专利名称：检测y染色体微缺失的实时荧光定量pcr试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种检测Y染色体微缺失的试剂盒。
背景技术：
据统计，全世界有15 %的夫妇患有不育(孕)症，其中50 %以上由男方所致。近年来研究表明30%以上的男性不育是由于遗传因素引起的生精障碍，通常表现为男性Y染色体长臂(q臂)11区上无精因子基因家族(Azoospermiafactor, AZF)多个位点的缺失突变，其中任何一个座位的微缺失都可导致生精障碍，而对于因Y染色体微缺失引起的男性不育是无法治疗的。在胞质内单精子注射(ICSI)技术辅助生育治疗前检测Y染色体微缺失可以为临床治疗提供指导，减少不必要的经济浪费。目前欧洲、美国及我国相关学会已经建议将检测Y染色体微缺失列为男性不育的筛查项目。目前检测基因微缺失的方法很多，最常用的PCR-RFLP法，另外还有反向点杂交法、等位基因特异性聚合酶链反应、直接测序法等。后者是所有方法的金标准，但由于其费用昂贵，未广泛使用。而PCR-RFLP法虽然费用较低，操作简单，但特异性和敏感性都不太理想，其检测通量小，对于样本量较大的临床检测不适用。
实用新型内容本实用新型提供一种能够有效减少时间和成本的用于检测Y染色体微缺失的试剂盒。本实用新型提供一种用于检测Y染色体微缺失的实时荧光PCR试剂盒，包括盒体、衬垫、装有PCR反应液的第一容器及装有引物探针组合的至少一个第二容器，所述衬垫具有多个容器孔，所述第一容器置于与其对应的所述容器孔，所述第二容器置于与其对应的所述容器孔，所述第二容器包括装有检测SY84位点的SY84引物探针组合的第二容器、装有检测SY86位点的SY86引物探针组合的第二容器、装有检测SY127位点的SY127引物探针组合的第二容器、装有检测SY134位点的SY134引物探针组合的第二容器、装有检测SY254位点的SY254引物探针组合的第二容器及装有检测SY255位点的SY255引物探针组合的第二容器中的一个或多个。所述检测Y染色体微缺失的实时荧光PCR试剂盒，还包括装有检测男性性别决定基因SRY的SRY引物探针组合的第三容器，所述第三容器置于与其对应的所述容器孔。所述第二容器包括装有检测SY84位点的SY84引物探针组合的第二容器、装有检测SY86位点的SY86引物探针组合的第二容器、装有检测SY127位点的SY127引物探针组合的第二容器、装有检测SY134位点的SY134引物探针组合的第二容器、装有检测SY254位点的SY254引物探针组合的第二容器及装有检测SY255位点的SY255引物探针组合的第二容器中的多个。。所述第二容器包括装有检测SY 84位点的SY84引物探针组合的第二容器、装有检测SY86位点的SY86引物探针组合的第二容器、装有检测SY127位点的SY127引物探针组合的第二容器、装有检测SY134位点的SY134引物探针组合的第二容器、装有检测SY254位点的SY254引物探针组合的第二容器及装有检测SY255位点的SY255引物探针组合的第二容器。所述检测Y染色体微缺失的实时荧光PCR试剂盒，还包括装有阳性对照品的第四容器和装有阴性对照品的第五容器，所述第四容器和第五容器分别置于与其对应的所述容器孔。所述SY84、SY86、SY127、SY134、SY254及SY255引物探针组合均包括上游引物、下游引物及Taqman荧光探针。不同的引物探针组合用于检测Y染色体AZF区域的不同位点，可以根据需要选择检测其中的一个或多个位点，对应的，选择与该位点对应的引物探针组合。Y染色体的AZF区域由AZFa区域、AZFb区域和AZFc区域组成。所述试剂盒还包括用于检测男性性别决定基因SRY的SRY引物探针组合，所述SRY引物探针组合包括上游引物、下游引物及Taqman荧光探针。SRY引物探针组合用于质控，其可以根据检测要求选择采用或不采用。所述引物探针组合由SY84、SY86、SY127、SY134、SY254、和SY255引物探针组合组成，所述引物之间Tm值相差波动于2-4°C，所述探针之间Tm值相差波动于2_4°C，引物探针之间Tm值相差为10°C左右。引物包括针对各位点的引物和针对基因SRY的引物。探针包括针对各位点的探针和针对基因SRY的探针。所述PCR反应液还包括含MgCl、KCl、Tris的10倍缓冲液(10*Buffer)、含dATP、dCTP、dGTP、dUTP 的 dNTP 及 rTaq 酶。其中，MgCl浓度为1. 5mM, KCl 浓度为 60mM、Tris 浓度为 12mM。其中，dNTP浓度为 0. 2mM。其中，合成引物浓度为300uM、探针浓度为100uM。一种用于检测Y染色体微缺失的方法，包括如下步骤a)从人抗凝血中提取基因组DNA ；b)以所述基因组DNA试样为模板，利用权利要求7所述的SY84、SY86、SY127、SY134、SY254和SY255引物探针组合进行PCR扩增及检测；c)根据探针荧光标记选择对应探针检测通道的颜色；d)根据扩增曲线颜色及曲线有无判断对应Y染色体的AZF区域是否存在缺失。其中，该方法采用四重荧光定量PCR分两管对Y染色体3个区域6个位点进行检测。本实用新型的有益效果是利用该试剂盒，可以在反应液中特异且高效地检测Y染色体的AZF区域的多个位点是否缺失，从而能够有效减少时间和成本。
