaHCO30.8g/L, CoC122.0 u g/L, MnSO40.5 u g/L, VB10.05mg/L, VB120.005mg/L,初始 pH6.5。发酵结束，收集菌体细胞，测定发酵液中细胞干重达138g/L，DHA含量达31.6g/L。提取的DHA可作为营养强化剂，为人类和动物提供所需长链多不饱和脂肪酸。实施例6:将裂殖壶菌(Schizochytrium aggregatum) (ATCC28209)菌种接种于斜面培养基上培养活化，温度为25°C，培养2天。斜面培养基配方为(g/L):葡萄糖20，蛋白胨15，酵母粉3，海水晶15，琼脂粉20，pH值6.5，121°C灭菌30min。培养到期斜面加入质量百分数为
0.85%的生理盐水洗涤菌体，获得菌悬液，控制菌体浓度为2.5 X IO6个/mL。获得的菌悬液按质量分数为1%的接种量直接接种至灭菌的固料培养基上28°C培养I天，制得一级固料种子。在无菌条件下，按质量分数为20%的接种量在固料培养基中接入一级固料种子(用于接种的一级固料种子以质量百分数为0.85%的生理盐水根据1:1(W/V)比例洗涤菌体，制成菌悬液)，摇动K瓶混合均匀，25°C，培养3天，制得二级固料种子。二级固料种子加入1:4 (W/V)无菌水振荡洗下菌体，按质量分数为12%的接种量接种至1000L发酵罐扩大培养，接后体积600L。发酵前48h温度控制在28°C，保持40%的溶氧，48h至发酵结束 温度控制在18°C，溶氧维持在10%左右。发酵5天。通过重量百分比为28%的氨水控制发酵pH6.5，整个发酵过程自动流加经118°C灭菌25min的浓度为580g/L的葡萄糖溶液控制发酵葡萄糖浓度在8g/L。
固料培养基的制备方法为:由固态组分和液体营养液组分组成，其中固态组分为大麦，含量为375g/L，大麦与液体营养液组分I按8:3 (W/V)比例混合均匀，将谷物蒸煮至谷物中心无白心，且含水率为55%，培养基原料与液体营养液组分2按10:3 (W/V)比例混合均勻，厚度0.5cm。
液体营养液组分I (g/L):葡萄糖5，七水硫酸镁0.2，磷酸氢二钾3.0,海盐0.6，甘氨酸0.6，苏氨酸1.5，蛋氨酸2，苹果酸4，加水定容至所需体积，调节pH值6.5。组分2(mg/L):La3+15，Ce3+2，Sm3+3，Nd3+8，Mn2+L 2，Co2+0.08，生物素 0.2，浅蓝菌素 0.1，赤霉素 GA5，VB12LO,叶酸0.03，余量为水。
液体发酵培养基组成:葡萄糖30g/L，NaC120g/L, MgSO4.7H205g/L,酵母粉3g/L，KH2PO4L Og/L, (NH4)2SO40.4g/L, NaHCO3L 2g/L, CoC122.0 μ g/L, MnSO40.7 μ g/L, VB10.06mg/L, VB120.005mg/L,初始 pH6.5。
发酵结束，收集菌体细胞，测定发酵液中细胞干重达142g/L，DHA含量达32.3g/L。提取的DHA可作为营养强化剂，为人 类和动物提供所需长链多不饱和脂肪酸。
权利要求
1.一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产DHA的方法，其特征在于包括如下步骤: 1)菌种活化与菌悬液制备:将裂殖壶菌(Schizochytriumsp.) KDff-12菌种接种于斜面培养基上培养活化，培养到期斜面加入质量百分数为0.85%的生理盐水洗涤菌体，获得菌悬液；所述裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)KDW_12,已于2012年11月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC N0.6843 ； 2)—级种子制备:将步骤I)获得的菌悬液按质量分数为1%的接种量接种至固料培养基上培养，制成一级固料种子；或 将步骤I)获得的菌悬液按质量分数为1%的接种量接种至液体种子培养基，摇瓶培养，制成一级液体种子； 3)二级固料种子的制备 :一级固料种子以质量百分数为0.85%的生理盐水根据1:1 (W/V)比例洗涤菌体，制成菌悬液； 在无菌条件下: 按质量分数为10% 20%的接种量在固料培养基中接入一级固料种子液；或 按质量分数为8% 15%的接种量在固料培养基中接入一级液体种子，摇动K瓶混合均勻，25 28°C，培养2 3天； 制得二级固料种子； 4)二级固料种子发酵罐扩大培养:二级固料种子加入1:3 5 (W/V)无菌水振荡洗下菌体，按质量分数为10% 20%的接种量接种至发酵罐扩大培养，发酵前48h温度控制在.25 28°C，利用搅拌转速保持30% 50%的溶氧，48h至发酵结束温度控制在18 22°C，发酵3 5天，通过重量百分比为28%的氨水控制发酵pH6.0 6.5，整个发酵过程自动流加经118°C灭菌25min的浓度为580g/L的葡萄糖溶液控制发酵葡萄糖浓度在4 8g/L ； 5)发酵结束后，收集菌体细胞，提取DHA油脂。
2.如权利要求1所述的一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产DHA的方法,其特征在于在步骤I)中，所述斜面培养基的配方为:葡萄糖20 30g/L，蛋白胨10 15g/L，酵母粉.3 5g/L，海水晶15 20g/L，琼脂粉20g/L，pH值6 7，121°C灭菌30min ;所述培养活化的温度可为25 28°C，培养活化的时间可为2 3天；所述菌悬液的菌体浓度可为1.0 .2.5 X IO6 个/mL。
