gp41中和性抗体及其用途

gp41中和性抗体及其用途
【专利摘要】本发明公开了特异性结合于HIV-1gp41的膜近端外部区域(MPER)的单克隆中和性抗体。本发明还公开了包含所公开的特异性结合gp41的抗体的组合物、编码这些抗体的核酸、包含所述核酸的表达载体以及表达所述核酸的分离的宿主细胞。本文公开的抗体和组合物可用于在生物样品中检测HIV-1的存在或在对象中检测HIV-1感染或诊断AIDS。此外，所公开的抗体的宽的中和广度使它们理想地用于治疗患有HIV感染的对象。因此，本发明公开了治疗和/或预防HIV感染的方法。
【专利说明】gp41中和性抗体及其用途
[0001]与相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2012年9月18日提交的美国临时申请号61/702，703、2012年9月7日提交的美国临时申请号61/698，480、2012年7月17日提交的美国临时申请号61/672，708和2011年11月7日提交的美国临时申请号61/556，660的权益。每个这些在先申请以其全部内容通过参考并入本文。

【技术领域】
[0003]本发明涉及单克隆中和性抗体的鉴定，所述单克隆中和性抗体例如但不限于结合于HIV-lgp41的近膜区的抗体。

【背景技术】
[0004]有效的I型人免疫缺陷病毒(HIV-1)疫苗可能需要诱导阻断HIV-1进入人类细胞的中和性抗体(NAb)。为了有效，疫苗诱导的抗体必须有活性对抗大多数HIV-1循环株。不幸的是，目前的HIV-1疫苗不能诱导强效并具有广泛反应性的NAb。设计更好的疫苗的一个主要障碍是对NAb识别HIV-1包膜糖蛋白例如gpl20和gp41的哪个区域的理解有限。已从HIV-1感染的个体分离到数种中和性单克隆抗体(mAb)，并且这些mAb确定了病毒上对NAb易感的特定区域(表位)。
[0005]尽管包膜糖蛋白是免疫原性的并且诱导各种抗体，但被诱导的中和性抗体是株特异性的，并且大部分的免疫应答被转向非中和性决定簇(WeiSS，R.A.等，Nature, 1985.316 (60 23):ρ.69-72 ；ffyatt, R.和 J.Sodroski, Science, 1998.280 (5371):p.1884-8)。仅仅从自然HIV感染分离到很少的广泛中和性抗体。结合gp41的广泛中和性抗体的三个实例是2F5、4E10和Z13E1。这些gp41中和性抗体识别HIV_lgp41糖蛋白的近膜区(MPER)。不幸的是，这些抗体在其株交叉反应性或效价方面受限，因此不能为治疗性干预提供可行的选择。因此，对于制备能够针对感染因子例如HIV提供保护的单克隆广泛中和性抗体的方法，存在着需求。


【发明内容】

[0006]本文中提供了特异性结合gp41的分离的人类单克隆中和性抗体。在某些实施例中，对这些抗体的结合和/或中和能力进行了优化。在本文中还公开了包含所公开的特异性结合gp41的抗体的组合物、编码这些抗体的核酸、包含所述核酸的表达载体、以及表达所述核酸的分离的宿主细胞。还提供了所述分离的抗体的抗原结合片段。
[0007]在某些实施方式中，分离的人类单克隆抗体或其抗原结合片段包括重链和轻链，其中所述重链包括与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少约80%同一性的氨基酸序列。在数种这样的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合于gp41并接触LffNWFDITNWLffYIR(SEQ ID NO:26，第14-28位残基)所示的氨基酸序列中的L、WF、LW和R，并且是中和性的。在其他实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合于gp41并接触NWFDITNWLWYIR(SEQ ID NO:13，第7-19位残基)所示的氨基酸序列中的NWF、T和R，并且是中和性的。在其他实施方式中，提供了一种分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其包括重链和轻链，其中所述重链包括SEQ ID NO:11的第26-33位(重链互补决定区I (HCDRl))、第51-60位(HCDR2)或第99-120位(HCDR3)氨基酸，其中X1是Q或R，X2是V或A，X3是S或Y，并且^是!1或I。所述抗体或抗原结合片段特异性结合HIV-1的gp41，并且是中和性的。在某些这样的实施方式中，分离的人类单克隆抗体或抗原结合片段包括重链，所述重链包含 SEQ ID NO:1、3、5、147-149、189-192 或 200-204 之一的第 26-33 位(HCDRl)、第 51-60位(HCDR2)和第99-120位(HCDR3)氨基酸中的一个或多个。在某些这样的实施方式中，所述分离的人类单克隆抗体的重链包括与SEQ ID NO:1、3、5、147-149、189-192或200-204之一所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。在其他实施方式中，所述分离的人类单克隆抗体或其抗原结合片段的重链包括SEQ ID NO:1、3、5、147-149、189-192或200-204之一所示的氨基酸序列。
[0008]在其他实施方式中，分离的人类单克隆抗体或其抗原结合片段包括与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少约80%同一性的轻链。在其他实施方式中，所述轻链包括SEQID NO:12的第26-31位(轻链互补决定区I (LCDRl))、第49-51位(LCDR2)和第87-98位(LCDR3)氨基酸，其中X4是E或D，X5是Y或H，X6是K或I，X7是V或I，X8是S或T，X9是D或E，X1Q是E或D，并且乂11是1'或I。在其他实施方式中，所述轻链包括SEQ ID NO:2、4、6、12、150-152 或 164-186 之一的第 26-31 位(LCDRl)、第 49-51 位(LCDR2)或第 87-98 位(LCDR3)氨基酸。在某些实施方式中，所述分离的人类单克隆抗体或抗原结合片段的轻链包括与SEQ ID NO:2、4、6、12、150-152或164-186之一所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一种实施方式中，所述分离的人类单克隆抗体或抗原结合片段的轻链包括SEQ ID NO:2、4、6、12、150-152或164-186之一所示的氨基酸序列。
[0009]在某些实施方式中，提供了一种分离的人类单克隆抗体或其抗原结合片段，其中重链包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，并且轻链包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。所述抗体特异性结合HIV-1的gp41，并且是中和性的。在其他实施方式中，提供了一种分离的人类单克隆抗体或其抗原结合片段，其中重链包括SEQ ID NO:154所示的氨基酸序列，并且轻链包括SEQ ID NO:152所示的氨基酸序列。所述抗体特异性结合HIV-1的gp41，并且是中和性的。在其他实施方式中，提供了一种分离的人类单克隆抗体或其抗原结合片段，其中重链包括SEQ ID NO:192所示的氨基酸序列，并且轻链包括SEQ ID NO:152所示的氨基酸序列。所述抗体特异性结合HIV-1的gp41，并且是中和性的。
[0010]本文公开的抗体和组合物可用于各种目的，例如用于检测生物样品中Hiv-1的存在或诊断AIDS。这些方法可以包括:将来自于对象的样品与特异性结合gp41的人类单克隆抗体相接触，以及检测所述抗体与所述样品的结合。相对于所述抗体与对照样品的结合，所述抗体与所述样品的结合的增加将所述对象鉴定为具有HIV-1感染和/或AIDS的对象。在某些非限制性实施例中，相对于所述抗体与对照样品的结合，所述抗体与所述样品的结合的增加，检测到HIV-1的存在。
[0011]还公开了用于治疗具有HIV感染的对象的方法，所述具有HIV感染的对象例如但不限于患有AIDS的对象。所述方法包括向对象施用治疗有效量的如上所述的单克隆抗体。
[0012]从下面参考附图进行的数种实施方式的详细描述，本公开的上述和其他特征和优点将变得更加显而易见。

【专利附图】

【附图说明】
[0013]图1A-1C是示出了 10E8抗体序列和中和的分析的一组表和图。⑷推断的编码10E8、7H6和7N16的可变区的种系基因。(B)抗体针对181种分离株的HIV-1包膜蛋白(Env)-假病毒小组的中和活性。树状图指示了 HIV-1原代分离株的Env的gpl60蛋白的距离。(C)树状图下方的数据显示了所测试的病毒的数目、被中和的病毒的百分率和IC50<50 μ g/ml的被中和病毒的IC50的几何平均值。滴度中位数是基于所测试的所有病毒,包括IC50>50ug/ml的病毒，这样的病毒被指派100的值。
[0014]图2A 和 2B 示出了 10E8 的结合特异性。(A)mAblOE8 或 4E10 与 gpl40、gpl20、gp41或4E10肽的酶联免疫吸附测定法(ELISA)结合。误差线表示平均值的一个标准误差(SEM)。(B)4E10丙氨酸扫描肽抑制mAblOE8或4E10对C1HIV-2/HIV-1MPER病毒的中和。在感染TZM-bl细胞之前将肽与mAb4E10或10E8温育I小时。Y-轴示出了每种条件的中和百分数。W672、F673、T676和R683残基是丙氨酸突变体肽不阻断中和的位置(R683仅仅适用于10E8抗体)。示出了 SEQ ID NO:26的第16-28位残基。
[0015]图3A和3B是示出了 10E8自体反应性的分析的一组表和一组数字图像。
(A)1ES与阴离子型磷脂的结合的表面等离子体共振(SPR)分析。将10E8注射到固定在BIACORE? LI传感器芯片上的PC-CLP脂质体或PC-PS脂质体上。使用4E10和2F5作为阳性对照，并使用13Hl、17b和抗RSV F蛋白抗体作为阴性对照。⑶10E8与HEP-2上皮细胞的反应性。对照如上所述，并添加VRCOl作为另外的阴性对照。抗体浓度为25 μ g/ml。所有图片以400x放大倍数示出。
[0016]图4A-4H是示出了与其gp41MPER表位复合的10E8抗体的晶体结构的一组条带图。(A)10E8识别高度保守的gp41螺旋以中和HIV-1。用条带表示法示出了 FablOE8 (深灰色阴影表示重链，浅灰色表示轻链)，其与涵盖MPER(Asn656-Arg683 ；NEQELLELDKffASLffNWFDITNWLffYIR(SEQ ID NO:26))的 gp41 肽(深灰色)复合。(B) 10E8 与 gp41 之间的界面，其中所选的10E8侧链和gp41侧链用条棒表示法显示。用手类比，铰链可以被视为被拇指(用CDR H2表示)握住，C-端螺旋被视为沿着相应的伸长的食指(用CDR H3表示)悬挂，并且起始C-端螺旋的残基被视为被拇指与食指之间的裂缝(用CDR环的接合处表示)捉住。(C-D)埋置的接触表面和表位保守性。gp41上埋置的接触表面(灰色；C)的检查揭示出在2870个被检查的病毒株中，被10E8直接接触的表位残基(标记的，D)是高度保守的(保守百分率被提供在括号中；也参见图26-28)。E-H，互补位(paratope)和表位的丙氨酸突变。10E8CDR H3环的尖端处和疏水裂缝内的残基对于gp41的识别和病毒中和来说是关键的(图31-32)，正如在埋置的10E8接触表面上所作图的(E，G)。这些结果反映出10E8表位的丙氨酸扫描突变的影响(图18-19)，正如在埋置的10E8接触表面上所作图的(F，H)。互补位和表位的丙氨酸突变的影响的比较，揭示出对10E8识别和中和来说最关键的表位的残基也是保守性最高的(D)。
[0017]图5A和5B是示出了 gp41易感性位点的表、一组图和示意图。(A)序列变异对10E8中和的影响。示出了三种10E8抗性病毒和患者病毒的10E8结合表位内的预测的氨基酸序列。10E8结合区及其与JR2病毒相比的序列差异用浅灰色标出。比JR2野生型假病毒高20倍以上的IC50和IC80值用浅灰色突出。误差线表示SEM。(B)被中和性抗体识别的gp41的高度保守区域的结构定义。与10E8进行直接接触的高度保守残基的原子采用中等灰色阴影并用条棒表示法示出，被10E8埋置的原子采用深灰色阴影，主链接触原子采用浅灰色阴影。gp41MPER的半透明的表面按照位于下方的原子画上阴影。示出了 90°的视图，其中右侧图中是结合的抗体10E8。10E8CDR H3与高度保守的疏水性残基相互作用，而CDR H2接触N-端与C-端螺旋之间的接合处的主链原子。MPER的许多未结合的残基(灰色)，特别是C-端螺旋内的未结合的残基是疏水的。在晚期融合中间体的结构中(图16)，这些残基面朝螺旋的卷曲螺旋的外部；在病毒刺突的融合前构象中，它们可能与病毒膜或与Env的其他疏水区相互作用。
[0018]图6A 和 6B 描绘了 gp41 抗体 10E8 (SEQ ID NO:1 和 2)、7H6 (SEQ ID NO:3 和 4)、7N16(SEQ ID NO:5 和 6)、IGHV3_15*05 (SEQ ID NO:7)和 IGLV3_19*01 的种系序列(SEQ IDNO:8)的重链和轻链的序列比对。浅灰色残基表不相对于种系序列的置换。点符号表不残基缺失。示出并使用Kabat和MGT编号系统来识别10E8重链和轻链中的特定残基。
[0019]图7是示出了 N152供体血清与抗体10E8之间的中和效价的相关性的图。示出了针对20种假病毒的小组评估的N152供体血清的中和ID50相对于10E8的中和IC50的图。使用非参数Spearman相关性来评估10E8的IC50与N152的ID50之间的相关性。
[0020]图8A-8C是示出了 10E8的结合特异性的图和一组表。(A)所指示的mAb与MPER、2F5、Z13el、4E10和4E10.19肽的ELISA结合。还示出了肽的氨基酸序列(降序，N-端和C-端带有3个赖氨酸的SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:26的第1-16位残基，C-端带有3个赖氨酸的SEQ ID NO:26的第11-21位残基，C-端带有3个赖氨酸的SEQ ID NO:26的第16-24位残基，和N-端带有半胱氨酸并且C-端带有3个赖氨酸的SEQ ID NO:26的第16-28位残基。(B-C)通过添加 MPER、2F5、Z13el、4E10 和 4E10.19 肽抑制 C1HIV-2/HIV-1MPER 嵌合病毒的mAb中和。倍率效应被计算为对于指定的肽来说，模拟肽的中和IC50/IC50的比率
(B)，或模拟肽的中和IC80/IC80的比率(C)。>5的值采用浅灰色阴影。