图1是本实施方式试剂盒的结构示意图；图2-11是表明本实施方式检测结果的荧光扩增曲线图，其中，图2的4条曲线分别表示SRY、SY84、SY127和SY254位点的扩增曲线；[0031]图3的4条曲线分别表示SRY、SY134、SY255和SY86位点的扩增曲线；图4的3条曲线分别表示SRY、SY127和SY254位点的扩增曲线；图5的3条曲线分别表示SRY、SY134和SY255位点的扩增曲线；图6的3条曲线分别表示SRY、SY84和SY254位点的扩增曲线；图7的4条曲线分别表示SRY、SY86、SY134和SY255位点的扩增曲线；图8的3条曲线分别表示SRY、SY86和SY255位点的扩增曲线；图9的4条曲线分别表示SRY、SY84、SY127和SY254位点的扩增曲线；图10的3条曲线分别表示SRY、SY84和SY127位点的扩增曲线；图11的3条曲线分别表示SRY、SY86和SY134位点的扩增曲线。
具体实施方式
本实用新型运用四重荧光定量PCR分两管对Y染色体AZFa区域的SY84位点和SY86位点、对AZFb区域的SY127位点和SY134位点、对AZFc区域SY254位点和SY255位点进行检测，同时检测男性性别决定基因SRY作为质控，以正常已育男性DNA样本作为阳性对照，女性DNA样本作为阴性对照，灭菌水作为空白对照防止检验体系被污染。如图1所示，本实施方式检测Y染色体微缺失的实时荧光PCR试剂盒，包括盒体1、衬垫2、装有PCR反应液的第一容器4及装有引物探针组合的至少一个第二容器3，所述衬垫2具有多个容器孔，所述第一容器4置于与其对应的所述容器孔，所述第二容器3置于与其对应的所述容器孔，所述第二容器3包括装有检测SY84位点的SY84引物探针组合的第二容器、装有检测SY86位点的SY86引物探针组合的第二容器、装有检测SY127位点的SY127引物探针组合的第二容器、装有检测SY134位点的SY134引物探针组合的第二容器、装有检测SY254位点的SY254引物探针组合的第二容器及装有检测SY255位点的SY255引物探针组合的第二容器中的一个或多个。该试剂盒还可以包括装有检测男性性别决定基因SRY的SRY引物探针组合的第三容器5，所述第三容器5置于与其对应的所述容器孔。用于检测Y染色体AZFa区域SY84位点的引物探针组合定义为SY84引物探针组合，其包括上游引物、下游引物及Taqman荧光探针，荧光探针以FAM、HEX、CY5、ROX之一标记5’端，其荧光标记与SY86位点相同，但与AZFb、AZFc区域四对探针及SRY探针各不相同。上述SY84位点的探针、上、下游弓I物可随机组合。用于检测Y染色体AZFa区域SY86位点的引物探针组合定义为SY86引物探针组合，其包括上游引物、下游引物及Taqman荧光探针，荧光探针以FAM、HEX、CY5、ROX之一标记5’端，其荧光标记与SY84位点相同，但与AZFb、AZFc区域四对探针及SRY探针各不相同。上述SY86位点的探针、上、下游弓I物可随机组合。用于检测Y染色体AZFb区域SY127位点的引物探针组合定义为SY127引物探针组合，其包括上游引物、下游引物及Taqman荧光探针，荧光探针以FAM、HEX、CY5、ROX之一标记5’端，其荧光标记与SY134位点相同，但与AZFa、AZFc区域四对探针及SRY探针各不相同。上述SY127位点的探针、上、下游引物可随机组合。用于检测Y染色体AZFb区域SY134位点的引物探针组合定义为SY134引物探针组合，其包括上游引物、下游引物及Taqman探针，荧光探针以FAM、HEX、CY5、ROX之一标记5’端，其荧光标记与SY127位点相同，但与AZFa、AZFc区域四对探针及SRY探针各不相同。上述SY134位点的探针、上、下游引物可随机组合。用于检测Y染色体AZFc区域SY254位点的引物探针组合定义为SY254引物探针组合，其包括上游引物、下游引物及Taqman荧光探针，荧光探针以FAM、HEX、CY5、ROX之一标记5’端，其荧光标记与SY255位点相同，但与AZFa、AZFb区域四对探针及SRY探针各不相同。上述SY254位点的探针、上、下游弓I物可随机组合。