3.如权利要求1所述的一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产DHA的方法,其特征在于在步骤2)中，所述固料培养基包括固态组分和液体营养液组分，所述固态组分为谷物，含量为250 400g/L，所述谷物可选自米类、麦类和玉米中的至少一种，所述米类可选自大米、小米、糙米等中的至少一种，所述麦类可选自大麦、小麦、燕麦中的至少一种。
4.如权利要求1所述的一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产DHA的方法,其特征在于在步骤2)中，所述液体营养液组分包括组分I和组分2，所述组分I的组成为:葡萄糖2 .5g/L,七水硫酸镁0.2 0.6g/L，磷酸氢二钾1.0 5.0g/L,海盐0.1 0.8g/L，甘氨酸.0.2 0.6g/L,苏氨酸1.5 1.8g/L,蛋氨酸2 3.5g/L,苹果酸3 6g/L，加水定容，调节pH值为6 7 ;所述组分2的组成为:La3+IO 15mg/L, Ce3+I 4mg/L, Sm3+2 6mg/L,Nd3+8 12mg/L, Mn2+0.6 1.2mg/L, Co2+0.05 0.lmg/L,生物素 0.2 0.6mg/L,浅蓝菌素 0.1 0.3mg/L,赤霉素 GA2 5mg/L, VB120.5 1.0mg/L,叶酸 0.01 0.05mg/L,余量为水。
5.如权利要求1所述的一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产DHA的方法,其特征在于在步骤2)中，所述固料培养基的制备方法为:固态组分与液体营养液组分I混合均匀，将谷物蒸或煮至谷物中心无白心，且含水率为50% 65%，获得固料培养基原料；将固料培养基原料与液体营养液组分2混合均匀，装于固态发酵K瓶中，厚度0.2 1.0cm, 121°C灭菌30min，制得固料培养基。
6.如权利要求5所述的一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产DHA的方法,其特征在于所述固态组分与液体营养液组分I按质量/体积的配比为(5 10) g: (2 5)mL，其中固态组分按质量计算，液体营养液组分I按体积计算； 所述固料培养基原料与液体营养液组分2按质量/体积的配比为(10 15)g: (3 6) mL，其中固料培养基原料按质量计算，液体营养液组分2按体积计算。
7.如权利要求1所述的一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产DHA的方法,其特征在于在步骤2)中，所述液体种子培养基的组成为:葡萄糖20 25g/L，氯化钠20 25g/L，磷酸二氢钾0.2 0.5g/L，酵母粉3 5g/L，七水硫酸镁8 12g/L，海盐0.1 0.8g/L，谷氨酸 0.2 0.6g/L, pH 值 6 7，121°C灭菌 30min。
8.如权利要求1所述的一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产DHA的方法,其特征在于在步骤2)中，所述培养的温度为25 28°C，培养的时间为I天。
9.如权利要求1所述的一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产DHA的方法,其特征在于在步骤2)中，所述摇瓶的转速为180 220rpm ;摇瓶培养的温度为25 28°C，摇瓶培养的时间为I天。
10.如权利要求1所述的一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产DHA的方法，其特征在于在步骤4)中，所述扩大培养采用的液体发酵培养基的组成为:葡萄糖30 60g/L, NaCl 15 20g/L, MgSO4.7H204 8g/L,酵母粉 3 8g/L, KH2PO40.5 1.0g/L,(NH4)2SO40.2 0.5g/L, NaHCO30.8 1.2g/L, CoCl2L 0 ~ 2.0 u g/L, MnSO40.5 1.0 y g/L，VB10.05 0.lmg/L, VB120.001 0.01mg/L，初始pH6.0 7.0 ;所述发酵最好溶氧维持在8% 12%。
全文摘要
一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产DHA的方法，涉及发酵生产DHA的方法。采用的菌种为裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)KDW-12。菌种活化与菌悬液制备；一级种子制备；二级固料种子的制备；二级固料种子发酵罐扩大培养；发酵结束后，收集菌体细胞，提取DHA油脂。提取的DHA可作为营养强化剂，为人类和动物提供所需长链多不饱和脂肪酸。改进种子制备方式，简化扩种工艺，缩短种子培养和发酵周期，可减少投资，节约成本；同时固料培养基营养丰富，富含多种生长因子，更利于种子的生长，菌种细胞的生长活力强、同步性较好；培养固料种子阶段产生的废水、废渣少，环境污染小。
文档编号C12R1/645GK103146584SQ201210593090
公开日2013年6月12日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者陈金卿, 陈芳芳, 陈俊煌, 林超, 吴美琼 申请人:厦门金达威集团股份有限公司, 内蒙古金达威药业有限公司