专利名称：一种曼氏无针乌贼微卫星位点及引物的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学DNA标记技术领域，具体涉及一种曼氏无针乌贼微卫星位点及引物。
背景技术：
微卫星DNA (Microsatellite):又称为短串联重复序列(short tandemrepeats, STRs)或简单序列重复(simple sequence repeats, SSRs)。它是以1- 6 个喊基的短核苷酸为基本单位首尾相连组成串联重复序列，由于重复次数不同以及重复程度的不完全造成了每个位点的长度多态性。由于每个微卫星两端的序列多是相对保守的单拷贝序列，可根据其两端设计一对特异性引物，通过PCR技术来扩增相应位点的微卫星序列，再经电泳分析，即可显示不同基因型个体微卫星的多态性。微卫星由于分布广泛，密度大，多态性丰富，遵循孟德尔分离定律，共显性遗传、易于PCR扩增，所需DNA数量极少，对DNA质量要求不高，结果重复性好等优点，目前已被广泛应用于遗传多样性、亲缘关系分析、连锁图谱构建、功能基因定位、分子标记辅助育种(Marker-assisted Selection, MAS)等领域。曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni, Rochebrune)俗称墨鱼、日本无针乌贼，隶属软体动物门(Mollusca)、头足纲(Cephalopoda)、二觸亚纲(Dibranchia)、十腕目(Decapoda)、乌贼超科(Sepiacea)、乌贼科(Sepiidae)、无针乌贼属(Sepiella),是我国近海广布性种，曾是我国四大海产渔业(大黄鱼、小黄鱼、墨鱼与带鱼)之一，以舟山渔场产量最大，在我国沿海知名度很高。由于过度捕捞，至上世纪80年代，乌贼的资源量锐减，渔讯消失，趋于濒危状态。为了加强对曼氏无针乌贼资源的保护，近年来其增殖放流及产卵场的保护和修复工作逐步展开，迫切需要对资源现状及增殖放流的效果进行遗传学评估以制定合理的放流措施。微卫星分 子标记在物种的群体遗传学及放流增殖效果评估方面具有广阔的应用前景，因此，选用有效的微卫星标记对于曼氏无针乌贼资源的保护和合理开发利用具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供曼氏无针乌贼微卫星位点及多态性引物，即提供6个曼氏无针乌贼的微卫星位点，以及相应的多态性引物，为曼氏无针乌贼的种群遗传学、家系鉴定及分子标记辅助育种技术提供有效的工具。本发明一个方面提供6个微卫星位点,其核酸序列分别为SEQ ID N0:l_6。本发明还提供上述核酸序列的互补序列。本发明还提供从上述6个微卫星位点上设计的引物对，其中序列为SEQ ID NO 1的微卫星位点设计的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID N0:7、SEQ ID NO :8。序列为SEQ ID NO :2的微卫星位点设计的引物对，其上下游序列分别为SEQ IDNO :9、SEQ ID NO :10。
序列为SEQ ID NO :3的微卫星位点设计的引物对，其上下游序列分别为SEQ IDNO 1USEQ ID NO :12。序列为SEQ ID NO :4的微卫星位点设计的引物对，其上下游序列分别为SEQ IDNO 13, SEQ ID NO :14。序列为SEQ ID NO :5的微卫星位点设计的引物对，其上下游序列分别为SEQ IDNO 15, SEQ ID NO :16。序列为SEQ ID NO :6的微卫星位点设计的引物对，其上下游序列分别为SEQ IDNO 17, SEQ ID NO :18。本发明的微卫星多态性引物用于曼氏无针乌贼种群遗传多样性的检测，包括如下步骤I)基因组DNA的提取采用苯酚-氯仿法抽提曼氏无针乌贼肌肉组织的基因组DNA ；2)微卫星PCR扩增采用设计的引物，曼氏无针乌贼基因组DNA为模板进行PCR，获得曼氏无针乌贼个体微卫星扩增产物；3)电泳检测扩增产物采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染法检测微卫星扩增产物； 4)遗传多样性分析根据每个个体微卫星扩增产物的分子量大小确定基因型，采用GENEPOP 4. O. 10计算遗传多样性参数。本发明从曼氏无针乌贼基因组DNA中筛选6个微卫星位点，并在微卫星重复序列两端的侧翼区设计特异性引物进行扩增，获得的产物具有高度的多态性和稳定性，可用于曼氏无针乌贼的群体遗传学、亲缘关系分析、分子标记辅助育种等领域。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明的方法进行详细的描述，对于实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。一、微卫星位点的筛选1、含有微卫星位点的序列查找从构建的曼氏无针乌贼墨囊基因文库的序列中用软件SSRHUNTER1.3 (http://www. biosoft. net/dna/SSRHunter. htm)进行微卫星序列的查找；参数设置为查找含有二碱基、三碱基和四碱基重复数5次以上的序列。共筛选出50个含有微卫星重复的位点，并从中设计引物进行多态性的检测。2、微卫星引物设计从含有微卫星的基因序列中，选取符合引物设计的序列使用PrimerPremier5. O进行引物设计。主要参数设置为引物长度18_25p，20个为最适长度，PCR产物片段长度范围100-350bp，最适退火温度55-65 °C。GC含量一般在40%_60%之间，尽量避免二级结构出现。3、将设计的弓丨物进行多态性检测I)基因组DNA的提取
