木质纤维素水解产物作为原料用于异丁醇发酵的制作方法

木质纤维素水解产物作为原料用于异丁醇发酵的制作方法
【专利摘要】本发明一般涉及工业微生物和从诸如木质纤维素水解产物的5碳糖源生产丁醇的领域。更具体地，本发明涉及使用产生木酮糖或木酮糖-5-磷酸的酶和微氧或厌氧条件以增加来自此类糖的丁醇产量以及通过原位产物回收方法回收所述丁醇。
【专利说明】木质纤维素水解产物作为原料用于异丁醇发酵
[0001]以电子方式提交的序列表参考
[0002]与本申请一起提交的、以ASCII文本文件格式的电子方式提交的序列表内容(文件名:20120615_CL5194W0PCT_SeqList.txt，大小:1, 164，854 字节，并且创建日期为:2012年6月14日)全文以引用的方式并入本文。
【技术领域】
[0003]本发明一般涉及工业微生物学和丁醇生产领域。更具体地，本发明涉及使用微生物将5碳糖(包括木质纤维素生物质水解产物中的5碳糖)转化成丁醇以及在混合糖存在下从发酵中回收丁醇的方法。
【背景技术】
[0004]丁醇是一种重要的工业化学品，具有多种用途，包括用作燃料添加剂，在塑料工业中用作化学原料，以及在食品和食用香料工业中用作食品级的提取剂。因此，高度需求丁醇以及高效环保的生产方法。
[0005]利用微生物发酵生产丁醇是一种这样的环保生产方法。许多原料可用于此类发酵产物。在这些当中有木质纤维素生物质的水解产物，包括玉米棒、玉米秸杆、柳枝稷、甘蔗渣和木材废料。然而，木质纤维素水解产物还含有抑制用于发酵的微生物的生长和代谢，具体地，抑制能够产生丁醇的微生物的生长和代谢的化合物。
[0006]本发明通过提供有效将5碳糖转化成丁醇的方法以及在混合糖存在下从发酵中回收丁醇的方法，满足了当前对于来自此类木质纤维素水解产物的改善丁醇产量的需求，所述5碳糖获自木质纤维素水解产物。

【发明内容】

[0007]本发明一般涉及从5碳糖和6碳糖的混合来源生产丁醇的方法和组合物，所述来源诸如木质纤维素水解产物，以及采用原位产物回收方法的来自所述糖的改善丁醇产量。更具体地，本发明涉及使用产生木酮糖或木酮糖-5-磷酸的酶和微氧或厌氧条件以增加丁
醇产量。
[0008]在一些实施例中，生产丁醇的方法包括:(a)提供组合物，其包含(i)能够产生丁醇的微生物和(ii)能够将5碳糖转化成木酮糖或木酮糖-5-磷酸的酶或酶的组合；(b)使所述组合物与包含混合糖的碳底物接触；以及(c)在限制氧气利用的条件下培养微生物，从而产生丁醇。
【专利附图】

【附图说明】
[0009]从下文的【具体实施方式】、附图和附带的序列描述中可较充分地理解本发明的多个实施例，它们形成本专利申请的一部分。
[0010]图1:在玉米棒水解产物中的生长。按照生产商的指令(TPP, Trasadingen,Switzerland)使用PCV管通过细胞压积监测生长。显示了重复三次烧瓶的结果。使产异丁醇生物(PNY1504，虚线)生长于0.5倍的LCH中。使产乙醇生物(实线)生长于I倍LCH中。
[0011]图2:PNY1504的葡萄糖消耗以及异丁醇和甘油产量。测量结果超过148小时，并且采用HPLC (高效液相色谱)测定代谢物。
[0012]图3:CEN.PK113-7D的葡萄糖消耗以及乙醇和甘油产量。测量结果超过148小时，并且采用HPLC (高效液相色谱)测定代谢物。
[0013]图4:通过PNY1504的葡萄糖至异丁醇的发酵。显示了在抗霉素A存在(+AA ;实线)或不存在(-AA ;虚线)下葡萄糖消耗(Glc)、生长(生物质，通过细胞压积)、以及异丁醇产量(Iso)的特征图。
[0014]图5:木糖异构酶存在下PNY1504的木糖至异丁醇的发酵。显示了在抗霉素A存在(+AA ;实线)或不存在(-AA ;虚线)下木糖(Xyl)和木酮糖O(Is)浓度、生长(生物质，通过细胞压积)、以及异丁醇产量(Iso)的特征图。
[0015]图6:在发酵过程中木质纤维素水解产物中的葡萄糖和木糖转化成异丁醇的特征图。培养物经抗霉素A处理(实线)或未经处理(虚线)，并且补充了木糖异构酶(封闭符号)或未补充(开放符号)。
[0016]图7:在木质纤维素水解产物发酵过程中产生的异丁醇有效滴度。培养物经抗霉素A处理(实线)或未经处理(虚线)，并且补充了木糖异构酶(封闭符号)或未补充(开放符号)。
【具体实施方式】
