专利名称：用实时荧光定量pcr检测nat2基因多态性的试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种用于检测基因多态性的试剂盒。
背景技术：
结核病是严重危害人类健康的慢性传染病。近10余年来，由于艾滋病的流行、移民和流动人口的增加、多种耐药结核菌的增多，以及不少国家和地区对结核病控制的忽视等因素，全球结核病形势急剧恶化，无论发达国家或发展中国家，结核病病人数都在增加。在世界卫生组织推荐的标准抗结核化疗方案中，异烟肼、利福平、吡嗪酰胺是不可替代的一线抗结核药，这些药物对肝脏有一定毒性。药物性肝损害是抗结核药物最常见的毒副作用之一，也是结核患者停止化疗的最常见原因之一。抗结核药物性肝损害尤其是异烟肼所致肝损害已屡见不鲜，重症肝炎的亦不少见，甚至产生致命后果。对于出现药物性肝损害的结核患者是选择继续治疗还是停用抗结核药是个两难选择。异烟肼在肝内通过N-乙酰化酶代谢为乙酰化异烟肼及毒性较强的乙酰肼和异烟酸，导致肝细胞变性和坏死；代谢过程中生成低分子自由基，也可诱导脂质过氧化反应，引起药物性肝炎。大量研究表明慢乙酰化型患者使用异烟肼时更容易出现较重肝损害。因此检测NAT2基因，对其进行分型不仅可以预测结核患者发生肝损害的风险，同时可以为个体化药物治疗提供指导。目前检测基因多态性的方法很多，最常用的PCR-RFLP法，另外还有反向点杂交法、等位基因特异性聚合酶链反应、直接测序法等。后者是所有方法的金标准，但由于其费用昂贵，未广泛使用。而PCR-RFLP法虽然费用较低，操作简单，但特异性和敏感性都不太理想，且检测时间较长。
实用新型内容本实用新型提供一种能够有效减少时间和成本的用于检测NAT2基因多态性的试剂盒。本实用新型提供一种用实时荧光定量PCR检测NAT2基因多态性的试剂盒，包括盒体、衬垫、装有PCR反应液的第一容器及装有检测NAT2基因碱基突变的探针的至少一个第二容器，所述衬垫具有多个容器孔，所述第一容器置于与其对应的所述容器孔，所述第二容器置于与其对应的所述容器孔，所述第二容器包括装有检测NAT2基因的第341位碱基突变的341探针的第二容器、装有检测NAT2基因的第481位碱基突变的481探针的第二容器、装有检测NAT2基因的第590位碱基突变的590探针的第二容器和装有检测NAT2基因的第857位碱基突变的857探针的第二容器中的一个或多个。进一步的，所述第二容器包括装有检测NAT2基因的第341位碱基突变的341探针的第二容器、装有检测NAT2基因的第481位碱基突变的481探针的第二容器、装有检测NAT2基因的第590位碱基突变的590探针的第二容器和装有检测NAT2基因的第857位碱基突变的857探针的第二容器中的多个。[0008]进一步的，所述第二容器包括装有检测NAT2基因的第341位碱基突变的341探针的第二容器及装有检测NAT2基因的第857位碱基突变的857探针的第二容器中的多个。进一步的，所述第二容器包括装有检测NAT2基因的第481位碱基突变的481探针的第二容器及装有检测NAT2基因的第590位碱基突变的590探针的第二容器。所述341、481、590、857探针均包括上游引物、下游引物、野生型探针及突变型探针。所述探针组由341、481、590和857探针中的多个组成。所述探针组由341探针和857探针组成。所述探针组由481探针和590探针组成。检测时，用实时荧光定量PCR法检测NAT2基因的试剂盒，其含有上述本实用新型的NAT2基因检测用探针组。检测时，用实时荧光定量PCR法检测NAT2基因的多态性方法，包含下述(a)工序:以试样中的DNA为模板，使用本实用新型的NAT2基因检测用探针对，在反应液中检测上述NAT2基因的工序。一种多态性解析方法，其为解析NAT2中4个检测突变位点的多态性方法，包括下述㈧ ⑶工序:(A)利用本实用新型的基因检测的制造方法，在反应液中检测NAT2基因中的含有检测对象位点的区域的工序；(B)准备含有上述(I )工序的试样模板和能够与上述检测对象位点杂交的探针的反应液的工序；(C)改变上述反应液中各成分的浓度、退火温度，检测上述试样模板的扩增曲线荧光信号的工序；(D)随扩增循环增多，荧光强度不断累积，确定上述检测对象位点多态性的工序。本实用新型的有益效果是:利用该试剂盒，可以在反应液中特异且高效地检测NAT2基因中的、含有检测目标多态性(NAT2*5、NAT2*6、NAT2*7、NAT2*11)发生位点的目标区域，从而能够有效减少时间和成本。