用于检测Y染色体AZFc区域SY255位点的引物探针组合定义为SY255引物探针组合，其包括上游引物、下游引物及Taqman荧光探针，荧光探针以FAM、HEX、CY5、ROX之一标记5’端，其荧光标记与SY254位点相同，但与AZ Fa、AZFb区域四对探针及SRY探针各不相同。上述SY255位点的探针、上、下游弓I物可随机组合。用于检测男性性别决定基因SRY的引物探针组合定义为SRY引物探针组合，其包括上游引物、下游引物及Taqman荧光探针，荧光探针以FAM、HEX、CY5、ROX之一标记5’端，其荧光标记与AZFa、AZFb、AZFc区域6对探针各不相同。上述基因SRY的探针、上、下游引物可随机组合。上述SY84、SY86引物探针组合用于特异性检测Y染色体的AZFa区域是否存在缺失。上述SY127、SY134引物探针组合用于特异性检测Y染色体的AZFb区域是否存在缺失。上述SY254、SY255引物探针组合用于特异性检测Y染色体的AZFc区域是否存在缺失。上述SRY引物探这组合用于质控，检测PCR过程是否正常。上述所有序列可由其碱基互补序列替换。本实施方式用于检测男性Y染色体微缺失的试剂盒还包括PCR扩增所需试剂IO^Buffer (含镁离子的缓冲溶液)、dNTP (含 dATP、dCTP、dGTP、dUTP)、rTaq 酶。用于检测Y染色体微缺失的试剂盒，IO^Buffer中MgCl浓度为1. 5mM,KCl浓度为60mM、Tris 浓度为 12mM。用于检测Y染色体微缺失的试剂盒，dNTP浓度为0. 2mM。所有合成引物浓度为300uM，探针浓度为100uM。所述引物之间Tm (melting temperature,寡核苷酸的解链温度)值相差波动于2-4°C，探针之间Tm值相差波动于2-4°C，引物探针之间Tm值相差为10°C左右。一种用于检测Y染色体微缺失的基因检测方法，包括以下步骤a)从人抗凝血中提取基因组DNA ；b)以步骤a所得人基因组DNA试样为模板，利用上述的各引物探针组合对Y染色体的AZF区域及SRY进行特异性PCR检测；c)设定PCR反应条件，根据探针荧光标记选择对应探针检测通道的颜色；d)根据扩增曲线颜色及曲线有无判断对应AZF区域6个位点否存在缺失。PCR 反应条件为94°C 2min ；94°C 5S，52°C 45S，60°C 45S，此过程进行 40 个循环。本实施方式设计了 6组探针对特异性的检测Y染色体AZFa、AZFb、AZFc区域微缺失，I组男性性别决定基因探针对进行质控，另6组探针对分属到两个PCR反应中，同一条件下进行PCR，女性DNA样本为阴性对照，灭菌水为空白对照以防止检验体系受污染。实施例1一、材料1.仪器实时荧光定量仪探针、引物设计以上述设计了 6对探针、弓丨物对特异性的检测AZF序列，并同时设计I对探针、引物作为质控，检测男性性别决定基因，以检测PCR检测过程是否正常进行，以正常已育男性DNA样本作为阳性对照，女性DNA样本作为阴性对照，灭菌水作为空白对照防止检验体系被污染。2.使用下述探针引物对检测AZFa、AZFb、AZFc区域位点缺失。SY84 上游引物 5’ -CCTAITTGITTTAAGGTGCCAITCC-3’SY84 下游引物 5’ -GCTTGCCTGAGCATCCTACAG-3’SY84 探针5’ -VIC-CTCTACCTCCTTCCCCCAGTGCCCA-BHQ-3’SY86 上游引物 5’-GGCTTCCCAGAGTTGTTACAAAG-3’SY86 下游引物 5’-CTCAAGGACTGTGAGAATCAAGGTT-3’SY86 探针 5，-VIC-AATCCCAAAGACTGGGCCCCTTAAACA-BHQ-3’SY127 上游引物 5’-GGCTCACAAACGAAAAGAAAAAG-3’SY127 下游引物 5’-CTTTTTGTGGGCATGAACACA-3’SY127 探针 5，-FAM-TAGCACCCACTGGAATCTACCAAAGCCC-BHQ-3’SY134 上游引物 5’-GACTCACTATAGGGCGAAITGG-3’SY134 下游引物 5，-GGTGAGGCAGACAGTTTTGTAG-3’SY134 探针 5，-FAM-TACGGGCCCCCCCTCGAG-BHQ-3’SY254 上游引物 5’-AAGGCAAAATCGTGCCAAAC-3’SY254 下游引物 5’-CCATTGTTCATGATGTATGTTAAGGTAA-3’SY254 探针5’-CTGTTTTTGTTGGTGGAATTGATGCTAGGG-BHQ-3’SY255 上游引物 5，-GTTACAGGAITCGGCGTGAT-3，SY255 下游引物 5，-CTCGTCATGTGCAGCCAC-3，SY255 探针 5，-R0X-TAGGTTTCAGTGTTTGGATTCCGCCA-BHQ-3’SRY 上游引物 5’-nTTCGGCTTCAGTAAGCAnTT-3’SRY下游引物5’-AATCCCAGAATGCGAAACTCA-3’SRY 探针5，CY5-CACTGGTATCCCAGCTGCTTGCTGATC-BHQ-3’3. PCR 反应试剂10*Buffer (含镁离子)、dNTP (含 dATP、dCTP、dGTP、dUTP)、rTaq酶。