[0017]除非另行定义，否则本文所用的所有科技术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的一样。如发生矛盾，以本申请(包括其定义)为准。除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，而复数术语应包括单数。为所有目的，所有的出版物、专利、以及本文提及的其它参考资料均全文以引用方式并入本文。
[0018]下文公开了合适的方法和材料，虽然在本发明的实施或试验过程中也可以使用与本文所公开的那些类似或等同的方法和材料。材料、方法和例子仅是例证性的并且不旨在进行限制。根据【具体实施方式】和权利要求，本发明的其他特点和优点将显而易见。
[0019]为了进一步明确本发明，提供下列术语、缩写和定义。
[0020]如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”或“含有”，或其任何其他变型旨在是非排他的或可广泛解释的。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，而可以包括其它未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的元素。此外，除非另外特别说明，否则“或”是指包含性的或，而不是指排它性的或。例如，以`下任何一个均表示满足条件A或B:A是真的(或存在的)且B是假的(或不存在的)、A是假的(或不存在的)且B是真的(或存在的)、以及A和B都是真的(或存在的)。
[0021]同样，在本发明的元素或组分前的不定冠词“一个”或“一种”旨在有关实例，即元件或组分出现的数量是非限制性的。因此，应将“一个”或“一种”理解为包括一个或至少一个，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示单数。[0022]如本文所用，术语“发明”或“本发明”是非限制性术语，并且不旨在意指本发明的任何单独实施例，而是涵盖如本专利申请所公开的所有可能的实施例。
[0023]如本文所用，修饰成分或采用反应物的量使用的术语“约”是指数量的变化，其可以通过，例如在真实世界中用于制备浓缩物或使用溶液的一般测量和液体处理操作；通过这些操作中非故意的误差；通过用于制备组合物或执行方法的成分的制造、来源或纯度中的差异；等而发生。术语“约”还包括由于产生自特定起始混合物的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求包括量的等同量。在一个实施例中，术语“约”指在报告数值10 %范围内，优选地在报告数值5 %范围内。
[0024]如本文所用的“生物质”是指包含可水解的多糖或碳水化合物的天然产物，其提供了可发酵糖，包括任何纤维素或木质纤维素材料，以及包含纤维素的材料，并任选地还包括半纤维素、木质素、淀粉、寡糖和/或单糖。生物质还可包含附加组分，诸如蛋白质和/或脂质。生物质能够来源于单一来源，或生物质可包括来源于一种以上来源的混合物。例如，生物质能够包括玉米棒和玉米秸杆的混合物，或草茎和叶片的混合物。生物质包括但不限于生物能作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸的淤渣、庭院垃圾、木材和林业垃圾。生物质的例子包括但不限于:玉米粒、玉米棒、农作物残余物如玉米壳、玉米秸杆、草、小麦、黑麦、小麦秸杆、大麦、大麦秸杆、干草、稻杆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱、大豆、从谷物的研磨中获得的组 分、树、枝、根、叶、木屑、锯末、灌木和灌丛、蔬菜、水果、花、动物粪肥、城市垃圾、以及它们的混合物。
[0025]如本文所用，“丁醇”是特指或以单独或其混合物形式的丁醇异构体1-丁醇(1-BuOH)、2_ 丁醇(2-BuOH)和 / 或叔异丁醇(t_BuOH)。
[0026]如本文所用，“可发酵碳源”意为来自能被本文所公开的微生物代谢的生物质的碳底物。合适的可发酵碳源包括但不限于单糖，诸如葡萄糖或果糖以及阿拉伯糖；二糖，诸如麦芽糖、乳糖或蔗糖；低聚糖；多糖如淀粉或纤维素；一碳底物；以及它们的混合物。
[0027]如本文所用，“原料”意为包含可发酵碳源的产物。合适的原料包括但不限于黑麦、小麦、玉米、甘蔗、秸杆、柳枝稷、甘蔗渣、以及它们的混合物。
[0028]如本文所用，“发酵液体培养基”是指水、糖(可发酵碳源)、液化固体、微生物产生的醇、产物醇及发酵容器内具有的所有其它物质组分的混合物，其中产物醇通过在微生物存在的情况下使糖反应生成醇、水和二氧化碳(CO2)而制得。有时，如本文所用，术语“发酵培养基”和“发酵混合物”可与“发酵液体培养基”同义使用。