采用苯酚-氯仿法抽提25个曼氏无针乌贼肌肉组织的基因组DNA ；2 )微卫星PCR的扩增采用设计的微卫星引物序列扩增曼氏无针乌贼基因组DNA ;反应体系10 μ L，包括2 X Power Taq PCR Master Mix (BioTeke, Beijing, China) 5 μι,正、反向引物各 I μ Μ,基因组DNA约100 ng。PCR反应程序为94° C预变性3 min，然后进行35个扩增循环，每一循环包括94° C变性I min，退火温度I min (各引物退火温度见表2)，72° C延伸Imin,最后 72° C 延伸 5 min。3)扩增产物电泳采用8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物，800W恒功率电泳1-1. 5小时分离。胶板通过10%的冰醋酸溶液30min，蒸馏水6min，O. 2%硝酸银溶液30min，3%的碳酸钠显色30秒,终止反应即得到扩增产物片段,采用10-bp DNA ladder (Invitrogen Inc.)作为marker检测等位基因位置。4)遗传多样性分析根据每个体微卫星扩增产物的分子量大小确定基因型，采用GENEPOP 4. O. 10计算遗传多样性参数，从而筛选出具有多态性的微卫星引物及对应的位点。经过多样性检测，本发明共筛选出6个具有遗传多态性的微卫星位点，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO: 1-6,其设计的多态性引物的信息如表I所示表1:6个微卫星位点及对应引物信息
权利要求
1.一种曼氏无针乌贼微卫星位点，所述的位点为 1)序列为SEQID NO: 1-6中的任一个的微卫星位点， 2)与I)中的微卫星位点的核苷酸序列互补的微卫星位点。
2.微卫星引物对，所述的引物对是从权利要求1所述微卫星位点上设计的。
3.如权利要求2所述的微卫星引物对，其中序列为SEQID NO :1的微卫星位点设计的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID N0:7、SEQ ID NO :8。
4.如权利要求2所述的微卫星引物对，其中序列为SEQID NO :2的微卫星位点设计的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID N0:9、SEQ ID NO 10o
5.如权利要求2所述的微卫星引物对，其中序列为SEQID NO :3的微卫星位点设计的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO =IUSEQ ID NO 120
6.如权利要求2所述的微卫星引物对，其中序列为SEQID NO :4的微卫星位点设计的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO 13, SEQ ID NO :14。
7.如权利要求2所述的微卫星引物对，其中序列为SEQID NO :5的微卫星位点设计的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 160
8.如权利要求2所述的微卫星引物对，其中序列为SEQID NO :6的微卫星位点设计的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 180
9.权利要求2所述的微卫星引物对用于曼氏无针乌贼种群遗传多样性的检测，包括如下步骤1)基因组DNA的提取采用苯酚-氯仿法抽提曼氏无针乌贼肌肉组织的基因组DNA； 2)微卫星PCR扩增采用设计的引物，曼氏无针乌贼基因组DNA为模板进行PCR，获得曼氏无针乌贼个体微卫星扩增产物； 3)电泳检测扩增产物采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染法检测微卫星扩增产物； 4)遗传多样性分析根据每个个体微卫星扩增产物的分子量大小确定基因型，采用GENEPOP 4. O. 10计算遗传多样性参数。
全文摘要
本发明涉及一种曼氏无针乌贼微卫星位点及引物，6个微卫星位点，其核酸序列分别为SEQ ID NO:1-6。引物序列为SEQ ID NO:7-18。 本发明从曼氏无针乌贼基因组DNA中筛选6个微卫星位点，并在微卫星重复序列两端的侧翼区设计特异性引物进行扩增，获得的产物具有高度的多态性和稳定性，可用于曼氏无针乌贼的群体遗传学、亲缘关系分析、分子标记辅助育种等领域。
文档编号C12N15/11GK103060317SQ201210592860
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月29日 优先权日2012年12月29日
发明者李荣华, 王春琳, 章成龙, 宋微微, 母昌考, 詹萍萍 申请人:宁波大学