专利名称：一种四环素产生菌原生质体的制备与再生方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物原生质体制备与再生方法，具体地说是一种四环素产生菌原生质体制备与再生的方法。
背景技术：
四环素(Tetracycline，TC)是一种抑制细菌蛋白质合成的广谱抗生素，因其分子结构含四并苯基本骨架而得名，主要用于各种革兰氏阳性球菌和革兰氏阳性杆菌的感染治疗，在医药、畜牧和农业方面均有广泛的用途。我国从20世纪60年代开始工业化生产四环素，至今已有五十多年的历史。四环素产生菌为放线菌中的链霉菌属(Str印tomyces)，目前，其优良菌种的选育主要采用传统的育种方法，菌种经过长期的人工诱变育种和自然分离，已形成较高的生产能力。但是菌种经过多种物理和化学因子诱发突变之后，不仅遗传背景变得相当复杂，而且对诱变剂的耐受性也大大的增强了，因此，利用传统的育种方法继续提高四环素的产量已经越来越困难，菌种诱变率低、选育效果差是困扰四环素菌种选育工作的主要问题。原生质体融合技术是20世纪70年代发展起来的一种新的遗传育种手段，该育种技术的优点是去除了细胞壁的障碍，采用物理因子或化学因子对原生质体进行诱变处理，能够提高原生质体的突变频率，在再生菌落中筛选突变株，可以有效提高优良菌种的选育效率，利用原生质体技术来培育工业新菌株已受到国内外微生物育种工作者的普遍重视。在探索四环素原生质体育种技术的过程中，存在的最大问题是没有关于四环类抗生素原生质体制备和再生的方法可以借鉴，原生质体制备成功后细胞壁的重建过程非常困难，或者是无法产生原生质体的再生菌落，或者是只生长基内菌丝和极少量气生菌丝，不能产生孢子丝，造成菌落不能进行正常的传代。由此极大地限制了原生质技术在四环素菌种选育工作中的应用
发明内容
本发明的目的就是提供一种四环素产生菌原生质体的制备、再生方法，以解决现有传统育种技术中存在的菌种诱变率低及选育效果差的问题。本发明是这样实现的本发明所提供的四环素产生菌原生质体制备与再生的方法，它包括如下步骤a、制备四环素斜面培养基称取小麦麸皮3. 0-3. 5g，硫酸镁0. 004-0. 006g，磷酸氢二钾0. 01-0. 12g，磷酸氢二铵0. 013-0. 015g,琼脂粉1. 3-1. 5g，加蒸馏水至IOOml ；120-124°C条件下湿热灭菌30分钟。斜面培养基装量60ml/茄子瓶。b、制备孢子悬浮液将四环素产生菌接种于斜面培养基上，于33_36°C条件下培养96小时左右，长出外观质量合格的斜面孢子。在无菌条件下加入无菌蒸馏水或菌丝体培养基制成孢子悬浮液，使孢子液浓度在IXlO8Ail以上。C、制备菌丝体培养基称取葡萄糖0. 8-1. 2g,蛋白胨0. 3-0. 5g,酵母膏0. 3-0. 5g,磷酸二氢钾o. 1-0. 2g，硫酸镁0. 03-0. 05g,磷酸氢二钾0. 3-0. 4g，甘氨酸0. 2_lg，加水至100ml ;120-124°C湿热灭菌30分钟。d、制备再生培养基称取面粉2-4g，蛋白胨0.3-0. 5g，磷酸二氢钾0.05-0. 10g，碳酸钙0. 1-0. 4g，蔗糖o-llg,琼脂1. 0-2. 5g，加水至100ml ；120-124°C °C湿热灭菌30分钟后制成平板培养基。e、培养菌丝体将四环素孢子悬浮液接种于c步所述菌丝体培养基中，27°C _33°C条件下，震荡培养22-32小时，离心弃去上清液，得到菌丝体；f、酶解细胞壁将e步骤所得菌丝体中加入稳定液，离心洗涤2-4次，加入溶菌酶溶液，使酶的作用浓度为2mg/ml-6mg/ml，30°C _37°C酶解1-3小时，得到酶解液；g、分离原生质体酶解液经离心先去除沉淀(离心时的优选条件为500转/分，2-4分钟)。