[0029]术语“碳底物”是指来自能被本文所公开的微生物和细胞代谢的生物质的碳源。本文提供了非限制性的碳底物的例子，包括但不限于单糖、寡糖、多糖、乙醇、乳酸盐、琥珀酸盐、甘油、二氧化碳、甲醇、葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖、右旋糖、或它们的混合物。
[0030]如本文所用，术语“有效滴度”是指每升发酵培养基通过发酵产生的特定醇(例如丁醇)的总量。
[0031]如本文所用，术语“分离”与“回收”同义，是指从初始混合物中移除化合物以获得纯度或浓度比初始混合物中的化合物纯度或浓度更高的化合物。
[0032]如本文所用，术语“水相”是指通过使发酵液体培养基接触与水不混溶的有机提取剂而获得的两相混合物中的水相。在本文所述包括发酵提取的方法的一个实施例中，术语“发酵液体培养基”具体地指在双相发酵提取中的水相。[0033]如本文所用，术语“有机相”是指通过使发酵液体培养基接触与水不混溶的有机提取剂而获得的两相混合物中的非水相。
[0034]术语“多核苷酸”旨在涵盖单个核酸以及多个核酸，并且是指核酸分子或构建体例如信使RNA (mRNA)或质粒DNA (pDNA)。多核苷酸能够包含全长cDNA序列的核苷酸序列，或其片段，包括非翻译的5'和3'端序列和编码序列。所述多核苷酸能够由任何多核糖核酸或多脱氧核糖核酸组成，其可为非改性的RNA或DNA，或改性的RNA或DNA。例如，多核苷酸能够由单链和双链DNA构成，其为单链和双链区域的混合物；单链和双链RNA，其为单链和双链区域的混合物；包含DNA和RNA的杂合分子，其可为单链或，更典型地双链或单链和双链区域的混合物。“多核苷酸”包含了化学地、酶学地、或代谢地改性的形式。
[0035]多核苷酸序列可意为“分离的”，其中它从天然的环境中移除出来。例如，出于本发明的目的分离了异源多核苷酸，其编码具有酶活性(例如将底物转化成木酮糖的能力)的多肽或多肽片段。分离的多核苷酸的另一个例子包括异源宿主细胞拥有的重组多核苷酸或溶液中的纯化的(部分地或基本上)多核苷酸。根据本发明分离的多核苷酸或核酸还包括此类人工合成生产的分子。DNA聚合物形式的分离的多核苷酸片段可以由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个片段构成。
[0036]术语“基因”指能够被表达为特定蛋白质的核酸片段，其任选包括编码序列前的调节序列(5'非编码序列)和编码序列后的调节序列(3'非编码序列)。
[0037]如本文所用，术语“编码区”是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调控序列”是指位于编码序列上游(5'非编码序列)、中间、或下游(3'非编码序列)并影响相关联的编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译的核苷酸序列。调节序列可以包括启动子、翻译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。
[0038]如本文所用，术语“多肽`”旨在涵盖单个“多肽”以及多个“多肽”，并指由单体(氨基酸)通过酰胺键(也被称为肽键)线性连接组成的分子。术语“多肽”是指任何两个或更多个氨基酸的链，并且不涉及产物的特定长度。因此，“肽”、“二肽”、“三肽”、“寡肽”、“蛋白质”、“氨基酸链”、或其它任何用于指由两个或更多个氨基酸组成的一条链或多条链的术语，都包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可用于取代或与这些术语中任一项互换使用。多肽可来源于天然生物源或由重组技术产生，但不一定是由指定的核酸序列翻译的。它可由任何方式生成，包括通过化学合成方式。
[0039]以“分离的”多肽或片段形式的变体和其衍生物拟为不在其自然环境下的多肽。不需要特别的纯化水平。例如，分离的多肽能够从它原生的或天然的环境中去除。为了本发明的目的，在宿主细胞中重组产生的多肽和表达的蛋白质被认为是分离的，即为天然的或重组的多肽，其已通过任何适合的技术被分离、分馏、或部分地或充分地纯化。
[0040]如本文所用，“天然的”是指多核苷酸、基因或多肽的形式与天然存在的一样，带有其自身的调节序列(如果存在调节序列)。