[0021]图9A和9B示出了 10E8、2F5和4E10抗体与gp41MPER肽的结合的表面等离子体共振分析。(A)将包含gp41的第656-683位残基的生物素化的MPER肽固定在链霉亲和素SA芯片(GE Healthcare)上，并将作为被分析物的抗体Fab以3.9_125nM(10E8)、0.49-31.25nM(2F5)和0.25nM至62.5nM(4E10)范围内的2倍连续增加的浓度在其上流过。分别使用3分钟和5分钟的结合期和解离期，流速为30 μ I/分钟，每种被分析物浓度进行三份平行试验。(B)通过将传感图用1:1的Langmuir模型进行拟合，获得所列出的结合常数。示出了 SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
[0022]图10是示出了 HIV-1+具有给定特异性的血清的频率的饼图。在本测定法中使用了来自于78位健康的HIV-1感染的供体的血清。通过患者血清中和含有MPER的部分的HIV-2/HIV-1嵌合体的能力来测量频率，并使用肽阻断来验证。血清的中和ID50被报告在图21中。肽阻断后ID50的倍率变化被报告在图22中。血清含有10Ε8样抗体的6位患者与其余的72位患者，在病毒载量(含有10Ε8时的6748个拷贝/ml相比于不含10E8时的5446个拷贝/ml ；p>0.05)、CD4计数(437个细胞/μ I相比于557个细胞/μ I ；ρ>0.05)、从诊断起的年数(20年相比于13年；ρ>0.05)或中和滴度中位数(302相比于156 ；ρ>0.05)方面没有差异。
[0023]图11A-11C示出了 10E8对MPER的可接近性。(A)通过流式细胞术测量的10E8、4E10和2F5与表达在293T细胞表面上的全长HIV1Ki包膜刺突、4E10突变体(Phe673Ser)或2F5突变体(Lys665Glu)的结合。将连续稀释的抗体与细胞温育I小时。将2G12和bl2抗体用作阳性对照，F105用作阴性对照。在JR-FL转染的细胞上将VRCOl用作附加对照。相对结合百分数被计算为平均荧光强度(MFI)除以阳性对照2G12的最大MFI XlOO0 (B)通过在感染TZM-bl细胞之前洗涤抗体-毒粒混合物来确定MPER的可接近性。将假病毒与抗体在37°C温育30分钟，并且在感染靶细胞之前对抗体-毒粒混合物进行洗涤或不洗涤。
(C)通过曲线下面积(AUC)或IC80来度量洗涤对抗体中和的影响。对于BaL和JRFl来说，在无洗涤的条件下没有获得IC80，因此使用最高的抑制浓度(分别为IC60和IC75)。
[0024]图12A和12B是示出了晶体不对称单元中gp41MPER的两个拷贝的比较的示意图。(A)用条棒表示法示出了来自于晶体不对称单元中的两种10E8-gp41复合物的gp41肽(复合物1，深灰色；复合物2，中灰色)，其被它们的2fo-fc电子密度在I σ处的轮廓线(深灰色)所包围。示出的图像相对于彼此旋转180°，并且采取与图4C和4D中相同的取向。(B)两种结晶复合物中肽的比对。在第671-683位残基的所有原子的比对的基础上，在90°视图中示出了不对称单元中的两个肽的重叠。在该比对中，复合物2中的N-端螺旋相对于复合物I中的相应螺旋变化45°。尽管两种复合物中N-端螺旋的不同取向表明了一定程度的结构可塑性，但两种复合物中铰链和C-端螺旋的残基是高度保守的，并参与与抗体的最关键的相互作用。
[0025]图13A-13C是示出了 10Ε8互补位丙氨酸变体的表面等离子体共振分析的一组图。示出了 MPER肽与25种10Ε8互补位变体以及野生型(wt) 10E8的结合传感图。将变体IgG捕获在抗人类IgG抗体偶联的生物传感器芯片上至表面密度为1000-2000个响应单位，并将MPER肽(列出的)以从500nM开始(例外的是HC D30A、W100bA、S100cA、P100fA，它们从250nM开始)的连续的两倍稀释液流过被分析物。使用分别为3分钟和5分钟的结合期和解离期，流速为 30μ Ι/min。使用 BIACORE? BIAEVALUAT1N? 软件(GE Healthcare)将传感图用1:1Langmuir模型拟合。结合常数被报告在图31中。SEQ ID NO:26的氨基酸序列被示出在图13C中。
[0026]图14示出的图显示了 10E8变体的结合和中和的相关性。将10E8丙氨酸互补位变体的结合Kd对它们的中和IC50和IC80的平均值作图。使用非参数Spearman相关性来评估结合与中和之间的关系。Kd以及中和IC50和IC80被报告在图31-32中。
[0027]图15A-15H示出了结构上保守的C-端MPER螺旋被10E8和4E10的识别。10E8和4E10使用明显不同的识别模式来结合位于gp41MPER的C-端处的结构上保守的螺旋。(A)中和性抗体10E8、2F5(蛋白质数据库(PDB)ID N0.1TJI，以2012年10月22日在数据库中存在的形式通过参考并入本文)、Z13el (PDB ID N0.3FN0,以2012年10月22日在数据库中存在的形式通过参考并入本文)和4E10(PDB ID N0.2FX7，以2012年10月22日在数据库中存在的形式通过参考并入本文)的MPER构象和埋置表面。示出了被每种抗体结合的gp41MPER的Ca-条带图，其中条形图显示了每个残基的埋置表面的量。在每个条形图的下方示出了 SEQ ID NO:26的氨基酸序列。结晶化表位的序列用大写字母示出。(B)以90°取向显示的在10E8结合(深灰色)构象和4E10结合(浅灰色)构象中的MPER C-端螺旋的重叠。示出了 Ca-条带图，其中侧链显示为条棒。(C-F)C-端MPER螺旋的10E8和4E10识别的比较，其中分子用Ca-条带图显示。(C)与MPER复合的10E8可变结构域，按照图4A着色。(D)与MPER复合的4E10可变结构域(PDB ID N0.2FX7,以2012年10月22日在数据库中存在的形式通过参考并入本文)，采取基于(B;左图)中描述的gp41C-端螺旋的比对的取向。gp41被着色为灰白色，4E10重链为深灰色，4E10轻链为中灰色。(E-F) (C)和
(D)的90°视图，从保守的MPER C-端螺旋的C-端向N-端俯视。(G，H) 10E8和4E10结合的MPER C-端螺旋的螺旋轮状图，反映出在(B ;右图)中显示的取向。被突出的抗体接触面是基于在抗体与gp41之间观察到的直接接触，如图35中所述。
[0028]图16示出的条带图显示了在gp41的“晚期中间体”构象上作图的gp41易感性位点。示出了由抗体10E8在gp41上的接触足迹所定义的gp41易感性位点，其被作图在10E8结合的MPER肽结构(左侧，与图6B相似的取向)和gp41的晚期中间体6螺旋束构象(PDBID N0.2XR7(右侧)，以2012年10月22日在数据库中存在的形式通过参考并入本文)上。被抗体10E8识别的原子被着色为深灰色，并用条棒表示法示出。抗体2F5、Z13el和4E10专有的原子或残基接触被示出为条棒，着色为浅灰或中灰色。10E8定义的易感性位点面朝外，远离束的核心轴，并且在这种构象中显得具有大的可接近性。第674位处的可能的N-连接糖基化位点与晚期中间体构象不相容，因为第674位残基的侧链面朝6螺旋束的内部。
[0029]图17A-17F是示出了 10E8的中和性质的一组表。(A) 10E8和7H6针对5种分离株的Env-假病毒小组的中和 。小于I μ g/ml的IC50值用灰色突出。(B)患者N152血清和单克隆抗体的中和分布情况(profile)。a N152的数据显示出血清针对每种病毒的ID50(50%感染所需的病毒剂量)。ID50>1000用深灰色突出，500〈ID50〈1000为中灰色，100〈ID50〈500为浅灰色。单克隆抗体的数据显示了 IC50。〈I μ g/ml的IC50用中灰色突出；1_10μ g/ml的IC50用浅灰色突出；10-50 μ g/ml的IC50用深灰色突出。(C-F)针对181种HIV-1Env-假病毒的抗体中和数据。〈I μ g/ml的IC50用中灰色突出J-lOμg/ml的IC50用浅灰色突出；10-50 μ g/ml的IC50用深灰色突出。
[0030]图18是示出了通过ELISA检测到的10E8和4E10与gp41MPER丙氨酸扫描肽的结合的表。倍率变化被计算为肽的IC50/模拟肽的IC50。>10的倍率变化值用浅灰色突出。
[0031]图19是列出了 10E8对假型HIV-1jk2MPER丙氨酸突变体的中和数据的表。浓度为μ g/ml ο与JR2野生型相比，对于10E8来说>20倍或对于4E10来说>100倍的IC50和IC90值，用浅灰色突出。
[0032]图20是列出了用于中和测定法的HIV-2/HIV-1嵌合体的序列的表。示出了 7312A、C1、C1C、C3、C7、C6、C4、C4GW 和 C8 的序列(分别为 SEQ ID NO: 15-22)。对应于 HIV-1MPER的序列的MPER序列片段带有下划线。
[0033]图21是示出了使用HIV-2/HIV-1嵌合体对抗MPER中和性抗体/血清进行作图的表。a 示出了 IC50(y g/ml) ? b 示出了 ID50 值。如果 HIV-2/HIV-1 嵌合体的 ID50 比 HIV-2野生型对照高3倍并且>100，则数字被加粗并用浅灰色突出。表示没有中和。“ND”表示血清分类不能确定。
[0034]图22是示出了使用突变体MPER肽阻断HIV-2/HIV-1嵌合体Cl的mAb和血清介导的中和的表。阻断性肽的序列被示出在图8A中。bIC50的倍率变化是指(肽的IC50)/(模拟肽的IC50)。eID50的倍率变化是指(模拟肽的ID50)/(肽的ID50)。浅灰色突出表示相对于对照肽的IC50/ID50的3倍变化。
[0035]图23是示出了 10E8与自体抗原的反应性的表。10E8与自体抗原的反应性通过Luminex测定法来检测。使用抗RSV单克隆抗体Synagis (Medlmmune, Gaithersburg, MD)作为阴性对照。还测试了 4E10、2F5、VRC01和17b抗体用于比较。SSA是指Sjogren综合征抗原A ；SSB是指Sjogren综合征抗原B ；Sm是指Smith抗原；RNP是指核糖核蛋白；Scl70是指硬皮病70 Jol是指抗原；CentrB是指着丝点B。
[0036]图24是列出了 10E8晶体结构研究的数据收集和细化统计学的表。在括号中示出了最高分辨率层。示出的数据集从一个晶体收集。
[0037]图25是列出了抗体结合的gp41肽的Ph1-Psi角的表。a对于4E10: gp41复合物来说，使用I3DB ID N0.2FX7的结构(以2012年10月22日在数据库中存在的形式通过参考并入本文)。b对于Z13el: gp41复合物来说，使用I3DB ID N0.3FN0的结构(以2012年10月22日在数据库中存在的形式通过参考并入本文)。
[0038]图26是列出了 10E8和gp41上的总埋置表面积的表。所有相互作用使用PTSA来进行(eb1.ac.uk/msd-srv/prot_int/cg1-b in/pi server)。§BSA 是指埋置表面积 A2n
[0039]图27是逐个残基列出了在10E8重链与gp41之间的界面处的埋置表面积的表。所有相互作用使用 PISA 来进行(eb1.ac.uk/msd-srv/prot_int/cg1-b in/pi server)。￡ 在保藏于Los Alamos HIV序列数据库(直至12/2011)中的2870种HIV株的分析中该残基的同一性百分数。iASA是指可接近表面积A2。§BSA是指埋置表面积A2。§§条棒表示埋置面积百分率，一个条棒表示10%。AiG是指溶剂化能量效果kcal/mol。
[0040]图28是逐个残基列出了在10E8轻链与gp41之间的界面处的埋置表面积的表。所有相互作用使用 PISA 来进行(eb1.ac.uk/msd-srv/prot_int/cg1-b in/pi server)。￡ 在保藏于Los Alamos HIV序列数据库(直至12/2011)中的2870种HTV株的分析中该残基的同一性百分数。ASA是指可接近表面积A2。BSA是指埋置表面PA条棒表示埋置面积百分率，一个条棒表示10%。Λ iG是指溶剂化能量效果kcal/mol。
[0041]图29是列出了 10E8与gp41之间的氢键和盐桥的表。氢键使用程序Ligplot来确定(McDonald等，J Mol B1l238, 777-793, 1994)。H链是指重链复合物I ;B链是指重链复合物2 ；P链是指gp41肽复合物I ;F链是指gp41肽复合物2。
[0042]图30是列出了 10E8与gp41之间的范德华接触的表。范德华接触使用程序Ligplot 来确定(McDonald 等，J Mol B1l238, 777-793，1994)。H 链和 L 链分别是指复合物I的重链和轻链；P链是指复合物I的gp41肽。B链和D链分别是指复合物2的重链和轻链；F链是指复合物2的gp41肽。
[0043]图31是示出了 10E8丙氨酸变体对可溶性MPER肽的结合亲和性的表。SE是指标准误差；nb是指在所使用的浓度范围下微弱至不可检测的结合。~倍数被定义为相对于在与变体平行进行的个体野生型试验的倍率变化。$3个个体野生型10E8试验的平均值。#只有产生超过10倍的效果的突变被作图在图4E中的10E8埋置表面上(中灰色，>100x ；浅灰色，50x〈100x ;深灰色，10x〈50x)。重链残基Y99AH。和GlOOhAre显示出几乎不结合于可溶性肽，而 CDR H3 的其他残基的突变(F100aAH。、GlOOdAac, PlOOfAac, P100gAH。、ElOOiAre 和ElOOjAac)使亲和性降低50-120倍(使用Kabat编号系统来识别10E8重链和轻链中的特定残基)。存在于疏水裂缝中的⑶R Hl环和构架区2突变W33Ah。和R50Ah。也分别消除了与MPER肽的结合，并且裂缝内的⑶R H2突变E53Ah。使对MPER肽的亲和性降低60倍。位于疏水裂缝底部处并与CDR H3的残基形成直接相互作用的轻链残基R91LC，当突变成丙氨酸时，可能通过使裂缝本身不稳定而消除了结合。
[0044]图32是列出了 10E8丙氨酸扫描变体的中和IC50和IC80的表。在最高抗体浓度下没有达到中和IC50或IC80的情况下，在平均值的计算中使用该最高浓度。_平均倍率效应被定义为针对每种病毒株观察到的各个倍率效应的平均值。&突变Y99Ah。、FlOOaAac,WlOObAac和GlOOhAlffi都对中和具有有害效应，使效价降低超过1000倍。其他突变也对中和具有强烈影响，包括⑶R H3的PlOOgAre和ElOOiAlffi以及疏水裂缝内的W33AHC和R50AHC。轻链突变R91Al。，与它对肽的结合的影响相似，使中和效价降低超过1000倍。