二、方法1.基因组DNA提取购买试剂盒或按常规分子生物学方法提取基因组DNA。分别提取I例正常男性基因组DNA、4例非正常男性基因组DNA及I例女性基因组DNA。2.荧光定量PCR检测[0100]PCR反应前将试剂放于冰上自然溶解，取PCR管并做好标记，分别加入灭菌水、10*Buffer、dNTP、rTaq酶、待检测DNA样本，每个样本同时进行2个PCR检测，即PCR反应液A 22. 5 u 1+待检测样本DNA2. 5 u I,PCR反应液B22. 5 U 1+同一待检测样本DNA2. 5u I,PCR反应体系见表2。每次检测均设立阳性对照(正常男性基因组DNA)及阴性对照(女性基因组DNA )，灭菌水空白对照。表IPCR反应体系
权利要求1.一种检测Y染色体微缺失的实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，包括盒体、衬垫、装有 PCR反应液的第一容器及装有引物探针组合的至少一个第二容器，所述衬垫具有多个容器孔，所述第一容器置于与其对应的所述容器孔，所述第二容器置于与其对应的所述容器孔， 所述第二容器包括装有检测SY84位点的SY84引物探针组合的第二容器、装有检测SY86位点的SY86引物探针组合的第二容器、装有检测SY127位点的SY127引物探针组合的第二容器、装有检测SY134位点的SY134引物探针组合的第二容器、装有检测SY254位点的SY254 引物探针组合的第二容器及装有检测SY255位点的SY255引物探针组合的第二容器中的一个或多个。
2.如权利要求1所述的检测Y染色体微缺失的实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，还包括装有检测男性性别决定基因SRY的SRY引物探针组合的第三容器，所述第三容器置于与其对应的所述容器孔。
3.如权利要求2所述的检测Y染色体微缺失的实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述第二容器包括装有检测SY84位点的SY84引物探针组合的第二容器、装有检测SY86位点的 SY86引物探针组合的第二容器、装有检测SY127位点的SY127引物探针组合的第二容器、装有检测SY134位点的SY134引物探针组合的第二容器、装有检测SY254位点的SY254引物探针组合的第二容器及装有检测SY255位点的SY255引物探针组合的第二容器中的多个。。
4.如权利要求3所述的检测Y染色体微缺失的实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述第二容器包括装有检测SY84位点的SY84引物探针组合的第二容器、装有检测SY86位点的 SY86引物探针组合的第二容器、装有检测SY127位点的SY127引物探针组合的第二容器、装有检测SY134位点的SY134引物探针组合的第二容器、装有检测SY254位点的SY254引物探针组合的第二容器及装有检测SY255位点的SY255引物探针组合的第二容器。
5.如权利要求1-4中任意一项所述的检测Y染色体微缺失的实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，还包括装有阳性对照品的第四容器和装有阴性对照品的第五容器，所述第四容器和第五容器分别置于与其对应的所述容器孔。
专利摘要本实用新型公开了一种检测Y染色体微缺失的实时荧光定量PCR试剂盒，包括盒体、PCR反应液及设于所述盒体的至少一个引物探针组合，所述引物探针组合由用于检测SY84位点的SY84引物探针组合、用于检测SY86位点的SY86引物探针组合、用于检测SY127位点的SY127引物探针组合、用于检测SY134位点的SY134引物探针组合、用于检测SY254位点的SY254引物探针组合及用于检测SY255位点的SY255引物探针组合中之一或多个组成。利用该试剂盒，可以在反应液中特异且高效地检测Y染色体的AZF区域的多个位点是否缺失，从而能够有效减少时间和成本。
文档编号C12M1/34GK202830036SQ2012204476
公开日2013年3月27日 申请日期2012年9月4日 优先权日2012年9月4日
发明者骆子义, 邬宇美 申请人:骆子义, 邬宇美