[0041]如本文所用，“内源性”是指多核苷酸、基因或多肽在其在生物体中或生物体的基因组中的天然位置的天然形式。“内源性多核苷酸”包括在其在生物体的基因组中的天然位置的天然多核苷酸。“内源性基因”包括在其在生物体的基因组中的天然位置的天然基因。“内源性多肽”包括在其在生物体中的天然位置的天然多肽。[0042]如本文所用，“异源性”是指正常情况下不存在于宿主生物中，而是被导入宿主生物的多核苷酸、基因或多肽。“异源性多核苷酸”包括原生的编码区、或它们的一部分，即以不同于对应的原生多核苷酸的形式重新导入源生物体。“异源性基因”也包括原生的编码区、或它们的一部分，即以不同于对应的原生基因的形式重新导入源生物体。例如，异源性基因可包括被再引入至天然宿主的原生编码区，其为包括非天然的调控区的嵌合基因的一个部分。“异源性多肽”包括天然多肽，其以不同于对应的天然多肽的形式被重新导入源生物体。
[0043]如本文所用，术语“修饰”是指本文所公开的由所述多核苷酸编码的多肽活性改变导致的多核苷酸的变化，以及本文所公开的多肽活性改变导致的多肽的变化。此类改变能改通过本领域熟知的方法实现，包括但不限于缺失、突变(例如，自发诱变、随机诱变、由增变基因导致的诱变、或转座诱变)、取代、插入、改变细胞定位、改变多核苷酸或多肽的状态(例如，甲基化、磷酸化或泛素化)、移除辅因子、化学修饰、共价修饰、用UV或X-射线照射、同源重组、有丝分裂重组、启动子置换法、和/或它们的组合。通过将特定多核苷酸或多肽的序列与同源的多核苷酸或多肽(例如酵母或细菌的)的序列进行比较，并使高度同源区域(保守区域)或共有序列中进行的修饰的数量最大化，能够发现用以确定哪些核苷酸或氨基酸残基能够被修饰的指导。
[0044]如本文所用，术语“变体”是指利用例如重组DNA技术(诸如诱变)产生的，通过氨基酸的插入、缺失、突变和取代而 不同于本发明具体地列举的多肽的多肽。通过将特定多肽的序列与同源的多肽(例如酵母或细菌的)的序列进行比较，并使高度同源区域(保守区域)中进行的氨基酸序列改变的数量最小化，或通过用共有序列代替氨基酸，能够发现用以确定哪些氨基酸残基可以被替代、添加、或缺失而不会破坏所关注的活性的指导。
[0045]作为另外一种选择，编码这些相同或相似的多肽的重组多核苷酸变体可以被合成，或通过利用遗传密码中的“冗余”进行选择。各种密码子取代，如产生各种限制性位点的沉默变化，可引入以优化克隆到质粒表达载体或病毒表达载体。多核苷酸序列的突变可以反应在被添加至多肽，以改变所述多肽的任何部分的特性的其他肽的多肽或结构域之中。
[0046]氨基酸“取代”可为一个氨基酸替换为另一个具有相似结构和/或化学性质的氨基酸的结果，例如，保守的氨基酸替换，或可为一个氨基酸替换为另一个具有不同结构和/或化学性质的氨基酸的结果，例如，非保守的氨基酸替换。“保守的”氨基酸取代可以基于所涉及的残基在极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性、或两亲性性质方面的相似性实现。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性的中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；而带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。作为另外一种选择，“非保守的”氨基酸取代可以通过选择任何这些氨基酸在极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性、或两亲性性质方面的差异实现。“插入”或“缺失”可在重组蛋白质结构上或功能上耐受的变型范围之内。通过系统地利用重组DNA技术产生多肽分子中的氨基酸的插入、缺失、或取代，并检测所得重组变体的活性，可以以实验方法确定所允许的变型。
[0047]术语“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA转录的DNA序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3'端。启动子可整体源于天然基因，或者由源于天然存在的不同启动子的不同元件构成，或者甚至可包含合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的宿主细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件或生理条件而引导基因的表达。通常将在大多数细胞类型中、在大多数情况下引起基因表达的启动子称为“组成型启动子”。还应认识到因为在大多数情况下还不能完全确定调控序列的确切范围，不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。