[0045]图33是示出了抗体结合的gp41结构的均方根偏差(RMSD)的表。使用程序LSQKAB进行比对(Winn, M.D.等,Acta Crystallogr D B1l Crystallogr, 67, 235-242, 2011) ? 对于4E10:gp41复合物来说，使用I3DB ID N0.2FX7的结构(以2012年10月22日在数据库中存在的形式通过参考并入本文)。对于Z13el: gp41复合物来说，使用I3DB ID N0.3FN0的结构(以2012年10月22日在数据库中存在的形式通过参考并入本文)。对于2F5:gp41复合物来说，使用I3DB ID N0.1TJI的结构。
[0046]图34是示出了 gp41上的MPER特异性抗体埋置表面的比较的表。相互作用研究使用 PISA 来进行(eb1.ac.uk/msd-srv/prot_int/cg1-b in/pi server)。括号中的值对应于复合物2。对于4E10:gp41复合物来说，使用I3DB ID N0.2FX7的结构(以2012年10月22日在数据库中存在的形式通过参考并入本文)。对于Z13el:gp41复合物来说，使用PDB IDN0.3FN0的结构(以2012年10月22日在数据库中存在的形式通过参考并入本文)。对于2F5:gp41复合物来说 ，使用I3DB ID N0.1TJI的结构(以2012年10月22日在数据库中存在的形式通过参考并入本文)。尽管识别更广泛的残基范围，但是10E8与4E10相比具有更小的gp41足迹。如果比较局限于重叠的肽范围，即第671-683位残基，则足迹的差异甚至更显著，其中10E8与4E10相比在gp41上埋置少约25%的表面积。
[0047]图35是示出了抗体10E8和4E10与gp41的直接接触的比较的表。直接接触使用程序 Ligplot 来确定(McDonald 等，J Mol B1l238, 777-793, 1994)。H 是指氢键;N 是指范德华接触。
[0048]图36是示出了使用10E8和4E10抗体中和假型C0T6.15 (进化枝C)包膜MPER突变体得到的结果的一组表。
[0049]图37是示出了使用10E8、7H6和7N16重链和轻链的交叉互补的中和测定法的结果的表。
[0050]图38是与gp41肽复合的抗体10E8的晶体结构的示意图，示出了抗体的静电表面电荷。
[0051]图39是与gp41肽复合的抗体10E8的晶体结构的示意图，示出了肽的静电表面电荷。
[0052]图40是与gp41肽复合的抗体10E8的晶体结构的示意图，示出了 10E8变体抗体7H6和7N16中的残基变化的位置。
[0053]图41是与gp41肽复合的2F5、4E10和Z13E1抗体的晶体结构的数字图像和gp41的示意图，示出了 2F5、4E10、Z13E1和10E8抗体的相对结合位点。示出了 SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
[0054]图42A和42B是示出了从PBMC样品进行CD 19+IgAlgDlgITB细胞的FACS分离的结果的散点图。
[0055]图43是示出了如实施例1和8中所描述的指定10E8残基(Kabat位置)的丙氨酸扫描的表和一组条带图。
[0056]图44A和44B是示出了为增强与gp41的疏水性相互作用而进行的基于结构的10E8突变的一系列条带图。
[0057]图45是示出了使用图44A和44B以及实施例8 (参考Kabat编号系统)中所描述的基于结构的10E8突变体对一组HIV-1病毒进行的中和测定的结果的表。
[0058]图46是示出了部分回复的抗体变体的设计的示意图。
[0059]图47是序列比对和条带图，其示出了 10E8重链和轻链的部分种系回复突变体。示出的序列是 SEQ ID NO:7(10E8_germ_H)、SEQ ID NO:147 (10E8gH01)、SEQ ID NO:148(10E8gH02)、SEQ ID NO: 149 (10E8gH03)、SEQ ID NO:1 (10E8_HEAVY)、SEQ ID NO:8(10E8_germ_L)、SEQ ID NO:150 (10E8gL01)、SEQ ID NO:151 (10E8gL02)、SEQ ID NO:152(10E8gL03)、SEQ ID NO:2 (10E8_LIGHT)。
[0060]图48是示出了使用如图47和实施例8中所描述的10E8抗体的部分种系回复突变体对一组HIV-1病毒进行的中和测定的结果的一组表。“10E8-R1”是指与10E8gL01轻链(SEQ ID NO:150)配对的 10E8gH01 重链(SEQ ID NO:147)。“ 10E8-R3” 是指与 10E8gL03轻链(SEQ ID NO:152)配对的 10E8gH03 重链(SEQ ID NO:149)。
[0061]图49是示出了使用如图47中所示并且在实施例8中所描述的10E8gH03重链背景(SEQ ID NO:149)或 10E8gL03 背景(SEQ ID NO:152)上的一系列 10E8 突变体对一组HIV-1病毒进行的中和测定的结果的一组表。
[0062]图50A-50F是示出了通过深度测序和网格取样鉴定抗体10E8的体细胞变体的一系列图。(A)供体N152重链抗体组的10E8同一'丨生/趋异性(divergence)图(左侧)和网格取样(右侧)。与10E8的同一性被示出在竖直轴上，与种系V-基因起源的趋异性被作图在水平轴上，抗体的频率被显示为热图。示出了网格取样，空心圆圈中是所选的不表达或结合于MPER的抗体，实心圆圈中是所选的结合的抗体，按照(C)中它们与10E8的系统发育距离进行着色。(B)供体N152轻链抗体组的10E8同一性/趋异性图(左侧)和网格取样(右侧)。轴和着色与(A)中相同。(C/D)重链(C)和轻链(D)的网格鉴定的变体的系统发育树。(E-F)对于重链变体(E)和轻链变体(F)来说，在6种HIV-1分离株上进行两份平行试验所评估的10E8和10E8变体的中和。gVRC-HldN152:10E8L和gVRC_HlldN152:10E8L的平均IC50与原始模板10E8相比提高约6倍。变体按照它们与10E8的遗传距离进行排列和命名，并且相对于它们的系统发育距离进行着色。
[0063] 图51A-51D是一系列序列比对和条带图，其示出了中和HIV-1的10E8变体的序列和模型化结构。(A)重链序列(SEQ ID NO:1 和 153-163，降序；gVRC_HldN152(SEQ ID NO:153) ; SVRCMEdm52 (SEQ ID NO:154) ；gVRC-H3dN152 (SEQ ID NO:155) ;gVRC_H4盤52 (SEQ IDNO:156) ；gVRC-H5dN152 (SEQ ID NO:157) ^VRC-Hetffll52 (SEQ ID NO:158) ；gVRC-H7dN152 (SEQ IDNO:159) ；gVRC-H8dN152(SEQ ID NO:160) ；gVRC-H9dN152 (SEQ ID NO:161) ；gVRC-H10dN152 (SEQID NO:162) ；gVRC-HlldN152(SEQ ID NO:163))。序列按照与10E8的遗传距离进行排列，与10E8的序列变化带有下划线。构架和CDR残基被突出，与gp41MPER表位相互作用的残基也是如此(空心圆圈，主链相互作用；带有射线的空心圆圈，侧链相互作用；实心圆圈，主链和侧链相互作用两者)。(B)与gp41表位复合的重链变体的模型化结构。将识别增强的10E8变体(其中重链按照如图1B中的系统发育距离画上阴影)模型化在带有HIV-lgp41的整个MPER区域(灰白色)的10E8的结构上。结构被显示为Ca-条带，其中与10E8相比变化的氨基酸侧链用条棒表示法突出为深灰色。(C)轻链序列(SEQ ID NO:2和164-186，降序；gVRC-Ll舰52(SEQ ID NO:164) ；gVRC-L2dN152 (SEQ ID NO:165) ;gVRC_L3舰52 (SEQ ID NO:166) ;gVRC-L4禮52(SEQ ID NO:167) ；gVRC-L5dN152 (SEQ ID NO:168) ;gVRC_L6禮52 (SEQ IDNO:169) ^VRC-LTtffll52 (SEQ ID NO:170) ^VRC-LStffll52 (SEQ ID NO:171) ^VRC-LQdm52 (SEQ IDNO:172) ；gVRC-L10dN152(SEQ ID NO:173) ；gVRC-LlldN152 (SEQ ID NO:174) ；gVRC-L12dN152 (SEQID NO:175) ；gVRC-L13dN152(SEQ ID NO: 176) ;gVRC_L14dN152 (SEQ ID NO:177);gVRC-L15盤52(SEQ ID NO:178) ；gVRC-L16dN152 (SEQ ID NO:179) ；gVRC-L17dN152 (SEQ ID NO:180) ;gVRC-L18盤52(SEQ ID NO:181) ^VRC-Ligtffll52 (SEQ ID NO:182) ；gVRC-L20dN152 (SEQ IDNO:183) ；gVRC-L21dN152(SEQ ID NO:184) ;gVRC_L22舰52 (SEQ ID NO:185) ；gVRC-L23dN152 (SEQID NO:186))。序列按照与10E8的遗传距离进行排列，与10E8的序列变化带有下划线。构架和CDR残基被突出，与gp41MPER表位相互作用的残基也是如此(如(A)中所述)。(D)与gp41表位复合的轻链变体的模型化结构。将识别增强的10E8变体(其中轻链按照如图1C中的系统发育距离画上阴影)模型化在带有HIV-lgp41的整个MPER区域(灰白色)的10E8的结构上。结构被显示为Ca -条带，其中与10E8相比变化的氨基酸侧链用条棒表示法突出为深灰色。
[0064]图52A-52D是表和一组图，其示出了 10E8的重链和轻链变体的系统发育分支匹配。(A)系统发育分支匹配。从网格鉴定的抗体(图1C、D)的系统发育树，分支根据与10E8的距离来命名，对于含有10E8的分支来说，bl-H为重链并且bl-L为轻链，并且以降序命名为b2-H(b2-L)、b3-H(b3-L)以及最远的分支b4_H。选择来自于每个分支的表现出与10E8野生型配偶体的最强中和的变体，并且重建12种抗体的完全矩阵。(B)HIV-1中和。对于来自于匹配和错配的分支配对的10E8变体，在5种分离株上评估中和。(C)H印2染色。对于来自于匹配和错配的分支配对的10E8变体，使用H印2细胞染色来评估自体反应性。
[0065]图53的表根据当与10E8野生型互补链互补时指定变体的中和效价，示出了由指定的重链和轻链变体构成的10E8单克隆抗体。
[0066]图54的表示出了由通过系统发育分析配对的指定重链和轻链变体构成的10E8抗体。
[0067]图55A-55C示出了一组表，其示出了使用如图53和54中所示并且如实施例8中所描述的通过中和效价配对或通过系统发育分析配对的一系列10E8变体对一组HIV-1病毒进行的中和测定的结果。
[0068]图56是一组表,其不出了使用如图53和54中所不并且如实施例8中所描述的通过中和效价配对或通过系统发育分析配对的一系列10E8变体对一组HIV-1病毒进行的自体反应性测定的结果。
[0069]图57是一组表,其不出了使用如图53和54中所不并且如实施例8中所描述的通过中和效价配对或通过系统发育分析配对的一系列10E8变体对一组HIV-1病毒进行的中和测定的结果。
[0070]图58A和58B是一组图，其示出了对含有10E8重链和轻链或10E8重链和轻链的变体的一系列指定抗体在一组20种HIV病毒上的中和性质进行测试的中和测定法的结果。
[0071]图59是示出了某些10E8抗体变体的重链和轻链的命名和SEQ ID NO的表。
[0072]图60A和60B是示出了 10E8重链变体的概况的一组表。“种系回复突变体”、“454”、“丙氨酸扫描”、“基于结构的”和“其他”突变体是指实施例8中示出的10E8重链置换。
[0073]图61A和61B是示出了 10E8轻链变体的概况的一组表。“种系回复突变体”和“454”是指实施例8中示出的10E8轻链置换。
[0074]序列表
[0075]在随附的序列表中列出的核酸和氨基酸序列，使用如37C.F.R.1.822中所定义的核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母编码来显示。每个核酸序列仅仅示出一条链，但是应该理解对所显示的链的任何引用均包含了互补链。序列表以文件名为“142159SEQ.txt”(~160kb)的形式作为ASCII文本文件提交，所述文件创建于2012年11月27日，并通过参考并入本文。在随附的序列表中:
[0076]SEQ ID NO:1是gp41特异性抗体10E8的重链的氨基酸序列。
[0077]SEQ ID NO:2是gp41特异性抗体10E8的轻链的氨基酸序列。
[0078]SEQ ID NO:3是gp41特异性抗体7H6的重链的氨基酸序列。
[0079]SEQ ID NO:4是gp41特异性抗体7H6的轻链的氨基酸序列。
[0080]SEQ ID NO:5是gp41特异性抗体7N16的重链的氨基酸序列。
[0081]SEQ ID NO:6是gp41特异性抗体7N16的轻链的氨基酸序列。
[0082]SEQ ID NO:7是IGHV3_15*05的重链的氨基酸序列。
[0083]SEQ ID NO:8是IGLV3_19*01的轻链的氨基酸序列。
[0084]SEQ ID NO:9 和 10 是 gp41MPER 内的表位。
[0085]SEQ ID NO: 11是gp41特异性抗体的重链的氨基酸序列。
[0086]SEQ ID NO: 12是gp41特异性抗体的轻链的氨基酸序列。
[0087]SEQ ID NO:13是特异性结合10E8和10E8样抗体的gp41表位的氨基酸序列。
[0088]SEQ ID NO: 14-25是突变体gp41MPER序列的氨基酸序列。
[0089]SEQ ID NO:26是gp41MPER的区域的氨基酸序列。
[0090]SEQ ID NO:27-34是测序引物的核酸序列。
[0091]SEQ ID NO =35-115是示例性的10E8样抗体重链的核酸序列。
[0092]SEQ ID NO:116-145是示例性的10E8样抗体轻链的核酸序列。
[0093]SEQ ID NO:146是gp41特异性抗体的重链的共有氨基酸序列。
[0094]SEQ ID NO: 147-149是10E8单克隆抗体的种系回复突变体的重链的氨基酸序列。
[0095]SEQ ID NO: 150-152是10E8单克隆抗体的种系回复突变体的轻链可变区的氨基酸序列。