然后再将上清液离心(上清液离心的优选条件为转速3500-8000转/分，时间10-15分钟)，获得原生质体；·h、原生质体再生将g步骤所得的原生质体用稳定液离心洗涤2-4次，加入一定量的稳定液制成原生质体悬浮液，血球计数板计数后，用稳定液对原生质体悬浮液进行梯度稀释，采用夹层法培养于再生培养基上，33°C _36°C条件下培养5-7天后形成再生菌落。本发明所述四环素产生菌可选用菌种编号CPCC220020的菌种。本发明所述的稳定液选择高浓度蔗糖渗透液，其中蔗糖浓度以10-11%为宜。本发明b步骤所述的制备四环素孢子悬浮液的方法为将四环素产生菌接种于斜面培养基上，于33-36°C条件下培养96小时左右，长出外观质量合格的斜面孢子。在无菌条件下加入无菌蒸馏水或菌丝体培养基制成孢子悬浮液，孢子液浓度IXlOVml以上。为了更有利于原生质体的形成，本发明将四环素孢子悬浮液接种于c步所述菌丝体培养基时，接种量不低于IO6个/ml。由于原生质体对溶液和培养基的渗透压很敏感，必须在高渗透压或等渗透压的环境下才能维持其生存。因此，本发明方法所述原生质体再生工序中药选用稳定剂。其中以质量比浓度为10-11%的蔗糖溶液为优选稳定剂，其作为原生质体保护剂，可营造一个高渗的环境，然后加入溶菌酶溶液进行酶解，起到保护原生质体免于膨胀破裂的作用。为了能够提高菌种突变率，选育出更好的高产菌种，本发明对所制备原生质体进行诱变处理。其优选的处理方法包括有所述获得的原生体，经物理诱变剂紫外线进行诱变处理(紫外线照射时间30秒至120秒；照射距离33-66cm)；所述获得的原生体,经化学诱变剂乙烯亚胺(EI)在1000ug/ml条件下处理50-100分钟。本发明提供了一种四环素菌种选育的新方法，解决了四环素原生质体菌落无法再生和产孢子能力低、不能传代的问题。该育种方法去除了菌体细胞壁的障碍，提高了菌种突变率，再生菌落能产生丰厚的孢子丝，适宜于接斜面传代，值得在四环素类抗生素菌种选育工作中进行推广和应用。本发明方法制备的原生质体释放量高达IO4个/ml，其再生率可达3%以上。
具体实施例方式以下通过具体实施例对本发明作进一步的详述，但并不以此对本发明进行任何限制。下述实施例中的溶菌酶来源于AMRESC0公司，用稳定液配制而成，酶溶解之后采用过滤方式除菌(0. 22um的水系针头过滤器)，溶菌酶配制浓度是10%。下述实施例中的稳定液为10. 3%的蔗糖溶液。实施例1a、菌丝体的培养将四环素产生菌(Streptomyces aureofaciens)斜面孢子制成孢子悬浮液,接种于菌丝体培养基中，接种量不低于IO6个/ml，30°C条件下震荡培养26小时，获得菌丝体培养液，显微镜镜检菌丝呈网状，离心(3500转/分，10分钟)弃去上清液，获得菌丝体。其中四环素斜面孢子的菌种来源于中国微生物菌种总目录，菌株保藏编号CPCC220020。菌丝体培养基由蒸馏水配制而成，以IOOml菌丝体培养基总体积计，其含有以下组分葡萄糖lg，蛋白胨0. 4g，酵母膏0. 4g，磷酸氢二钾0. 4g，磷酸二氢钾0. 2g，硫酸镁
0.058，甘氨酸化。灭菌条件121°C，30分钟。b、原生质体的制备将a步骤所得菌丝体用10. 3%蔗糖稳定液离心(3500转/分，10分钟)洗涤3次，加入溶菌酶溶液，使反应容器(试管)中溶菌酶的作用浓度为4mg/ml，置于35°C恒温水浴箱中进行酶解，每10分钟震荡一次，酶解2小时，镜检原生质体释放量达IO6个/ml以上，将反应容器(试管)从水浴箱中取出，终止酶解。酶解液经离心(转速500转/分，时间3分钟)去除沉淀，上清液再进行离心(转速5000转/分，时间15分钟)获得原生质体。C、将原生质体用稳定液离心洗涤3次(稳定液加至离心管IOml处，3500转/分，离心10分钟)，加入5ml稳定液制成原生质体悬浮液。d、原生质体悬浮液用稳定液进行稀释，经夹层法培养于再生培养基上，34_35°C培养5-6天，形成再生菌落，再生菌落直径2-5mm，馒头形或草帽型，外观鼠灰色，孢子丰厚，孢子丝初旋至松敞螺旋形，孢子卵圆形，表面光滑，适于传代。