[0048]术语“可操作地连接”是指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即该编码序列受到该启动子的转录控制)时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以按有义或反义的取向可操作地连接到调控序列。
[0049]如本文所用，术语“表达”是指源于本发明核酸片段的有义RNA(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。
[0050]如本文所用，术语“过表达”是指在宿主细胞中核酸或蛋白水平的增加。因此，可通过增加宿主细胞中内源性的序列的转录或翻译水平、或在宿主细胞中导入异源的序列导致过表达。也可通过增加核酸或蛋白序列的稳定性导致过表达。
[0051]术语内源性蛋白诸如酶的“活性和/或表达减少”可意为或者所述蛋白比活性的降低(例如活性降低)，和/或细胞中蛋白浓度的减少(例如表达降低)，而内源性蛋白诸如酶的“活性和/或表达缺失”可意为或者所述酶没有比活性或比活性可以忽略不计(例如活性缺失)，和/或细胞中所述酶没有浓度或浓度可以忽略不计(例如表达缺失)。
[0052]如本文所用，术语“转化”是指将核酸片段转移至宿主生物体内，导致基因稳定遗传。含有转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化”生物体。
[0053]如本文所用，术语“质粒”和“载体”是指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且`常常是环状双链DNA分子的形式。这类元件可包括源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列(线性或环状)，其中多个核苷酸序列已连接或重组进入独特构建体中，该独特构建体能够将所选基因产物的启动子片段和编码器与适当的3'端非翻译序列一起导入细胞中。
[0054]如本文所用，术语“密码子简并性”是指允许核苷酸序列在不影响所编码的多肽的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。技术人员非常了解具体宿主细胞在使用核苷酸密码子以确定给定氨基酸时所表现出的“密码子偏倚性”。因此，当合成基因用以改善在宿主细胞中的表达时，期望对基因进行设计，使得其密码子使用频率接近该宿主细胞优选的密码子使用频率。
[0055]术语“密码子优化的”在其涉及用于转化不同宿主的核酸分子的基因或编码区时，是指在不改变由DNA编码的多肽的情况下，改变核酸分子的基因或编码区中的密码子以反应宿主生物体通常的密码子使用。此类优化包括将至少一个、或多于一个、或显著的数目的密码子替换为在那种生物体中使用频率更高的一个或多个同义密码子。密码子优化的编码区也可通过本领域的技术人员已知的多个方法进行设计，包括软件包如“synthetic genedesigner” (http://phenotype.biosc1.umbc.edu/codon/sgd/index, php)。
[0056]包含编码任何多肽链的氨基酸的密码子的核苷酸序列中的偏向，允许编码该基因的序列中的变型。由于每一密码子由三个核苷酸组成，而组成DNA的核苷酸限于四种特异性碱基，存在64种可能的核苷酸组合，其中的61种编码氨基酸(其余三种密码子编码结束翻译的信号)。本文将显示哪些密码子编码哪些氨基酸的“遗传密码”重制为表1。因此，许多氨基酸被分配了多于一种的密码子。例如，氨基酸丙氨酸和脯氨酸由四种三联体编码，丝氨酸和精氨酸由六种，而色氨酸和甲硫氨酸仅由一种三联体编码。这种简并性允许DNA碱基组成在宽范围内变化而不会改变由该DNA编码的蛋白质的氨基酸序列。
[0057]表1:标准遗传密码
【权利要求】