[0096]SEQ ID NO: 153-163是gp41特异性抗体的重链可变区的氨基酸序列。
[0097]SEQ ID NO: 164-186是gp41特异性抗体的轻链可变区的氨基酸序列。
[0098]SEQ ID NO:187是gp41特异性抗体的重链可变区的共有氨基酸序列。
[0099]SEQ ID NO:188是gp41特异性抗体的重链可变区的共有氨基酸序列。
[0100]SEQ ID NO:189-192是gp41特异性抗体的重链可变区的氨基酸序列。
[0101]SEQ ID NO:193-196是引物的核酸序列。
[0102]SEQ ID NO: 197-199是gp41特异性抗体的轻链可变区的氨基酸序列。
[0103]SEQ ID NO =200-205是gp41特异性抗体的重链可变区的氨基酸序列。
[0104]SEQ ID NO =205-209是gp41特异性抗体的轻链可变区的氨基酸序列。

【具体实施方式】
[0105]1.术语概述
[0106]除非另有指明，否则技术术语按照常规用法使用。分子生物学中常用术语的定义可以在Benjamin Lewin 的《基因 VII》(Genes VII, Oxford University Press 出版，1999)、Kendrew等主编的《分子生物学百科全书》(The Encyclopedia of Molecular B1logy,Blackwell Science Ltd.出版，1994)和Robert A.Meyers主编的《分子生物学和生物技术:详尽桌面参考书》(Molecular B1logy and B1technology:a Comprehensive DeskReference, VCH Publishers, Inc.出版，1995)和其他类似的参考文献中找到。
[0107]当在本文中使用时，没有具体数量的指称是指单数以及复数形式两者，除非上下文明确指明不是如此。例如，术语“抗原”包括单个或多个抗原，并且可以被当作等同于短语“至少一个抗原”。
[0108]当在本文中使用时，术语“包含”是指“包括”。因此，“包含抗原”是指“包括抗原”并且不排除其他要素。
[0109]还应该理解，除非另有指明，否则为核酸或多肽给出的任何和所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子质量值都是近似值，并且是出于描述的目的而提供的。尽管可以使用与本文中所描述的相似或等同的许多方法和材料，但在下面描述了特别适合的方法和材料。在有冲突的情况下，以本说明书、包括术语的解释为准。此外，材料、方法和实施例仅仅是说明性的，而不打算是限制性的。
[0110]为了便于各种实施方式的评阅，提供了下面的术语解释:
[0111]施用:通过所选途径将组合物导入到对象中。施用可以是局部或全身的。例如，如果所选途径是静脉内，则通过将组合物导入到对象的静脉中来施用组合物。在某些实施例中，将所公开的特异性针对HIV gp41多肽的抗体或其抗原结合片段施用于对象。
[0112]药剂(agent):可用于实现目标或结果的任何物质或物质的任何组合；例如，可用于在对象中抑制HIV感染的物质或物质的组合。药剂包括蛋白质、核酸分子、化合物、小分子、有机化合物、无机化合物或其他目标分子。药剂可以包括治疗药剂(例如抗反转录病毒药剂)、诊断药剂或制药剂。在某些实施方式中，药剂是多肽药剂(例如HIV中和性抗体)或抗病毒药剂。本领域技术人员将会理解，特定药剂可能可用于实现一种以上的结果。
[0113]氨基酸置换:将多肽中的一个氨基酸用不同的氨基酸替换。
[0114]扩增:增加核酸分子(例如RNA或DNA)的拷贝数的技术。扩增的实例是聚合酶链反应，其中将生物样品与一对寡核苷酸引物在允许引物与样品中的核酸模板杂交的条件下相接触。引物在适合的条件下延伸，从模板解离，然后重新退火、延伸并解离，以扩大核酸的拷贝数。扩增的产物可以使用标准技术，通过电泳、限制性内切酶切割图案、寡核苷酸杂交或连接和/或核酸测序来表征。扩增的其他实例包括如美国专利号5，744，311中所公开的链置换扩增，如美国专利号6，033, 881中所公开的无转录等温扩增，如W090/01069中所公开的修复链反应扩增，如EP-A-320308中所公开的连接酶链反应扩增，如美国专利号5，427，930中所公开的间隙填充连接酶链反应扩增，以及如美国专利号6，025，134中所公开的NASBAtmRNA无转录扩增。
[0115]动物:一类活的多细胞有脊椎的生物体，其包括例如哺乳动物和鸟类。术语哺乳动物包括人类和非人类哺乳动物两者。类似地，术语“对象”包括人类和兽医对象两者。
[0116]抗体:基本上由一个或多个免疫球蛋白基因编码的多肽或其抗原结合片段，其特异性结合并识别被分析物(抗原)，例如gp41或gp41的免疫原性片段，例如gp41的近膜区。免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、y、δ、ε和μ恒定区基因以及无数的免疫球蛋白可变区基因。
[0117]抗体作为例如完整的免疫球蛋白和许多通过用各种肽酶消化而产生的经良好表征的抗原结合片段存在。例如，特异性结合于gp41或gp41的片段的Fab、Fv、scFv是gp41特异性结合药剂。scFv蛋白是一种融合蛋白，其中将免疫球蛋白的轻链可变区与免疫球蛋白的重链可变区通过连接物相连，而在dsFv中，所述链已被突变以引入二硫键，以使链的结合稳定。该术语还包括遗传工程改造的形式例如嵌合抗体和异源结合的抗体例如双特异性抗体。也参见，《Pierce 目录和手册》(Pierce Catalog and Handbook), 1994-1995 (PierceChemical C0., Rockford, IL) ；Kuby《免疫学》(Immunology),第三版，W.H.Freeman&C0., NewYork, 1997。
[0118]抗体片段包括但不限于下列片段:(l)Fab，该片段含有通过用木瓜蛋白酶消化整个抗体以得到完整轻链和一条重链的一部分而产生的抗体分子的单价抗原结合片段；(2)Fab’，通过用胃蛋白酶处理整个抗体然后进行还原以得到完整轻链和一部分重链而获得的抗体分子片段；每个抗体分子获得两个Fab’片段；(3) (Fab’)2，通过用胃蛋白酶处理整个抗体并且不进行随后的还原而获得的抗体片段；(4)F(ab’)2，由两个二硫键保持在一起的两个Fab’片段的二聚体；(5)Fv，含有作为两条链表达的轻链可变区和重链可变区的遗传工程改造的片段；以及(6)单链抗体(“SCA”)，含有通过适合的多肽连接物连接的轻链可变区和重链可变区的遗传工程改造的分子，是遗传融合的单链分子。
[0119]当在本文中使用时，术语“抗体”还包括通过整个抗体的修饰产生的抗体片段或使用重组DNA方法从头合成的抗体片段。在某些实施例中，术语抗体包括嫁接在支架上的来自于抗体的一个或多个CDR的氨基酸序列。
[0120]通常，天然存在的免疫球蛋白具有通过二硫键互连的重(H)链和轻(L)链。存在两种类型的轻链，即λ和K。存在5种主要的重链类别(或同种型)，其决定抗体分子的功能活性:IgM, IgD, IgG, IgA和IgE。本公开的抗体可以进行类别转换。
[0121]每条重链和轻链含有恒定区和可变区(所述区也被称为“结构域”)。在数种实施方式中，重链和轻链可变结构域相组合以特异性结合抗原。在其他实施方式中，只需要重链可变结构域。例如，仅由重链构成的天然存在的骆驼抗体在不存在轻链的情况下是有功能和稳定的(参见例如 Hamers-Casterman 等，Nature, 363:446-448, 1993 ；Sheriff 等，Nat.Struct.B1l.,3:733-736, 1996)。轻链和重链可变结构域含有被3个也称为“互补决定区”或“⑶R”的超变区打断的“构架”区(参见例如Kabat等，《免疫学重要的蛋白的序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest),U.S.Department of Health andHuman Services, 1991)。在种内，不同轻链或重链的构架区的序列相对保守。作为组成轻链和重链的组合构架区的抗体构架区起到在三维空间中定位和对齐CDR的作用。
[0122]CDR主要负责结合于抗原的表位。给定CDR的氨基酸序列边界可以使用多种公知的方案中的任一种容易地确定，所述方案包括下述文献中描述的方案:Kabat等(《免疫学重要的蛋白的序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第5 版，Public Health Service, Nat1nal Institutes of Health, Bethesda, MD,1991 ；“Kabat” 编号系统方案)，Al-Lazikani 等(JMB273, 927-948，1997 ;“Chothia” 编号系统方案)和Lefranc等，(“用于免疫球蛋白和T细胞受体可变结构域和Ig超家族V样结构域的 IMGT 独特编号系统”(IMGT unique numbering for immunoglobulin and Tcell receptor variable domains and Ig superfamily V-1ike domains), Dev.Comp.1mmunol.，27:55-77，2003 IMGT” 编号系统方案)。
[0123]每条链的⑶R通常被称为⑶Rl、⑶R2和⑶R3 (从N-端至C-端)，并且通常也通过特定CDR所位于的链来识别。因此，Vh CDR3位于其所存在的抗体的重链的可变结构域中，而' CDRl是来自于其所存在的抗体的轻链的可变结构域的CDRl。轻链CDR有时被称为 CDR L1、CDR L2 和 CDR L3。重链 CDR 有时被称为 CDR Hl、CDR H2 和 CDR H3。
[0124]对“VH”或“VH”的指称是指免疫球蛋白重链的可变区，包括抗体片段例如Fv、SCFv、dsFv或Fab的重链可变区。对“VJ或“VL”的指称是指免疫球蛋白轻链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv或Fab的轻链可变区。
[0125]“单克隆抗体”是由B-淋巴细胞的单一克隆或由转染有单一抗体的轻链和重链基因的细胞产生的抗体。单克隆抗体通过本领域技术人员已知的方法，例如通过从骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合制造形成杂交抗体的细胞来生产。这些融合的细胞和它们的后代被称为“杂交瘤”。单克隆抗体包括人源化单克隆抗体。在某些实施例中，单克隆抗体从对象分离。这样的分离的单克隆抗体的氨基酸序列可以被测定。
[0126]“人源化”免疫球蛋白是包含人类构架区和来自于非人类(例如小鼠、大鼠或合成的)免疫球蛋白的一个或多个CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人类免疫球蛋白被称为“供体”，提供构架的人类免疫球蛋白被称为“受体”。在一种实施方式中，人源化免疫球蛋白中的所有CDR来自于供体免疫球蛋白。恒定区不必定存在，但是如果存在的话，它们必须与人类免疫球蛋白恒定区基本上相同，例如同一性为至少约85-90%，例如约95%或更高。因此，可能除了 CDR之外，人源化免疫球蛋白的所有部分与天然的人类免疫球蛋白序列的相应部分基本上相同。“人源化抗体”是包含免疫球蛋白的人源化轻链和人源化重链的抗体。人源化抗体与提供CDR的供体抗体结合相同的抗原。人源化免疫球蛋白或抗体的受体构架可能具有从供体构架获取的有限数量的氨基酸置换。人源化或其他单克隆抗体可以具有对抗原结合或其他免疫球蛋白功能没有显著影响的其他保守的氨基酸置换。人源化免疫球蛋白可以利用遗传工程来构建(例如参见美国专利号5，585，089)。
[0127]抗体自体反应性:抗体的一种性质，抗体借助所述性质与自体表位反应，所述自体表位是由对象产生的蛋白质和/或脂质的表位。例如，不具有自体反应性的抗体例如10E8不结合来自于对象的细胞例如被HIV感染的细胞和/或在其表面上表达gp41的细胞的膜上存在的脂质。确定抗体是否与自体表位反应的方法对于本领域普通技术人员来说是已知的，并且被描述在本文中(例如在实施例1和8中)。在一个实施例中，使用抗心磷脂测定法或抗核抗原(ANA)测定法来评估抗体的自体反应性。
[0128]抗体支架:是指在其表面上嫁接有来自于目标抗体的一个或多个CDR的异源蛋白质。CDR的移植可以在计算机上，以保留其相关结构和构象的方式进行。为了容纳CDR嫁接物，在受体支架内制造突变。
[0129]抗体组(antibodyome):个体中表达的抗体重链和轻链序列的整个组成成分(repertoire)。个体可以是被病原体例如HIV感染的个体。
[0130]抗原:能够在动物中刺激抗体产生或T细胞应答的多肽，包括被注射或吸收到动物中的多肽。抗原与特异性体液免疫或细胞免疫的产物反应，所述产物包括由异源抗原例如本公开的抗原诱导的产物。“表位”或“抗原决定簇”是指B和/或T细胞对其作出应答的抗原区域。在一种实施方式中，当表位与MHC分子联合递呈时，T细胞对所述表位作出应答。表位可以由毗连氨基酸或通过蛋白质的三级折叠而并置的非毗连氨基酸两者形成。由毗连氨基酸形成的表位在暴露于变性溶剂后通常得以保留，而由三级折叠形成的表位在用变性溶剂处理后通常丢失。表位通常包括采取独特空间构象的至少3个、更通常至少5个、约9个或约8-10个氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括例如X-射线晶体学和核磁共振。
[0131]免疫原性多肽和免疫原性肽是抗原的非限制性实例。在某些实施例中，抗原包括源自于目标病原体例如病毒的多肽。可以在对象中刺激产生针对病毒表达的多肽的抗体或T细胞应答的抗原是病毒抗原。“HIV抗原”可以在对象中刺激产生针对HIV表达的多肽的抗体或T细胞应答。在某些实施方式中，HIV抗原是由HIV表达的多肽例如gpl60或其片段，例如 gpl45、gpl40、gpl20 或 gp41。
[0132]“靶表位”是特异性结合目标抗体例如单克隆抗体的抗原上的特定表位。在某些实施例中，靶表位包括接触目标抗体的氨基酸残基，使得可以通过被确定为与目标抗体发生接触的氨基酸残基来选择靶表位。
[0133]抗反转录病毒药剂:特异性抑制反转录病毒复制或感染细胞的药剂。抗反转录病毒药物的非限制性实例包括进入抑制剂(例如恩夫韦地)、CCR5受体拮抗剂(例如aplaviroc、维立韦罗((vicriviroc)、马拉维若)、反转录酶抑制剂(例如拉米夫定、齐多夫定、阿巴卡韦、替诺福韦、恩曲他滨、依法韦仑)、蛋白酶抑制剂(例如lopivar、利托那韦、雷特格韦、达芦那韦、阿扎那韦)、成熟抑制剂(例如α干扰素、贝韦立马(bevirimat)和vivecon)。