其中再生培养基由体积比为1:1的蒸馏水和饮用水配制而成，以IOOml再生培养基总体积计，其中含有以下组分面粉2g，蛋白胨0. 05g，磷酸二氢钾0. 08g，碳酸钙0. lg，蔗糖2g，琼脂2.2g。灭菌条件121°C，30分钟。实施例2a、菌丝体的培养将四环素产生菌(Streptomyces aureofaciens)斜面孢子制成孢子悬浮液,接种于菌丝体培养基中，接种量不低于IO6个/ml，30°C条件下震荡培养26小时，获得菌丝体培养液，显微镜镜检菌丝呈网状，离心(3500转/分，10分钟)弃去上清液，获得菌丝体。
其中四环素斜面孢子的菌种来源于中国微生物菌种总目录，菌株保藏编号CPCC220020。菌丝体培养基由蒸馏水配制而成，以IOOml菌丝体培养基总体积计，其含有以下组分葡萄糖lg，蛋白胨0. 4g，酵母膏0. 4g，磷酸氢二钾0. 4g，磷酸二氢钾0. 2g，硫酸镁
0.058，甘氨酸化。灭菌条件121°C，30分钟。b、原生质体的制备将a步骤所得菌丝体用10. 3%蔗糖稳定液离心(3500转/分，10分钟)洗涤3次，加入溶菌酶溶液，使反应容器(试管)中溶菌酶的作用浓度为4mg/ml，置于35°C恒温水浴箱中进行酶解，每10分钟震荡一次，酶解2小时，镜检原生质体释放量达IO6个/ml以上，将反应容器(试管)从水浴箱中取出，终止酶解。酶解液经离心(转速500转/分，时间3分钟)去除沉淀，上清液再进行离心(转速5000转/分，时间15分钟)获得原生质体。C、将原生质体用稳定液离心洗涤3次(稳定液加至离心管IOml处，3500转/分，离心10分钟),加入5ml稳定液制成原生质体悬浮液，采用紫外线照射30秒钟(30瓦紫外灯，照射距离42cm)进行诱变处理，促进其发生突变。d、处理后的原生质体悬浮液用稳定液进行稀释，经夹层法培养于再生培养基上，34-35°C培养5-6天，形成再生菌落，再生菌落直径2-5_，馒头形或草帽型，外观鼠灰色，孢子丰厚，孢子丝初旋至松敞螺旋形，孢子卵圆形，表面光滑，适于传代。其中再生培养基由体积比为 1:1的蒸馏水和饮用水配制而成，以IOOml再生培养基总体积计，其中含有以下组分面粉2g，蛋白胨0. 05g，磷酸二氢钾0. 08g，碳酸钙0. lg，蔗糖2g，琼脂2.2g。灭菌条件121°C，30分钟。实施例3a、菌丝体的培养将四环素产生菌(Streptomyces aureofaciens)斜面孢子制成孢子悬浮液,接种于菌丝体培养基中，接种量不低于IO6个/ml，30°C条件下震荡培养26小时，获得菌丝体培养液，显微镜镜检菌丝呈网状，离心(3500转/分，10分钟)弃去上清液，获得菌丝体。其中四环素斜面孢子的菌种来源于中国微生物菌种总目录，菌株保藏编号CPCC220020。菌丝体培养基由蒸馏水配制而成，以IOOml菌丝体培养基总体积计，其含有以下组分葡萄糖lg，蛋白胨0. 4g，酵母膏0. 4g，磷酸氢二钾0. 4g，磷酸二氢钾0. 2g，硫酸镁
0.058，甘氨酸化。灭菌条件121°C，30分钟。b、原生质体的制备将a步骤所得菌丝体用10. 3%蔗糖稳定液离心(3500转/分，10分钟)洗涤3次，加入溶菌酶溶液，使反应容器(试管)中溶菌酶的作用浓度为4mg/ml，置于35°C恒温水浴箱中进行酶解，每10分钟震荡一次，酶解2小时，镜检原生质体释放量达IO6个/ml以上，将反应容器(试管)从水浴箱中取出，终止酶解。酶解液经离心(转速500转/分，时间3分钟)去除沉淀，上清液再进行离心(转速5000转/分，时间15分钟)获得原生质体。C、将原生质体用稳定液离心洗涤3次(稳定液加至离心管IOml处，3500转/分，离心10分钟)，加入5ml稳定液制成原生质体悬浮液，经化学诱变剂乙烯亚胺(EI)在IOOOug/ml条件下，进行50-100分钟诱变处理，促进其发生突变。