1.生产丁醇的方法，包括: (a)提供组合物，所述组合物包含(i)能够产生丁醇的微生物和(ii)能够将5碳糖转化成木酮糖或木酮糖-5-磷酸的酶或酶的组合； (b)使所述组合物与包含混合糖的碳底物接触；以及 (c)在限制氧气利用的条件下培养所述微生物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述丁醇是异丁醇。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述微生物是酵母。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述能够将5碳糖转化成木酮糖或木酮糖-5-磷酸的酶或酶的组合是由所述组合物中的微生物重组表达的。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述能够将5碳糖转化成木酮糖或木酮糖-5-磷酸的酶或酶的组合是由所述能够产生丁醇的微生物重组表达的。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述能够将5碳糖转化成木酮糖或木酮糖-5-磷酸的酶或酶的组合不是由所述能够产生丁醇的微生物产生的。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述能够将5碳糖转化成木酮糖或木酮糖-5-磷酸的酶或酶的组合不是由所述组合物中的微生物产生的。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述能够将5碳糖转化成木酮糖或木酮糖-5-磷酸的酶或酶 的组合选自:(i)木糖异构酶；(ii)木糖还原酶；(iii)木糖醇脱氢酶；(iv)阿拉伯糖异构酶；(V)核酮糖激酶；(vi)核酮糖-磷酸-5-差向异构酶；(vii)阿拉伯糖还原酶；(viii)阿拉伯糖醇脱氢酶；(ix)木酮糖还原酶；(x)木酮糖激酶；(xi)醛糖还原酶；以及(xii)它们的组合。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述木糖异构酶具有酶学委员会编号EC5.3.1.5。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述木糖还原酶具有酶学委员会编号ECl.1.1.9或 ECl.1.1.10。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述阿拉伯糖异构酶具有酶学委员会编号EC5.3.1.4。
12.根据权利要求8所述的方法，其中所述核酮糖激酶具有酶学委员会编号EC2.7.1.16。
13.根据权利要求8所述的方法，其中所述核酮糖-磷酸-5-差向异构酶具有酶学委员会编号 EC5.1.3.4。
14.根据权利要求8所述的方法，其中所述阿拉伯糖醇脱氢酶具有酶学委员会编号ECl.1.1.12。
15.根据权利要求8所述的方法，其中所述木酮糖激酶具有酶学委员会编号EC2.7.1.17。
16.根据权利要求8所述的方法，其中所述醛糖还原酶具有酶学委员会编号ECl.1.1.21。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述5碳糖源是木糖源。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述5碳糖源是阿拉伯糖源。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中5碳糖被转化成丁醇。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述5碳糖源也是6碳糖源。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，还包括使所述组合物与6碳糖源接触。
22.根据权利要求21所述的方法，其中5碳和6碳糖以至少约1.5g/gdcw/h的速率累积消耗。
23.根据权利要求21-22中任一项所述的方法，其中5碳糖和6碳糖被转化成丁醇。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中可发酵碳以至少约2g/gdcw/h的速率累积消耗。
25.根据权利要求21-24中任一项所述的方法，其中5碳糖和6碳糖被消耗，并且5碳糖消耗的速率是6碳糖消耗的速率的至少约I%。