[0134]抗反转录病毒疗法(ART):用于HIV感染的治疗性治疗，包括在疗程期间向HIV感染的个体施用至少一种抗反转录病毒药剂(例如1、2、3或4种抗反转录病毒药剂)。抗反转录病毒药剂的非限制性实例包括进入抑制剂(例如恩夫韦地)、CCR5受体拮抗剂(例如aplaviroc、维立韦罗(vicriviroc)、马拉维若)、反转录酶抑制剂(例如拉米夫定、齐多夫定、阿巴卡韦、替诺福韦、恩曲他滨、依法韦仑)、蛋白酶抑制剂(例如lopivar、利托那韦、雷特格韦、达芦那韦、阿扎那韦)、成熟抑制剂(例如α干扰素、贝韦立马(bevirimat)和vivecon)。ART方案的一个实施例包括用替诺福韦、恩曲他滨和依法韦仑的组合进行治疗。在某些实施例中，ART包括高活性抗反转录病毒疗法(HAART)。
[0135]原子坐标或结构坐标:源自于与在X-射线的单色光束被例如抗原或与抗体复合的抗原的原子(散射中心)衍射后获得的图案相关的数学方程的数学坐标。在某些实施例中，所述抗原可以是处于晶体状态的gp41、gp41:抗体复合物或其组合。使用衍射数据来计算晶体的重复单元的电子密度图。使用电子密度图来建立晶体的单元晶胞内各个原子的位置。在一个实施例中，术语“结构坐标”是指源自于与在X-射线的单色光束被例如采取晶体形式的gp41的原子衍射后获得的图案相关的数学方程的笛卡尔坐标。
[0136]本领域普通技术人员理解，由X-射线晶体学确定的一组结构坐标不是没有标准误差的。出于本公开的目的，使用骨架原子，在叠加时蛋白质骨架原子(N、Ca、C和O)的均方根偏差小于约1.0埃、例如约0.75或约0.5或约0.25埃的任一组结构坐标应该(在不存在与其相反的明确陈述的情况下)被认为是相同的。
[0137]B细胞和记忆性B细胞:B细胞是作为白血细胞(白细胞)的淋巴细胞的一个亚类。成熟的B细胞分化成产生抗体的浆细胞和记忆性B细胞。“B细胞祖细胞”是可以发育成成熟B细胞的细胞。B细胞祖细胞包括干细胞、早期原B细胞、晚期原B细胞、大前B细胞、小前B细胞和未成熟B细胞和过渡B细胞。一般来说，早期原B细胞(其表达例如⑶43或B220)经历免疫球蛋白重链重排而变成晚期原B细胞和前B细胞，并进一步经历免疫球蛋白轻链重排而变成未成熟B细胞。在人类中，未成熟B细胞(例如未成熟的外周过渡B细胞)包括CD38h1、IgD\CD10\002^,0044^,00231°和CDll0细胞。因此，未成熟B细胞包括其中轻链和重链免疫球蛋白基因被重排的B220(CD45R)表达细胞。在一种实施方式中，未成熟B细胞表达⑶45R、II类、IgM、⑶19和⑶40。未成熟B细胞可以发育成成熟B细胞，成熟B细胞可以产生免疫球蛋白(例如IgA、IgG或IgM)。成熟B细胞具有获得的表面IgM和IgD，能够对抗原作出应答，并表达特征性标志物例如⑶21和⑶23 (⑶23htD21hi细胞)。浆细胞是终末分化的B细胞，其是主要的抗体分泌细胞。
[0138]在用抗原刺激B细胞祖细胞(例如前定向小淋巴细胞)后，它分化成母细胞，母细胞分化成未成熟浆细胞，未成熟浆细胞可以分化成成熟浆细胞或记忆性B细胞。“成熟浆细胞”对特定抗原作出应答而分泌免疫球蛋白。
[0139]B细胞可以被药剂例如脂多糖(LPS)或IL-4和针对IgM的抗体活化。B细胞和B细胞祖细胞的常见生物来源包括骨髓、外周血、脾脏和淋巴结。
[0140]“记忆性B细胞”是经历同种型转换和体细胞超变的B细胞，其一般在二次免疫应答(在初次暴露之后的后续抗原暴露)期间被发现，但是也可以在初次抗原应答期间被检测到。记忆性B细胞的产生通常需要辅助性T细胞。记忆性B细胞的发育在淋巴滤泡的生发中心(GC)中发生，在那里，据推测在辅助性T细胞的影响下，抗原驱动的淋巴细胞经历体细胞超变和亲和性选择。通常，记忆性B细胞在其细胞表面上表达高亲和性的抗原特异性免疫球蛋白(B细胞受体)。在一种实施方式中，记忆性B细胞包括表达⑶19但是不表达IgA, IgD 或 IgM 的细胞(CD19+IgA_IgD_IgM_ 细胞)。
[0141]双特异性抗体:由两个不同的抗原结合结构域构成并因此结合于两个不同的抗原性表位的重组分子。双特异性抗体包括两个抗原结合结构域以化学或遗传方式连接的分子。抗原结合结构域可以使用连接物连接。抗原结合结构域可以是单克隆抗体、抗原结合片段(例如Fab、scFv)、eAd、双特异性单链抗体或其组合。双特异性抗体可以包括一个或多个恒定结构域，但是不必定包括恒定结构域。双特异性抗体的实例是一种双特异性单链抗体，其包括与特异性结合于gp41之外的抗原的scFv联结(通过肽连接物联结)的特异性结合于gp41的scFv。另一个实例是一种双特异性抗体,其包括与特异性结合于gp41之外的抗原的scFv联结的特异性结合于gp41的Fab。
[0142]B细胞全部组成成分:样品中或对象中特异性针对目标抗原的B细胞。
[0143]⑶40:抗原递呈细胞中存在的其活化所需的一种共刺激蛋白。也称为⑶154的CD40配体(CD40L)与CD40的结合活化抗原递呈细胞。已发现该受体在介导广泛的各种免疫和炎性应答中是必不可少的，所述免疫和炎性应答包括T细胞依赖性免疫球蛋白类别转换、记忆性B细胞发育和生发中心形成。CD40的示例性氨基酸序列和编码CD40的示例性mRNA序列可以在GENBANK?登记号NM_001250(2012年6月10日)中找到，其通过参考并入本文。
[0144]⑶40配体(⑶40L):—种也被称为⑶154的配体，其在活化的T细胞上表达，并且是肿瘤坏死分子超家族的成员。它结合于抗原递呈细胞上的CD40，取决于靶细胞类型而引起许多效应。总的来说，CD40L发挥共刺激分子的作用，并与抗原递呈细胞上MHC分子对T细胞受体的刺激相结合而在抗原递呈细胞中引起活化。总的来说，CD40L具有三个结合配偶体:⑶40，α5β1整合蛋白和a IIbP 3。⑶154表达在T细胞的表面上。它通过结合B细胞表面上的CD40来调控B细胞的功能。CD40的示例性氨基酸序列和编码CD40的示例性mRNA序列可以在GENBAN丨<?登记号NM_000074.2(2012 年6月10日)中找到，其通过参考并入本文。
[0145]嵌合抗体:包括源自于两种不同抗体的序列的抗体，所述两种不同抗体通常是不同物种的。在某些实施例中，嵌合抗体包括来自于一种人类抗体的一个或多个CDR和/或构架区以及来自于另一种人类抗体的CDR和/或构架区。在某些实施例中，嵌合抗体通过将一个或多个CDR嫁接到抗体支架中而产生。
[0146]克隆变体:在存在与种系相比具有相同的突变、相同的VDJ或VJ基因用法以及相同的D和J长度的V区的情况下，具有一个或多个核苷酸或氨基酸差异的任何序列。“种系”序列意欲是指不含突变例如体细胞突变的抗体/免疫球蛋白(或其任何片段)的编码序列。同源性百分数表示在与抗原接触后任何类型的重链部分所经历的突变事件的指示。
[0147]计算机可读存储介质:可以被计算机直接读取和访问以使其适用于计算机系统的任一种或多种介质。这样的介质包括但不限于:磁存储介质例如软盘、硬盘存储介质和磁带；光存储介质例如光盘或CD-ROM ；电存储介质例如RAM和ROM ；以及这些类型的混合体例如磁/光存储介质。
[0148]计算机系统:可用于分析原子坐标数据和/或使用原子坐标数据设计抗原或分析氨基酸或核酸序列例如比较两个或更多个序列以计算序列相似性和/或趋异性的硬件。基于计算机的系统的最少硬件通常包括中央处理器(CPU)，输入装置例如鼠标、键盘等，输出装置和数据存储装置。理想情况下，提供监视器以将结构数据可视化。数据存储装置可以是RAM或用于访问计算机可读介质的其他机构。这样的系统的实例是可以从SiliconGraphics Incorporated 和 Sun Microsystems 获得的运行基于 Unix 的 Windows NT 或 IBMOS/2操作系统的微型计算机工作站。
[0149] 偶联物:连接在一起例如通过共价键连接在一起的两个分子的复合物。在一种实施方式中，将抗体连接到效应子分子；例如，将特异性结合于gp41的抗体共价连接到效应子分子或毒素。连接可以通过化学或重组手段来实现。在一种实施方式中，连接是化学的，其中抗体部分与效应子分子之间的反应产生在这两个分子之间形成的共价键，以形成一个分子。在抗体与效应子分子之间可以任选地包含肽连接物(短的肽序列)。由于偶联物可以从具有独立的官能团的两个分子例如抗体和效应子分子来制备，因此它们有时也被称为“嵌合分子”。在一种实施方式中，连接到效应子分子的抗体被进一步联结到脂质或其他分子如蛋白质或肽，以增加它在体内的半衰期。
[0150]接触:置于直接物理结合之下；包括以固体和液体两种形式，其可以在体内或体外发生。接触包括一种分子与另一种分子之间的接触，例如一种多肽例如抗原的表面上的氨基酸接触另一种多肽例如抗体。多肽之间的接触可以包括两种或更多种多肽的氨基酸之间的直接接触(例如多肽之间的氢键或范德华力相互作用)，以及在多肽之间产生具有降低的溶剂可进入性的界面的其他多肽间相互作用(不是界面的所有氨基酸都必需形成直接结合)。在某些实施方式中，直接接触是指具体地与序列中的一个或多个指定残基但是不与序列中的其他残基形成氢键或范德华相互作用。本领域的普通技术人员熟悉确定多肽之间的接触的方法(参见例如实施例1)。接触还可以包括例如通过将抗体放置成与细胞直接物理结合来接触细胞。在某些实施方式中，抗体(例如10E8)仅接触抗原上的表位例如本文中所描述的gp41上的10E8表位的特定残基。
[0151]对照:参比标准品。在某些实施方式中，对照是从健康患者获得的样品。在其他实施方式中，对照是从被诊断患有HIV感染的患者获得的组织样品。在其他实施方式中，对照是历史对照或标准参比值或值的范围(例如以前测试的对照样品，例如具有已知预后或结果的HIV患者组，或者代表基线或正常值的样品组)。
[0152]受试样品与对照之间的差异可以是增加，或者相反是减小。所述差异可以是定性差异或定量差异，例如统计学显著的差异。在某些实施例中，差异是相对于对照增加或减少至少约5%，例如至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约100%、至少约150%、至少约200%、至少约250%、至少约300%、至少约350%、至少约400%、至少约500%或超过500%。
[0153]细胞因子/白介素(IL):在纳摩尔至皮摩尔浓度下起到体液调控物的作用并且在正常或病理条件下调节个体细胞和组织的功能活性的一组多样性的可溶蛋白和肽的通用名称。这些蛋白还直接介导细胞之间的相互作用，并调控在细胞外环境中发生的过程。许多生长因子和细胞因子通过防止程序性细胞死亡而起到细胞存活因子的作用。细胞因子和白介素包括天然存在的肽和保留了全部或部分生物活性的变体两者。尽管在本说明书中描述了特定的细胞因子/白介素，但它们不限于具体公开的肽。
[0154]细胞毒性:分子例如免疫毒素对意欲靶向的细胞而不是生物体的其余细胞的毒性。相反，在一种实施方式中，术语“毒性”是指免疫毒素对意欲通过免疫毒素的靶向部分来靶向的细胞之外的细胞的毒性，并且术语“动物毒性”是指通过免疫毒素对意欲被免疫毒素靶向的细胞之外的细胞的毒性而引起的免疫毒素对动物的毒性。
[0155]可检测标志物:与第二分子例如抗体直接或间接偶联以便于第二分子的检测的可检测分子(也被称为标记物)。例如，可检测标志物可能能够通过ELISA、分光光度法、流式细胞术、显微术或诊断成像技术(例如CT扫描、MR1、超声、光纤检查和腹腔镜检查)来检测。可检测标志物的具体的非限制性实例包括荧光团、荧光蛋白、化学发光剂、酶连接、放射活性同位素和重金属或化合物(例如用于通过MRI检测的超顺磁氧化铁纳米晶体)。在一个实施例中，“标记的抗体”是指在抗体中掺入另一个分子。例如，标记物是可检测标志物，例如掺入放射性标记的氨基酸或附连于可以通过标记的亲和素(例如，含有可以通过光学或比色方法检测的荧光标志物或酶活性的链霉亲和素)检测的生物素基部分的多肽。标记多肽和糖蛋白的各种方法在本领域中是已知的，并且可以使用。用于多肽的标记物的实例包括但不限于下列:放射性同位素或放射性核素(例如35S或131I)，荧光标记物(例如荧光素异硫氰酸酯(FITC)、罗丹明、镧系元素磷光体)，酶标记物(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)，化学发光标志物，生物素基团，被第二报告物识别的预定的多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)或磁性试剂例如钆螯合物。在某些实施方式中，通过各种长度的间隔臂来附连标记物，以降低潜在的空间位阻。在例如Sambrook等(《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning:ALaboratory Manual), Cold Spring Harbor, New York, 1989)和 Ausubel 等(《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular B1logy), John ffiley&Sons, New York, 1998)中讨论了使用可检测标志物的方法和适合于各种目的的可检测标志物的选择指南。
[0156]检测:鉴定某物的存在、出现或事实。检测的一般性方法对于本领域技术人员来说是已知的，并且可以用本文中公开的方案和试剂来补充。例如，本文中包含了在对象中检测表达gp41的细胞的方法。
[0157]DNA测序:测定给定DNA分子的核苷酸顺序的过程。“深度测序”的一般性特征是例如通过聚合酶链反应扩增遗传物质，然后将扩增产物连接到固体表面。然后平行地进行被扩增的靶遗传物质的测序，并通过计算机捕获序列信息。一般来说，测序可以使用自动化Sanger测序(AB13730xl基因组分析仪)、固体支持物上的焦磷酸测序(454测序，Roche)、使用可逆终止的通过合成的测序(ILLUMINA?基因组分析仪)、通过连接的测序(ABI SOLiD? )或使用虚拟终止物的通过合成的测序(HELISC0PE? )来进行。
[0158]在某些实施方式中，DNA测序使用由Frederick Sanger开发的并因此被称为“基于Sanger的测序”或“SBS”的链终止法来进行。这种技术使用修饰的核苷酸底物，利用DNA合成反应的序列特异性终止。使用在特定区域处与模板互补的短的寡核苷酸引物，在模板DNA上的该特定位点处开始延伸。使用DNA聚合酶，在四种脱氧核苷酸碱基(DNA结构单元)以及低浓度的链终止核苷酸(最常见为双脱氧核苷酸)的存在下延伸寡核苷酸引物。链终止核苷酸被DNA聚合酶的有限掺入产生了一系列仅在存在该特定核苷酸的位置处终止的相关DNA片段。然后将所述片段在聚丙烯酰胺凝胶上或在填充有粘稠聚合物的细玻璃管(毛细管)中通过电泳按尺寸进行分离。使用标记的引物的一种可替选方案是使用标记的终止物来代替；这种方法通常被称为“染料终止物测序”。