图1是本实施方式的结构示意图；图2、是本实施方式试剂盒对试样f 4的检测结果的图片。
具体实施方式
下面通过具体实施方式
结合附图对本实用新型作进一步详细说明。如图1所示，本实施方式试剂盒包括盒体1、衬垫2、装有PCR反应液的第一容器4及装有检测NAT2基因碱基突变的探针的至少一个第二容器3，所述衬垫2具有多个容器孔，所述第一容器4置于与其对应的所述容器孔，所述第二容器3置于与其对应的所述容器孔，所述第二容器3包括装有检测NAT2基因的第341位碱基突变的341探针的第二容器、装有检测NAT2基因的第481位碱基突变的481探针的第二容器、装有检测NAT2基因的第590位碱基突变的590探针的第二容器和装有检测NAT2基因的第857位碱基突变的857探针的第二容器中的一个或多个。本实施方式用于检测NAT2基因多态性的试剂盒包括基因扩增用探针组，含有选自由探针对(1)-(4)所组成的组中的至少一对探针对，为还可以选择任两种探针。在后叙述，探针对(I )能检测NAT2*5位点突变，探针对(II)能检测NAT2*11位点突变，探针对(III)能检测NAT2*6位点突变，探针对(IV)能检测NAT2*7位点突变。如上所述，已知NAT2基因编码N-乙酰转移酶，后者是人体内重要的II相代谢酶，可催化芳香胺类和杂环胺类物质的乙酰化过程，在一些药物代谢以及致癌物质的灭活或活化过程中起重要作用。检测NT2基因多态性对指导临床药物治疗很有意义。目前检测基因多态性的方法很多，常用的有PCR-RFLP法、反向点杂交法、等位基因特异性聚合酶链反应和直接测序法等。直接测序法是所有方法的金标准，但由于费用昂贵，未广泛使用。PCR-RFLP法虽然费用较低，操作简单，但特异性和敏感性都不太理想，且检测通量小，影响因素多，对于样本量较大的研究不太适用。如何采用一种高效、特异、简便的方法对NAT2基因多态性进行检测非常重要。本实用新型采用荧光定量PCR方法结合Taqman探针可以高效、简便的对NAT2基因多态性进行分析。上述探针对(I )如上所述，为含有包含下述(Y I )野生型探针、(T I I)突变型探针、(F I )的寡核苷酸的上游引物、(R I )的寡核苷酸的下游引物的一组探针对。(Y I )野生型探针:与序列号I中的、以第1063位的胸腺嘧啶(T) (T341C)作为探针检测中心，向5 ‘端延伸第1056位鸟嘌呤碱基(G)，向3’端延伸至1068胞嘧啶碱基(C) 1070位鸟嘌呤碱基(G)的序列相同的至少一个寡核苷酸,该探针5 ‘端以突光报告基团标记，该荧光报告基团可选择CY5、ROX、FAM、HEX之一标记，3’端以TAMRA淬灭标记。(T I )突变型探针:与序列号I中的、以第1063位的突变碱基胞嘧啶碱基(C)(T341C)作为探针检测中心，向5 ‘端延伸第1056位鸟嘌呤碱基(G)，向3’端延伸至1068胞嘧啶碱基(C) 1070位鸟嘌呤碱基(G)的序列相同的至少一个寡核苷酸。该探针5 ‘端以荧光报告基团标记，该荧光报告基团可选择CY5、ROX、FAM、HEX之一标记，该标记与野生型探针不相同以区分，3’端以TAMRA淬灭标记。(F I )上游引物:与序列号I中的、以第1021位的胞嘧啶碱基(C)作为第一个碱基朝向5 ‘端延伸至第15 20个碱基区域序列相同的至少一个寡核苷酸，并以第1021位胞嘧啶碱基(C)作为3’末端。(R I )下游引物:与序列号I中的、以第1113位的腺嘌呤(A)作为第一碱基，朝向5 ‘端至第1100位的嘌呤(A) 第1095位的胸腺嘧啶(T)，朝向3 ‘端至第1116位胸腺嘧啶(T)区域互补的序列相同的至少一个寡核苷酸。序列号I的碱基序列是人类N-乙酰转移酶2基因的DNA序列，例如NCBI登录号:N0.D10870所登录的基因。序列号I (人NAT2基因序列从第841个-1740个碱基)TTAACATGCA TTGTGGGCAA GCCATGGAGT TGGGCTTAGA GGCTATTTTTGATCACATTG TAAGAAGAAA CCGGGGTGGG TGGTGTCTCCAGGTCAATCA ACTTCTGTAC TGGGCTCTGA CCACAATCGG TTTTCAGACCACAATGTTAG GAGGGTATTT TTATATCCCT CCAGTTAACA AATACAGCACTGGCATGGTT CACCTTCTCC TGCAGGTGAC CATTGACGGC AGGAATTACA[0040]TTGTCGATGC