26.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述5碳糖源是木质纤维素生物质。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述木质纤维素生物质选自柳枝稷、废纸、来自造纸的淤渣、玉米粒、玉米棒、玉米壳、玉米秸杆、木材废料、草、小麦、小麦秸杆、干草、大麦、大麦秸杆、稻杆、甘蔗渣、高粱、大豆、从谷物的加工中获得的组分、树、枝、根、叶、木屑、锯末、灌木和灌丛、蔬菜、水果、花、动物粪肥、以及它们的混合物。
28.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述木质纤维素生物质用氨预处理。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述5碳糖源以至少约20g/L的浓度存在。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述5碳糖源以至少约50g/L的浓度存在。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述5碳糖源以至少约75g/L的浓度存在。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述能够产生丁醇的微生物包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列的转化:(a)丙酮酸至乙酰乳酸；(b)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸；(c) 2，3- 二羟基异戊酸至2-酮异戊酸；(d) 2-酮异戊酸至异丁醛；以及(e)异丁醛至异丁醇。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述能够产生丁醇的微生物包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有乙酰乳酸合酶、酮酸还原异构酶、二羟基酸脱水酶、酮异戊酸脱羧酶和醇脱氢酶活性。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述能够产生丁醇的微生物在编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源性多核苷酸中包含至少一个缺失、突变和/或替换。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽选自Pdcl、Pdc5、Pdc6、以及它们的组合。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述能够产生丁醇的微生物基本上不含具有丙酮酸脱羧酶活性的酶。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的方法，其中所述能够产生丁醇的微生物是PNYI504。
38.根据权利要求1-37中任一项所述的方法，其中所述培养在发酵罐中进行。
39.根据权利要求1-38中任一项所述的方法，其中向所述组合物添加呼吸抑制剂。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述抑制剂是抗霉素A。
41.根据权利要求1-40中任一项所述的方法，其中所述组合物和/或所述5碳糖源还包含不能产生丁醇的微生物，并且所述能够产生丁醇的微生物以至少等于lg/1的浓度存在。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述能够产生丁醇的微生物以超过不能产生丁醇的微生物浓度的浓度存在。
43.根据权利要求1-42中任一项所述的方法，其中比丁醇产量为至少约0.4g/g/h。
44.根据权利要求1-43中任一项所述的方法，还包括使所述组合物与合适的提取剂接触，从而可回收丁醇。
45.根据权利要求1-44中任一项所述的方法，还包括从所述培养物中纯化丁醇。
46.根据权利要求45所述的方法，其中从所述培养物中纯化丁醇包括在油醇中提取。
47.丁醇组合物，其通过权利要求1-46中任一项的方法获得。
48.异丁醇组合物，其通过权利要求2-47中任一项的方法获得。
49.用于生产丁醇的组合物，包含: (a)能够产生丁醇的微生物； (b)能够将5碳糖转化成木酮糖或木酮糖-5-磷酸的酶或酶的组合； (c)5碳糖源；和 (d)发酵培养基。
50.根据权利 要求49所述的组合物，其中所述丁醇是异丁醇。
51.根据权利要求49或权利要求50所述的组合物，其中所述微生物是酵母。