[0159]“焦磷酸测序”是一种基于阵列的方法,其已被454Life Sciences (Branford, CT)商业化。在基于阵列的方法的某些实施方式中，将单链DNA退火到珠子，并通过EmPCR?进行扩增。然后将这些结合DNA的珠子与在ATP存在下产生光的酶一起置于光纤芯片上的孔中。当将游离核苷酸在该芯片上洗过时，随着PCR扩增的发生以及当核苷酸与它们的互补碱基对联结时ATP的产生，产生了光。一种(或多种)核苷酸的添加引起反应，其产生被例如仪器内的电荷耦合器件(CCD)相机记录的光信号。信号强度与单次核苷酸流动中掺入的核苷酸的数目、例如同聚物的跨度成正比。
[0160]有效量:药剂(例如⑶40L、IL-21或IL_2)单独或与一种或多种其他药剂一起引起所需响应的量。
[0161]效应子分子:嵌合分子中旨在对所述嵌合分子所靶向的细胞具有所需效应的部分。效应子分子也被称为效应子部分、治疗药剂或诊断药剂或类似术语。
[0162]表位:抗原决定簇。它们是分子上具有抗原性的特定化学基团或肽序列，以使它们引发特异性免疫应答，例如表位是B和/或T细胞对其作出应答的抗原区域。在某些实施例中，所公开的抗体特异性结合于来自于HIV的gp41的表面上的表位。
[0163]表位可以由毗连氨基酸或通过蛋白质的三级折叠而并置的非毗连氨基酸两者形成。由毗连氨基酸形成的表位在暴露于变性溶剂之后通常得以保留，而由三级折叠形成的表位在用变性溶剂处理后通常丢失。表位通常包括采取独特空间构象的至少3个、更通常至少5个、约9个或约8-10个氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括例如X-射线晶体学和核磁共振。
[0164]Fe多肽:包含抗体的恒定区而不包含第一恒定区免疫球蛋白结构域的多肽。Fe区通常是指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，以及IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域。Fe区还可以包括在这些结构域N-端的一部分或全部柔性铰链。对于IgA和IgM来说，Fe区可以包括或可以不包括尾片，并且可以被J链结合或者可以不被J链结合。对于IgG来说，Fe区包括免疫球蛋白结构域C Y2和C Y3以及Cy I与C Y 2之间的铰链的下方部分。尽管Fe区的边界可以变化，但人类IgG重链Fe区通常被定义为在其羧基端包括残基C226或P230，其中编号系统是根据Kabat中的EU索引。对于IgA来说，Fe区包括免疫球蛋白结构域C α 2和C α 3以及C α I与C α 2之间的铰链的下方部分。在Fe区的定义中涵盖Fe区的功能上等同的类似物和变体。Fe区的功能上等同的类似物可以是变体Fe区，其相对于野生型或天然存在的Fe区而言包括一个或多个氨基酸修饰。变体Fe区与天然存在的Fe区具有至少50%的同源性，例如约80%和约90%或至少约95%的同源性。Fe区的功能上等同的类似物可以包括向蛋白的N-端或C-端添加或从其缺失的一个或多个氨基酸残基，例如不超过30个或不超过10个氨基酸残基的添加和/或缺失。Fe区的功能上等同的类似物包括可操作地连接到融合配偶体的Fe区。Fe区的功能上等同的类似物必须包括如上所定义的构成Fe区的所有Ig结构域的绝大部分；例如，本文中所定义的IgG和IgA Fe区必须包括编码CH2的序列的绝大部分和编码CH3的序列的绝大部分。因此，CH2结构域自身或CH3结构域自身不被认为是Fe区。Fe区可以是指分离的该区域或在Fe融合多肽(免疫粘附素，参见下文)的背景中的该区域。
[0165]构架区:位于⑶R之间的氨基酸序列。包括可变轻链和可变重链构架区。构架区起到以适合于抗原结合的取向容纳CDR的作用。
[0166]gp41:一种特定的HIV蛋白。HIV-1的包膜蛋白最初被合成为大小为845-870个氨基酸的较长的前体蛋白，该前体蛋白被命名为gpl60。gpl60形成同源三聚体并在高尔基体内经历糖基化。在体内，它随后被细胞的蛋白酶切割成gpl20和gp41。gp41的实例的氨基酸序列被显示在GENBANK?登记号CAD20975中(在2009年10月16日可获得的)，其通过参考并入本文。应该理解，gp41的序列可以不同于GENBANK?登记号CAD20975中给出的序列。gp41含有跨膜结构域并通常保持三聚体构型；它以非共价方式与gpl20相互作用。
[0167] HIV包膜蛋白(Env):HIV包膜蛋白最初被合成为大小为845-870个氨基酸的较长的前体蛋白，该前体蛋白被命名为gpl60。gpl60形成同源三聚体并在高尔基体内经历糖基化。在体内，它随后被细胞的蛋白酶切割成gpl20和gp41。gpl20含有HIV包膜糖蛋白复合物的大多数外部的、表面暴露的结构域，并且正是gpl20结合于细胞CD4受体和细胞趋化因子受体(例如CCR5)两者。gp41含有跨膜结构域并保持三聚体构型；它以非共价方式与gpl20相互作用。
[0168]宿主细胞:载体可以在其中繁殖并且它的DNA可以在其中表达的细胞，例如，本公开的抗体可以在宿主细胞中表达。细胞可以是原核或真核的。该术语还包括对象宿主细胞的任何后代。应该理解，由于可能存在在复制期间发生的突变，因此所有后代不一定与亲代细胞相同。然而，当使用术语“宿主细胞”时，这样的后代被包括在内。
[0169]人免疫缺陷病毒(HIV):在人类中引起免疫抑制(HIV疾病)并产生被称为获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的疾病复合群的一种反转录病毒。“HIV疾病”是指在通过抗体或蛋白质免疫印迹研究所确定的被HIV病毒感染的人中公认的一系列征兆和症状(包括机会感染的发生)。与这种疾病相关的实验室结果包括T细胞的进行性减少。HIV包括I型HIV(HIV-1)和2型HIV (HIV-2)。被用作动物模型的相关病毒包括猿猴免疫缺陷病毒(SIV)和猫免疫缺陷病毒(FIV)。用HAART治疗HIV-1有效地降低病毒载量并在被感染的个体中改善HIV-1感染的影响。
[0170]HXB2编号系统:一种用于HIV蛋白和核酸序列的参比编号系统，其使用HIV-1HXB2株的序列作为所有其他HIV株的序列的参比。本领域普通技术人员熟悉HXB2编号系统，并且在 “HIV 中相对于 HXB2CG 的编号位置”(Numbering Posit1ns in HIV Relative toHXB2CG)，Bette Korber等，《人类反转录病毒和AIDS1998:核酸和氨基酸序列的汇编和分析》(Human Retroviruses and AIDS, 1998:A Compilat1n and Analysis of NucleicAcid and Amino Acid Sequences), Korber B,Kuiken CL, Foley B, Hahn B, McCutchanF, Mellors JW 和 Sod roski J ilS? Theoretical B1logy and B1physics Group, LosAlamos Nat1nal Laboratory, Los Alamos, NM中描述了这种系统,该文献以其全部内容通过参考并入本文。HXB2也被称为:HXBc2，表示HXB克隆2 ;HXB2R，在Los Alamos HIV数据库中，其中R表示修订，因为它相对于原始的HXB2序列略有修订；以及GENBANK?中的HXB2CG，表示HXB2完整基因组。在本文公开的gp41多肽中使用的编号系统是相对于HXB2编号系统方案而言的。
[0171]IgA:属于基本上由公认的免疫球蛋白α基因编码的抗体类型的一种多肽。在人类中，这一类型或同种型包括IgA1和IgA2。IgAn抗体可以作为单体、以二聚体形式为主的聚合体(被称为PlgA)和分泌型IgA存在。野生型IgA的恒定链在其C-端处包含被称为尾片(tp)的18个氨基酸的延长部。聚合的IgA由浆细胞分泌，其带有被称为J链的15-kDa的肽，所述J链将两个IgA单体通过尾片中保守的半胱氨酸残基相连。
[0172]IgG:属于基本上由公认的免疫球蛋白Y基因编码的抗体类型或同种型的一种多肽。在人类中，这一类型包括IgG1' IgG2, IgG3和IgG4。
[0173]免疫复合物:抗体与可溶性抗原的结合形成免疫复合物。免疫复合物的形成可以通过本领域技术人员已知的常规方法例如免疫组织化学、免疫沉淀、流式细胞术、免疫荧光显微术、ELISA、免疫印迹(例如蛋白质免疫印迹)、磁共振成像、CT扫描、X-射线和亲和层析来检测。所选的抗体的免疫结合性质可以使用本领域中公知的方法来定量。
[0174]免疫粘附素:蛋白质与免疫球蛋白的Fe区的分子融合体，其中所述免疫球蛋白保留特定性质例如Fe受体结合和增加的半衰期。Fe融合体组合了免疫球蛋白的Fe区与融合配偶体，所述配偶体一般可以是任何蛋白、多肽、肽或小分子。在一个实施例中，免疫粘附素包括免疫球蛋白Y I重链恒定区的铰链、CH2和CH3结构域。在另一个实施例中，免疫粘附素包括IgG的CH2和CH3结构域。
[0175]免疫原:能够在哺乳动物例如被病原体感染或具有病原体感染的风险的哺乳动物中诱导免疫应答的化合物、组合物或物质(例如蛋白质或其部分)。免疫原的施用可以引起针对目标病原体的保护性免疫和/或前瞻性免疫。在某些实施例中，免疫原是HIV抗原。免疫原的实例包括但不限于肽、脂质、多糖、其组合，以及含有抗原决定簇例如被免疫细胞所识别的抗原决定簇的核酸。在某些实施例中，免疫原包括源自于目标病原体的肽。示例性的病原体包括细菌、真菌、病毒和寄生虫。在特定实施例中，免疫原源自于HIV，例如源自于HIV的gp41多肽或其抗原性片段。
[0176]免疫探针:可用于从血清、包括从人类患者血清中筛选针对特定表位的抗体的分子。表位支架以及相关的点突变体可以在针对表位嫁接物的抗体的正和负筛选两者中用作免疫探针。在某些实施例中，免疫探针是gpl20的工程化改造的变体。
[0177]免疫反应性条件:包括对下述条件的指称，所述条件允许针对特定表位产生的抗体以与基本上所有其他表位的结合相比可检测地更高的程度结合于所述特定表位，和/或基本上排除与基本上所有其他表位的结合。免疫反应性条件依赖于抗体结合反应的形式，并且通常是在免疫测定法流程中使用的条件或在体内遇到的条件。对于免疫测定法的形式和条件的描述，参见Harlow&Lane，同上。在方法中使用的免疫反应性条件是“生理条件”，其包括对通常存在于活的哺乳动物或哺乳动物细胞内的条件(例如温度、摩尔渗透压浓度和pH)的指称。尽管认识到某些器官经受极端条件，但器官内和细胞内环境一般在pH7左右(例如从PH6.0至pH8.0,更通常为pH6.5至7.5)，含有水作为主要溶剂，并在高于(TC并低于50°C的温度下存在。摩尔渗透压浓度在支持细胞存活和增殖的范围内。
[0178]抑制或治疗疾病:在例如具有疾病例如获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的风险的对象中抑制疾病或病症的完全发展。“治疗”是指在疾病或病理状况开始发展后改善疾病或病理状况的征兆或症状的治疗性干预。对于疾病或病理状况来说，术语“改善”是指治疗的任何可观察到的有益效果。所述有益效果可以表现为例如在易感对象中疾病的临床症状的延迟发作、疾病的一些或所有临床症状的严重性的降低、疾病的较缓慢进展、病毒载量的降低、对象的总体健康和安康的改进，或表现为本领域中公知的特异性针对特定疾病的其他参数。“预防性”治疗是出于降低发生疾病的风险的目的而向未表现出疾病征兆或仅仅表现出早期征兆的对象施用的治疗。
[0179]白介素-2(IL_2):1L_2是T细胞的生长和功能所必需的一种细胞因子。结合于T细胞受体(TCR)的抗原刺激IL-2的分泌以及IL-2受体IL-2R的表达。随后，IL-2/IL-2R的相互作用通过激活特定基因的表达来刺激抗原选择的细胞毒性T细胞的生长、分化和存活。因此，IL-2是T细胞免疫记忆的发生所必需的,所述免疫记忆依赖于抗原选择的T细胞克隆的数量扩增和功能。在胸腺中的T细胞发育期间，IL-2对于被称为调节性T细胞的T细胞亚类的成熟来说也是必需的。人类IL-2的示例性的氨基酸序列被提供在GENBANK?登记号NM_000586(2012年6月10日)中，其通过参考并入本文。
[0180]白介素-21(IL_21):从源自于活化的⑶3+T细胞的cDNA文库克隆到的一种细胞因子(Parrish-Novak 等，Nature408:57-63，2000)。IL_21cDNA 编码与 IL-2 和 IL-15 最密切相关的131个氨基酸的蛋白的分泌蛋白。IL-21基因已被作图在人类染色体4q26_q27中IL-2基因附近。
[0181]已证实，IL_21mRNA在活化的⑶4+细胞中表达，但不在其他T细胞、B细胞或单核细胞中表达(Parrish-Novak等，Nature408:57-63，2000)。然而，已证实，IL-21刺激受到CD40抗原的交联所刺激的B细胞的增殖以及除了抗IgM抗体之外还受到IL-4刺激的B细胞的增殖。据显示，IL-21还刺激由⑶3的结合所介导的幼稚型(⑶45RA(+))细胞的增殖。还已显示，IL-21刺激骨髓祖细胞向细胞的增殖，并在IL-15存在下提高NK细胞标志物⑶56的表达。(对于综述来说，参见 Horst Ibelgaufts 的 COPE:Cytokines Online PathfinderEncyclopedia，可以在因特网上获得)。示例性的人类IL-21的氨基酸序列在已公布的美国专利申请号2003/0003545中被显示为SEQ ID NO: 1，所述专利申请通过参考并入本文。含有IL-21的全部或大部分序列的代表性克隆(被命名为HTGED19)于1998年3月5日保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collect1n) ( “ATCC”)，并被给予ATCC保藏号209666(参见例如已公布的美国专利申请号2003/0003545)。
[0182]已分离到IL-21受体，并发现它由⑶23+B细胞、B细胞系、T细胞白血病系和NK细胞系表达。该受体基因已被作图于人类染色体16pl2 (参见Parrish-Novak等，Nature408:57-63, 2000 ；Ozaki 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA97:11439-11444，2000)。
[0183]白介素15(IL_15):—种与IL_2具有结构相似性的细胞因子。IL-15结合于IL_2/IL-15 β链(⑶122)和共同的Y链(Y-C，⑶132)并通过它们传导信号。IL-15在病毒感染后由单核吞噬细胞(和某些其他细胞)分泌。这种细胞因子诱导主要功能是杀死病毒感染的细胞的先天免疫系统的细胞、自然杀伤细胞的细胞增殖。