TGGGTCTGGA AGCTCCTCCC AGATGTGGCA GCCTCTAGAATTAATTTCTG GGAAGGATCA GCCTCAGGTG CCTTGCATTTTCTGCTTGAC AGAAGAGAGA G GAATCTGGT ACCTGGACCAAATCAGGGGA GAGCAGTATA TTACAAACAA AGAATTTCTTAATTCTCATC TCCTGCCAAA GAAGAAACAC CAAAAAATATACTTATTTACGCTTGAACCT CGAACAATTG AAGATTTTGAGTCTATGAAT ACATACCTGC AGACGTCTCC AACATCTTCATTTATAACCA CTTCATTTTG TTCCCTGCAG ACCCCAGAAGGGGTTTACTGTTTGGTGGGC TTCAT CCTCA CCTATAGAAAATTCAATTAT AAAGACAATA CAGATCTGGTCGAGTTTAAAACTCTCACTG AGGAAGAGGT TGAAGAAGTG CTGAAAAATATATTTAAGAT TTCCTTGGGG AGAAATCTCG TGCCCAAACCTGGTGATGGATCCCTTACTA TTTAGAATAA GGAACAAAATAAACCCTTGTGTATGTATCA CCCAACTCAC TAATTATCAACTTATGTGCT ATCAGATATC CTCTCTACCC TCACGTTATT TTGAAGAAAATCCTAAACAT CAAATACTTT CATCCATAAA AATGTCAGCA上述探针对(I )为用于检测序列号I中的第1063位碱基突变(T-C)，即NAT2*5，其相当于NAT2基因mRNA的第341位碱基，因此本实用新型中探针对(I )也称为341探针。探针对(I )的各引物和探针的序列如下:
权利要求1.一种用实时荧光定量PCR检测NAT2基因多态性的试剂盒，其特征在于:包括盒体、衬垫、装有PCR反应液的第一容器及装有检测NAT2基因碱基突变的探针的至少一个第二容器，所述衬垫具有多个容器孔，所述第一容器置于与其对应的所述容器孔，所述第二容器置于与其对应的所述容器孔，所述第二容器包括装有检测NAT2基因的第341位碱基突变的341探针的第二容器、装有检测NAT2基因的第481位碱基突变的481探针的第二容器、装有检测NAT2基因的第590位碱基突变的590探针的第二容器和装有检测NAT2基因的第857位碱基突变的857探针的第二容器中的一个或多个。
2.如权利要求1所述的用实时荧光定量PCR检测NAT2基因多态性的试剂盒，其特征在于:所述第二容器包括装有检测NAT2基因的第341位碱基突变的341探针的第二容器、装有检测NAT2基因的第481位碱基突变的481探针的第二容器、装有检测NAT2基因的第590位碱基突变的590探针的第二容器和装有检测NAT2基因的第857位碱基突变的857探针的第二容器中的多个。
3.如权利要求2所述的用实时荧光定量PCR检测NAT2基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述第二容器包括装有检测NAT2基因的第341位碱基突变的341探针的第二容器及装有检测NAT2基因的第857位碱基突变的857探针的第二容器中的多个。
4.如权利要求2所述的用实时荧光定量PCR检测NAT2基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述第二容器包括装有检测NAT2基因的第481位碱基突变的481探针的第二容器及装有检测NAT2基因的第590位碱基突变的590探针的第二容器。
专利摘要本实用新型公开了一种用实时荧光定量PCR检测NAT2基因多态性的试剂盒，包括反应液及探针组，所述探针组由341探针、481探针、590探针和857探针中的一个或多个组成，所述341、481、590、857探针均包括上游引物、下游引物、野生型探针及突变型探针。利用该试剂盒，可以在反应液中特异且高效地检测NAT2基因中的、含有检测目标多态性(NAT2*5、NAT2*6、NAT2*7、NAT2*11)发生位点的目标区域，从而能够有效减少时间和成本。
文档编号C12M1/34GK202968561SQ2012204473
公开日2013年6月5日 申请日期2012年9月4日 优先权日2012年5月3日
发明者骆子义, 邬宇美 申请人:骆子义, 邬宇美