52.根据权利要求49-51中任一项所述的组合物，其中所述5碳糖源也是6碳糖源。
53.根据权利要求49-52中任一项所述的组合物，还包含6碳糖源。
54.根据权利要求49-53中任一项所述的组合物，其中所述5碳糖源以至少约20g/L的浓度存在。
55.根据权利要求54所述的组合物，其中所述5碳糖源以至少约50g/L的浓度存在。
56.根据权利要求55所述的组合物，其中所述5碳糖源以至少约75g/L的浓度存在。
57.根据权利要求49-56中任一项所述的组合物，其中所述能够产生丁醇的微生物包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列的转化:(a)丙酮酸至乙酰乳酸；(b)乙酰乳酸至2，3- 二羟基异戊酸；(c) 2，3- 二羟基异戊酸至2-酮异戊酸；(d) 2-酮异戊酸至异丁醛；以及(e)异丁醛至异丁醇。
58.根据权利要求57所述的组合物，其中所述能够产生丁醇的微生物包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有乙酰乳酸合酶、酮酸还原异构酶、二羟基酸脱水酶、酮异戊酸脱羧酶和醇脱氢酶活性。
59.根据权利要求49-58中任一项所述的组合物，其中所述能够产生丁醇的微生物在编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源性多核苷酸中包含至少一个缺失、突变和/或替换。
60.根据权利要求59所述的组合物，其中所述具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽选自Pdcl、Pdc5、Pdc6、以及它们的组合。
61.根据权利要求49-60中任一项所述的组合物，其中所述能够产生丁醇的微生物是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
62.根据权利要求49-61中任一项所述的组合物，还包含呼吸抑制剂。
63.根据权利要求49-62中任一项所述的组合物，还包含并不产生丁醇的微生物。
64.根据权利要求63所述的组合物，其中所述能够产生丁醇的微生物以与所述并不产生丁醇的微生物浓度至少相等的浓度存在。
65.根据权利要求49-64中任一项所述的组合物，其中所述组合物能够产生丁醇和乙醇。
66.根据权利要求49-65中任一项所述的组合物，其中所述组合物能够产生至少约0.4g/g%理论产率的丁醇。
67.丁醇组合物，其通过在限制氧气利用的条件下培养权利要求49-67中任一项的组合物获得。
68.异丁醇组合物，其通过在限制氧气利用的条件下培养权利要求49-67中任一项的组合物获得。
69.使丁醇生产微生物在木质纤维素材料中生长的方法，包括: (a)提供包含木质纤维素材料的组合物； (b)使所述组合物与(i)能够产生丁醇的微生物和(ii)能够将5碳糖转化成木酮糖或木酮糖-5-磷酸的酶或酶的组合接触；以及 (C)将所述组合物维持在限制氧气利用的条件下。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述能够将5碳糖转化成木酮糖或木酮糖-5-磷酸的酶或酶的组合是由所述能够产生丁醇的微生物重组表达的。
71.丁醇组合物，其通过权利要求70的方法获得。
72.异丁醇组合物，其通过权利要求70的方法获得。
73.抑制并不产生丁醇的微生物在包含木质纤维素材料的组合物中生长的方法，包括: (a)提供包含木质纤维素材料的组合物； (b)使所述组合物与(i)能够产生丁醇的微生物和(ii)能够将5碳糖转化成木酮糖或木酮糖-5-磷酸的酶或酶的组合接触；以及 (C)将所述组合物维持在限制氧气利用的条件下。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述能够将5碳糖转化成木酮糖或木酮糖-5-磷酸的酶或酶的组合是由所述能够产生丁醇的微生物重组表达的。
75.丁醇组合物，其通过权利要求73或74的方法获得。
76.异丁醇组合物，其通过权利要求73或74的方法获得。
【文档编号】C12P7/16GK103814135SQ201280029221
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年6月15日 优先权日:2011年6月17日
【发明者】I.D.多布森, A.L.克鲁科伯格 申请人:布特马斯先进生物燃料有限责任公司