[0184]分离的:“分离的”生物组分(例如抗体如特异性结合gp41的抗体、核酸、肽、蛋白质或抗体)已与天然存在所述组分的生物体细胞中的其他生物组分基本上分离开，脱离开所述其他生物组分而被生产出来，或从所述其他生物组分中纯化出来，所述其他生物组分例如为其他染色体DNA和RNA以及染色体外DNA和RNA以及蛋白质。因此，已被“分离的”核酸、肽和蛋白质包括通过标准的纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还涵盖通过在宿主细胞中重组表达而制备的核酸、肽和蛋白质，以及化学合成的核酸或多肽。在某些实施例中，抗体例如特异性针对gp41的抗体可以被分离，例如从HIV感染的对象分离。
[0185]“分离的”细胞是已从组织的其他细胞组分中纯化出来的细胞。细胞可以通过机械(例如使用FACS)和/或酶方法来分离。在数种实施方式中，分离的细胞群体(例如B细胞全部组成成分)包含高于约80%、约85%、约90%、约95%或高于约99%的目标细胞。在另一种实施方式中，分离的细胞群体是其中不能检测到不同表型的其他细胞的群体。在其他实施方式中，分离的细胞群体是包含少于约20 %、约15 %、约10 %、约5 %或少于约I %的目标细胞之外的不同表型细胞的细胞群体。
[0186]Kd:给定的相互作用例如多肽配体相互作用或抗体抗原相互作用的解离常数。例如，对于抗体(例如本文中公开的抗体)与抗原(例如gp41)的生物分子相互作用来说，它是生物分子相互作用的各个组分的浓度除以复合物的浓度。
[0187] 连接物:可用于将两个分子连接成一个连续分子，例如将效应子分子连接到抗体的一种双功能分子。在某些实施方式中，偶联物包括效应子分子或可检测标志物与抗体之间的连接物。在某些实施方式中，连接物在细胞内条件下是可切割的，使得在细胞内环境中连接物的切割将效应子分子或可检测标志物从抗体上释放出来。在其他实施方式中，连接物是不可切割的，效应子分子或可检测标志物可以例如通过抗体降解来释放。在某些情况下，连接物是抗体结合片段(例如Fv片段)内起到将可变重链间接键合到可变轻链的作用的肽。
[0188]术语“偶联”、“联结”、“键合”或“连接”是指使两个多肽成为一个连续的多肽分子，将放射性核素或其他分子共价附连到多肽，例如特异性结合gP41的抗体或其抗体结合片段。在特定情况下，该术语包括对将配体例如抗体部分联结到效应子分子的指称。连接可以通过化学或重组手段进行。“化学手段”是指抗体部分与效应子分子之间的反应，使得在两个分子之间存在形成的共价键，以形成一个分子。
[0189]gp41的膜近端外部区域(MPER):紧邻gp41的跨膜区的N-端的区域。MPER是高度疏水的(50%的残基是疏水的)，并且在许多HIV进化枝中是高度保守的(Zwick，M.B.等，JVirol, 75(22):p.10892-905，2001)。HIV_lgp41的保守的MPER是两种中和性人类单克隆抗体2F5和4E10的靶标。已显示，2F5表位的核心是ELDKWAS (SEQ ID NO:9)。对于该表位来说，发现残基D、K和W对于2F5的识别来说是最关键的。4E10表位的核心NWFDIT (SEQ IDNO:10)作图于紧邻gp41胞外结构域上2F5表位的C-端。
[0190]中和性抗体:通过与感染因子上的特异性抗原结合来降低感染因子的感染滴度的一种抗体。在某些实施例中，感染因子是病毒。在某些实施例中，特异性针对gp41的抗体中和HIV的感染滴度。“广泛中和性抗体”是结合相关抗原并抑制所述相关抗原的功能的一种抗体，所述相关抗原例如为与抗原的抗原性表面具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的抗原。对于来自于病原体例如病毒的抗原来说，抗体能够结合来自于超过一个类型和/或亚类的病原体的抗原，并抑制所述抗原的功能。例如，对于人免疫缺陷病毒来说，抗体可以结合抗原例如来自于超过一个进化枝的gp41，并抑制所述抗原的功能。在一种实施方式中，针对HIV的广泛中和性抗体与针对HIV的其他抗体的区别在于它们中和循环中的高百分率的许多类型的HIV。
[0191]核酸:由通过磷酸二酯键、其相关的天然存在的结构变体及其合成的非天然存在的类似物相连的核苷酸单元(核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、其相关的天然存在的结构变体及其合成的非天然存在的类似物)所构成的聚合物。因此，该术语包括其中核苷酸以及它们之间的连键包括非天然存在的合成类似物的核苷酸聚合物，所述非天然存在的合成类似物例如并且不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-0-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)等。这样的多核苷酸可以例如使用自动化DNA合成仪来合成。术语“寡核苷酸”通常是指短的多核苷酸，一般不超过约50个核苷酸。应该理解，当核苷酸序列用DNA序列(即A、T、G、C)表示时，这也包括RNA序列(即A、U、G、C)，其中“U”代替“T”。
[0192]在本文中使用常规标注法来描述核苷酸序列:单链核苷酸序列的左手末端是5’ -末端；双链核苷酸序列的左手方向被称为5’ -方向。核苷酸向新生RNA转录本的5’至3’添加方向被称为转录方向。具有与mRNA相同的序列的DNA链被称为“编码链”;在具有与从该DNA转录的mRNA相同的序列的DNA链上并且位于RNA转录本的5’-末端的5’方向的序列被称为“上游序列”;在具有与RNA相同的序列的DNA链上并且位于编码RNA转录本的3’末端的3’方向的序列被称为“下游序列”。
[0193]“cDNA”是指单链或双链形式的与mRNA互补或相同的DNA。
[0194]“编码”是指多核苷酸例如基因、cDNA或mRNA中的核苷酸的特定序列的固有性质，所述特定序列用作生物过程中其他聚合物和大分子的合成模板，所述聚合物和大分子具有确定的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列以及由此产生的生物学性质。因此，如果由基因产生的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码蛋白质。编码链和非编码链两者可以被称为编码蛋白质或者基因或cDNA的其他产物，所述编码链的核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常被提供在序列表中，所述非编码链被用作所述基因或cDNA的转录模板。除非另有规定，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括互为简并形式并且编码同一氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可能包括内含子。
[0195]“重组核酸”是指具有在天然情况下不联结在一起的核苷酸序列的核酸。这包括包含扩增或组装的核酸并且可用于转化适合的宿主细胞的核酸载体。包含重组核酸的宿主细胞被称为“重组宿主细胞”。然后基因在重组宿主细胞中表达，以产生例如“重组多肽”。重组核酸也可以起到非编码功能(例如启动子、复制起点、核糖体结合位点等)。
[0196]如果序列为第一序列的多核苷酸与序列为第二序列的多核苷酸特异性杂交，则相对于所述第二序列来说，所述第一序列是“反义的”。
[0197]可操作地连接:当第一核酸序列被放置成与第二核酸序列功能上相关时，所述第一核酸序列是与所述第二核酸序列可操作地连接的。例如，如果启动子例如CMV启动子影响编码序列的转录或表达，则所述启动子是与所述编码序列可操作地连接的。一般来说，可操作地连接的DNA序列是毗连的，并且在需要时将两个蛋白质编码区联结在同一阅读框中。
[0198]药剂(pharmaceutical agent):当适合地施用于对象或细胞时能够引起所需的治疗或预防效果的化学化合物或组合物。在某些实施例中，药剂包括一种或多种本公开的抗体。
[0199]药学可接受的载体:所使用的药学可接受的载体是常规的。《雷明顿制药学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences, E.ff.Martin, Mack Publishing C0., Easton, PA,第19版，1995)描述了适合于本文所公开的抗体的药物递送的组合物和制剂。
[0200]一般来说，载体的性质取决于所使用的具体施用方式。例如，肠胃外制剂通常包括可注射的流体作为介质，所述可注射的流体包括药学和生理上可接受的流体例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等。对于固体组合物(例如粉剂、丸剂、片剂或胶囊形式)来说，常规的无毒性固体载体可以包括例如药用级甘露糖醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学中性载体之外，待施用的药物组合物还可以含有少量无毒性辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和PH缓冲剂等，例如乙酸钠或失水山梨糖醇单月桂酸酯。
[0201]多肽:任何氨基酸链，不论长度如何或是否具有翻译后修饰(例如糖基化或磷酸化)。在一种实施方式中，多肽是gp41多肽。在一种实施方式中，多肽是本公开的抗体或其片段。“残基”是指通过酰胺键或酰胺键模拟物而被掺入到多肽中的氨基酸或氨基酸模拟物。多肽具有氨基端(N-端)末端和羧基端(C-端)末端。
[0202]启动子:启动子是指导核酸转录的一组核酸控制序列。启动子包括转录起始位点附近的必需核酸序列，例如在聚合酶II型启动子的情况下的TATA元件。启动子还任选地包括可以位于距转录起始位点多达数千碱基对处的远端增强子或抑制子元件。组成型和诱导型两种启动子都被包括在内(参见例如Bitter等，Methods inEnzymologyl53:516-544, 1987)。
[0203]启动子的具体的非限制性实例包括源自于哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)，或者可以使用源自于哺乳动物病毒的启动子(例如反转录病毒长末端重复序列、腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子)。还可以使用通过重组DNA或合成技术产生的启动子。可以将多核苷酸插入到含有启动子序列的表达载体中，所述启动子序列促进宿主中所插入的遗传序列的有效转录。表达载体通常含有复制起点、启动子以及允许被转化的细胞的表型选择的特定核酸序列。
[0204]纯化的:术语纯化的不要求绝对纯度；相反，它旨在作为相对术语。因此，例如，纯化的肽制备物是其中的肽或蛋白质(例如抗体)比所述肽或蛋白质在细胞内其天然环境中更加富集的制备物。在一种实施方式中，制备物是纯化的，以致所述蛋白质或肽占所述制备物中总肽或蛋白质内含物的至少50%。
[0205]重组的:重组的核酸是具有非天然存在的序列或具有通过两个原本分开的序列区段的人工组合而制造的序列的这种核酸。这种人工组合通常通过化学合成，或者更通常通过分离的核酸区段的人工操作、例如通过遗传工程技术来实现。
[0206]序列同一性:氨基酸序列之间的相似性根据序列之间的相似性来表示，序列之间的相似性也被称为序列同一性。序列同一性通常根据同一性(或相似性或同源性)百分率来度量；百分率越高，两个序列越相似。当使用标准方法比对时，多肽的同源物或变体具有相对高的序列同一性程度。
[0207]用于比较的序列比对方法在本领域中是公知的。各种程序和比对算法被描述在下列文献中:Smith 和 Waterman, Adv.App1.Math.2:482，1981 ；Needleman 和 ffunsch, J.Mol.B1l.48:443, 1970 ；Pearson 和 Lipman, Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.85:2444, 1988 ；Higgins 和 Sharp, Gene73:237，1988 ;Higgins 和 Sharp, CAB10S5:151，1989 ;Corpet 等，Nucleic Acids Researchl6:10881, 1988 ；以及 Pearson 和 Lipman, Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.85:2444，1988。Altschul 等，Nature Genet.6:119，1994 提出了序列比对方法和同源性计算的详细考虑。
[0208]NCBI 的基本局部比对检索工具(Basic Local Alignment Search Tool) (BLAST)(Altschul等，J.Mol.B1l.215:403, 1990)可以从数个来源获得，包括国家生物技术信息中心(Nat1nal Center for B1technology Informat1n) (NCBI, Bethesda, MD)和英特网上，其用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx相结合使用。关于如何使用这一程序来确定序列同一性的描述可以在英特网上的NCBI网址上获得。
[0209]特异性结合多肽的抗体的\或Vh的同源物和变体的特征通常在于，在与目标氨基酸序列进行全长比对时计算得到具有至少约75%，例如至少约80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。当通过这种方法评估时，与参比序列具有甚至更高的相似性的蛋白将显示出更高的同一性百分率，例如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的序列同一性。当将小于整个的序列进行比较以获得序列同一性时，同源物和变体通常在10-20个氨基酸的短窗口内具有至少80%的序列同一性，并且取决于它们与参比序列的相似性，可能具有至少85%或至少90%或95%的序列同一性。用于在这样的短窗口内确定序列同一性的方法可以在英特网上的NCBI网址处获得。本领域技术人员将会认识到，提供这些序列同一性的范围仅仅是为了指导，完全可能获得落在所提供的范围之外的非常显著的同源物。
[0210]特异性结合:当指称抗体时，是指在存在蛋白质和其他生物物质的非均质群体的条件下确定靶蛋白、肽或多糖的存在的结合反应。因此，在指定条件下，抗体优先结合于特定的靶蛋白、肽或多糖(例如病原体表面上存在的抗原，例如gp41)，并且不以显著的量结合于样品或对象中存在的其他蛋白或多糖。特异性结合可以通过本领域中已知的方法来确定，例如通过测量抗体对抗原的亲和性。在一种实施方式中，亲和性通过由Frankel等，Mol.1mmunol., 16:101-106, 1979所描述的Scatchard方法的改良方法来计算。在另一种实施方式中，结合亲和性通过抗原/抗体解离速率来度量。在又一种实施方式中，高结合亲和性通过竞争性放射免疫测定法来测量。对于抗体抗原复合物来说，抗原与抗体的特异性结合具有低于约10_6M、例如低于约10_6M、10_7M、10_8M、10_9或甚至低于约ΙΟ,Μ的Kd。