d、处理后的原生质体悬浮液用稳定液进行稀释，经夹层法培养于再生培养基上，34-35°C培养5-6天，形成再生菌落，再生菌落直径2-5_，馒头形或草帽型，外观鼠灰色，孢子丰厚，孢子丝初旋至松敞螺旋形，孢子卵圆形，表面光滑，适于传代。其中再生培养基 由体积比为1:1的蒸馏水和饮用水配制而成，以IOOml再生培养基总体积计，其中含有以下组分面粉2g，蛋白胨0. 05g，磷酸二氢钾0. 08g，碳酸钙0. lg，蔗糖2g，琼脂2.2g。灭菌条件121°C，30分钟。
权利要求
1.一种四环素产生菌原生质体的制备与再生方法，其特征在于它包括如下步骤 a、制备四环素斜面培养基称取小麦麸皮3.0-3. 5g，硫酸镁0. 004-0. 006g，磷酸氢二钾 0. 01-0. 12g，磷酸氢二铵 0. 013-0. 015g，琼脂粉1. 3-1. 5g，加蒸馏水至 100ml ；120-124°C条件下湿热灭菌30分钟；斜面培养基装量60ml/茄子瓶； b、制备孢子悬浮液将四环素产生菌接种于斜面培养基上，于33-36°C条件下培养96小时左右，长出斜面孢子；在无菌条件下加入无菌蒸馏水或菌丝体培养基制成孢子悬浮液，使孢子悬浮液浓度在IXlO8Ail以上； C、制备菌丝体培养基称取葡萄糖0. 8-1. 2g,蛋白胨0. 3-0. 5g,酵母膏0. 3-0. 5g,磷酸二氢钾0. 1-0. 2g，硫酸镁0. 03-0. 05g,磷酸氢二钾0. 3-0. 4g，甘氨酸0. 2_lg，加水至IOOml ；120-124 °C条件下湿热灭菌30分钟； d、制备再生培养基称取面粉2-4g，蛋白胨0.3-0. 5g，磷酸二氢钾0. 05-0. 10g，碳酸钙0.1-0. 4g，蔗糖o-llg，琼脂1. 5-2. 5g加水至100ml ;120_124°C条件下湿热灭菌30分钟后制成平板培养基； e、培养菌丝体 将四环素孢子悬浮液接种于c步骤所述菌丝体培养基中，在27°C _33°C条件下，震荡培养22-32小时，离心弃去上清液，得到菌丝体； f、酶解细胞壁 将e步骤所得菌丝体加入稳定液，离心洗涤2-4次，加入溶菌酶溶液，使溶菌酶作用浓度为2mg/ml-6mg/ml，30°C _37°C酶解1-3小时，得到酶解液； S、分尚原生质体 酶解液经离心去除沉淀，然后再将上清液离心，获得原生质体； h、原生质体再生 将g步骤所得的原生质体用稳定液离心洗涤2-4次后，加入稳定液制成原生质体悬浮液，原生质体悬浮液用稳定液稀释，采用夹层法培养于再生培养基上，于33°C _36°C条件下培养5-7天，形成再生菌落。
2.根据权利要求1所述的四环素产生菌原生质体的制备与再生方法，其特征在于所述稳定液是质量比浓度为10-11%的蔗糖溶液。
3.根据权利要求1所述的四环素产生菌原生质体制备与再生的方法，其特征在于所述获得的原生体，经过紫外线照射30秒至2分钟。
4.根据权利要求1所述的四环素产生菌原生质体制备与再生的方法，其特征在于所述获得的原生体，经过乙烯亚胺在1000ug/ml条件下,处理50-100分钟。
全文摘要
本发明的目的就是提供一种四环素产生菌原生质体的制备、再生方法。它包括如下步骤a、制备四环素斜面培养基；b、制备孢子悬浮液；c、制备菌丝体培养基；d、制备再生培养基；e、培养菌丝体；f、酶解细胞壁；g、分离原生质体；h、原生质体再生。本发明提供的四环素菌种选育的新方法，解决了四环素原生质体菌落无法再生和产孢子能力低、不能传代的问题。
文档编号C12R1/485GK103060235SQ201210592699
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月29日 优先权日2012年12月29日
发明者张彩霞, 张曦 申请人:华北制药股份有限公司