[0211]基本上纯化的:术语基本上纯化的表示对象基本上不含天然与其相伴的其他分子或细胞组分。因此，基本上纯化的细胞(例如B细胞、B细胞祖细胞、成熟B细胞、记忆性B细胞、浆细胞等)群体基本上不含天然存在所述细胞的组织中的其他细胞组分，所述组织例如为骨髓、外周血、脾、淋巴结等。例如，基本上纯的B细胞(例如B细胞祖细胞、未成熟B细胞、成熟B细胞、记忆性B细胞、浆细胞等)群体摒除至少50%、例如至少约80%或者至少约90%的其他细胞组分。在实施方式中，B细胞群体摒除至少约95%的其他细胞。例如，从组织例如外周血获得的纯化的B细胞群体基本上不含外周血中通常存在的红细胞、T细胞、血小板和其他细胞。
[0212]T细胞:一种对免疫应答来说关键的白细胞。T细胞包括但不限于⑶4+T细胞和CD8+T细胞。CD4+T淋巴细胞是在其表面上携带被称为“分化簇4”(CD4)的标志物的免疫细胞。这些细胞也被称为辅助性T细胞，帮助协调免疫应答，包括抗体应答以及杀伤性T细胞应答。⑶8+T细胞携带“分化簇8”(⑶8)标志物。在一种实施方式中，⑶8T细胞是细胞毒性T淋巴细胞。在另一种实施方式中，CD8细胞是抑制性T细胞。
[0213]治疗剂:在通称的意义上使用时，它包括治疗药剂、预防药剂和置换药剂。治疗剂被用于改善患有疾病或障碍的对象中的一组特定病症。
[0214]治疗有效量或有效量:足以在被治疗对象中实现所需效果的特定物质、例如本公开的抗体的量。例如，它可以是抑制HIV复制或治疗AIDS所必需的量。在数种实施方式中，治疗有效量是减轻AIDS的征兆或症状和/或降低对象中的病毒滴度所必需的量。当施用于对象时，一般使用能够获得目标组织浓度的剂量，所述目标组织浓度已被显示能够实现所需体外效果。
[0215]毒素:当与细胞接触时引起细胞毒性的效应子分子。毒素的具体的非限制性实例包括但不限于相思豆毒素、篤麻毒素、auristatin类(例如单甲基auristatin E(MMAE;参见例如 Francisco 等，Blood, 102:1458-1465, 2003))和单甲基 auristatin F (MMAF ;参见例如 Doronina 等，B1conjugate Chem., 17:114-124，2006)、美登木素类(例如 DMl ;参见例如 Phillips 等，Cancer Res.，68:9280-9290，2008)、假单胞菌外毒素(PE，例如 PE35、PE37、PE38和PE40)、白喉毒素(DT)、肉毒杆菌毒素、皂草素、局限曲菌素或白树毒素或其改良的毒素，或者直接或间接抑制细胞生长或杀死细胞的其他有毒药剂。例如，PE和DT是通常通过肝毒性引起死亡的高度有毒的化合物。然而，PE和DT可以通过去除毒素的天然靶向组分(例如PE的结构域Ia以及DT的B链)并用不同的靶向部分例如抗体替换，而被修改成用作免疫毒素的形式。
[0216]在足以……的条件下:该短语被用于描述允许获得所需活性的任何环境。在一个实施例中，所需活性是免疫复合物的形成。在特定实施例中，所需活性是肿瘤的治疗。
[0217]载体:被导入到宿主细胞中并由此产生转化的宿主细胞的核酸分子。载体可以包括允许它在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体也可以包括一个或多个可选择标志物基因和本领域中已知的其他遗传元件。
[0218]病毒:在活细胞内繁殖的微型感染性生物体。病毒基本上由被蛋白质外壳包围的单一核酸的核心构成，并且具有只能在活细胞内复制的能力。“病毒复制”是通过至少一个病毒生命周期的出现来产生附加的病毒。病毒可以破坏宿主细胞的正常功能，使细胞以由病毒决定的方式运转。例如，病毒感染可能导致细胞产生细胞因子或对细胞因子做出响应，而未被感染的细胞一般不会如此。
[0219]“反转录病毒”是其中病毒基因组是RNA的RNA病毒。当宿主细胞被反转录病毒感染时，基因组RNA被反转录成DNA中间体，所述DNA中间体被非常有效地整合到被感染细胞的染色体DNA中。整合的DNA中间体被称为前病毒。术语“慢病毒”以其常规意义使用，用于描述含有反转录酶的一个病毒属。慢病毒包括“免疫缺陷病毒”，其包括I型和2型人免疫缺陷病毒(HIV) (HIV-Ι和HIV-1I)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)和猫免疫缺陷病毒(FIV)。
[0220]下面描述了适合用于本公开的实践或试验的方法和材料。这样的方法和材料仅仅是说明性的而不是限制性的。可以使用与本文中描述的方法和材料相似或等同的其他方法和材料。例如，本公开的发明所属【技术领域】中公知的常规方法被描述在各种综合和更具体的参考文献中，包括例如Sambrook等，《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 ；Sambrook等，《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)第三版，ColdSpring Harbor Press, 2001 ;Ausubel 等，《分子生物学现代方法》(Current Protocolsin Molecular B1logy), Greene Publishing Associates, 1992 (和 2012 年的补充材料)；AuSubel等，《分子生物学简短方案:来自于分子生物学现代方法的方法汇编》(ShortProtocols in Molecular B1logy:A Compendium of Methods from Current Protocolsin Molecular B1logy)，第 4 版，ffiley&Sons, 1999 ；Harlow 和 Lane,《抗体实验指南》(Antibodies:A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990;以及 Harlow 和 Lane《使用抗体实验指南》(Using Antibodies:A Laboratory Manual), ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1999。
[0221]I1.数种实施方式的描述
[0222]A.中和性单克隆抗体
[0223] 本文中公开了特异性结合gp41的分离的人类单克隆抗体。所公开的抗体特异性结合gp41的近膜细胞外区域(MPER)。本文中还公开了包含这些人类单克隆抗体和药学可接受的载体的组合物。还提供了编码这些抗体的核酸、包含这些核酸的表达载体以及表达所述核酸的分离的宿主细胞。
[0224]包含特异性针对gp41的人类单克隆抗体的组合物可用于研究、诊断和治疗目的。例如,本文中公开的人类单克隆抗体可用于检测生物样品中的HIV-1或干扰HIV-1活性，以例如诊断或治疗患有HIV-1感染和/或AIDS的对象。例如，抗体可用于确定对象中的HIV-1滴度。本文中公开的抗体还可用于研究人免疫缺陷病毒的生物学。
[0225]所公开的特异性结合gp41的抗体在以前未表征的表位处结合gp41的近膜细胞外区域(MPER)，所述表位被命名为10E8表位，是所发现的这类抗体(10E8样抗体)的第一个成员。在与gp41肽的复合物中解析了 10E8抗体的晶体结构(参见实施例1)，这允许详细地分析这类10E8抗体与gp41的结合，并在原子水平上描述10E8样抗体(例如10E8)与10E8表位的结合。这个表位以及因此这一类抗体(10E8样抗体)，可以利用它们与10E8表位的结合与其他结合gp41的抗体区分开。在数种实施方式中，10E8表位例如KffASLffNWFDITNWLffYIR(SEQ ID NO:13)在gp41胞外结构域上的2F5表位的C-端(尽管存在一些重叠)延伸，并且通过将结合扩展到以前被认为不可接近的C-端残基(例如，这些残基据信被埋置在脂质双层中)而与4E10和Z13E1表位区分开。本领域普通技术人员将会理解，10E8抗体可以特异性结合到在上述序列的N-端延伸的gp41MPER残基。在某些实施方式中，所公开的10E8样抗体特异性结合于包括SEQ ID NO:26的第1-28、2_28、3-28、4_28、5-28、6-28、7-28、8-28、9-28、10-28、11-28、12-28、13-28 或 14-28 位残基所示的氨基酸序列的多肽，所述残基分别对应于gp41的第656-683、657-683、658-683、659-683、660-683、661-683、662-683、663-683、664-683、665-683、666-683、667-683、668-683 或 669-683 位残基(HXB2编号系统)。
[0226]在某些实施方式中，据信与10E8抗体发生接触的残基包括在上面用粗体示出的K、SLWNWF、TN、LW和 IR。因此，在某些实施方式中，10E8样抗体特异性结合于SEQ ID NO:13的K、SLWNWF、TN、LW和IR中的一个或多个残基，例如至少I个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个或甚至所有13个这些残基。在某些实施例中，10E8样抗体结合于下列序列NWFDITNWLWYIR(SEQID NO:13的第7-19位残基)中用粗体示出的NWF、T和R残基。
[0227]在其他实施方式中，抗体或抗原结合片段接触LWNWFDITNWLWYIR(SEQ ID NO:26，第14-28位残基)所示的氨基酸序列中用粗体示出的L、WF、LW和R。在其他实施方式中，所公开的抗体接触LWNWFDITNWLWYIR (SEQ ID NO:26，第14-28位残基)所示的氨基酸序列中用粗体示出的LW、WF、LW和R。在其他实施方式中，所公开的抗体接触SLffNWFDITNWLffYIR(SEQ ID NO:26，第13-28位残基)所示的氨基酸序列中用粗体示出的SLff, WF、Lff和R。在其他实施方式中，所公开的抗体接触LELDKWASLWNWFDITNWLWYIR(SEQID NO:26，第6-28位残基)所示的氨基酸序列中用粗体示出的L、DK、SLffNWF, TN、LW和IR。在其他实施方式中，所公开的抗体接触NWFDITNWLWYIR(SEQ ID NO: 13，第7_19位残基)所示的氨基酸序列中用粗体示出的NWF、T和R。在其他实施方式中，所公开的抗体接触KWASLWNWFDITNWLWYIR(SEQ ID NO:13)所示的氨基酸序列中用粗体示出的K、SLNWF、T和IR。在其他实施方式中，所公开的抗体特异性结合于NWFDITNWLWYIR(SEQ ID N0:13，第7-19位残基)所示的氨基酸序列中用粗体示出的残基NWF、T和R。在其他实施方式中，所公开的抗体特异性结合于KWASLWNWFDITNWLWYIR(SEQ ID NO:13)所示的氨基酸序列中用粗体示出的残基K、SLNWF、T和IR。在数种这样的实施方式中，当抗体通过例如氢键接触和/或范德华接触而特异性结合于gp41时，抗体在指定残基处直接接触gp41MPER。在其他实施方式中，当抗体通过例如氢键接触、范德华接触和/或引起抗体与gp41之间(即埋置表面积)的溶剂进入减少的相互作用而特异性结合于gp41时，抗体在指定残基处接触gp41MPER。如图27和28中所示，10E8和10E8样抗体中对于结合10E8表位来说重要的残基包括重链的 28、31、33、50、52、52B、52C、53、56、58 和 97-100JKabat 残基和轻链的 91 和 95B Kabat 残基。这些残基对应于重链的第28、31、33、50、52、54、55、56、59、61、103-116位残基(残基编号相对于SEQ ID NO:1给出)和轻链的第91和97位残基(残基编号相对于SEQ ID NO:2给出)。在某些实施方式中，10E8样抗体特异性结合于gp41，并且来自于重链的第28、31、33、50、52、54、55、56、59、61 和 / 或 103-116 位残基(相对于 SEQ ID ΝΟ:1)中的一个或多个残基，例如至少I个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或甚至所有27个这些残基接触gp41。在某些实施方式中，10E8样抗体特异性结合于gp41，并且来自于轻链的第91和97位残基(相对于SEQ ID NO:
2)中的至少一个残基接触gp41。
[0228]在某些实施方式中，10E8样抗体类型不表现出自体反应性，即它们不结合自体抗原例如人类蛋白质。不受理论限制，在与MPER gp41肽的复合物中的10E8的晶体结构的检查显示，10E8以可能不需要与膜的任何疏水性相互作用的方式结合于MPER。结合gp41的MPER的其他已知中和性抗体例如2F5和4E10在⑶R H3中包括不接触表位并且据信与gp41所位于的脂质膜发生特异性接触的疏水性残基。
[0229]尽管不受理论限制，但据信10E8样抗体的中和广度可以容忍表位的保守变化并同时仍维持结合。例如，尽管C-端残基被示出为精氨酸，但这类抗体可以容忍在这一位点处的赖氨酸置换，并仍维持高结合亲和性。此外，本领域普通技术人员可以使用图17B或图17C-17F中列出的HIV分离株的所有HIV gp41变异的序列，为10E8表位制定共有序列。在某些实施方式中，这一类别中的抗体(10E8样抗体)也可以通过中和广度区分开。在某些实施方式中，10E8样抗体能够以低于SOμg/ml的IC50中和图17B或图17C-17F中列出的至少95% (例如至少96%、至少97%、至少98%或至少99% )的HIV-1分离株。在某些实施方式中，10E8样抗体能够以低于lμg/ml的IC50中和图17B或图17C-17F中列出的至少65 % (例如至少66 %、至少67 %、至少68 %、至少69 %、至少70 %、至少71%、至少72 %、至少73%、至少74%、至少75%或至少80% )的HIV-1分离株。在特定实施方式中，10E8样抗体不是Z13E1、4E10或2F5抗体。
[0230]下面的单克隆抗体的讨论针对包含重链和轻链可变结构域的分离的单克隆抗体，所述可变结构域包括⑶RU⑶R2和⑶R3。本领域普通技术人员将会理解，可以使用各种⑶R编号系统方案(例如Kabat、Chothia或MGT编号系统方案)来确定⑶R位置。根据Kabat和MGT编号系统方案的10E8单克隆抗体的重链⑶R位置被示出在图6A (Kabat)和图6B(MGT)中。在数种实施方式中，对所公开抗体的重链或轻链中的特定氨基酸置换的指称是根据Kabat或MGT编号系统方案做出的。例如，本文中提到的10E8中的氨基酸置换S74W参照的是Kabat编号系统方案。使用MGT编号系统方案，这一置换被称为S82W。在这两种情形中，该位置是指置换SEQ ID NO:1的第77位处的丝氨酸残基。本领域技术人员将容易地理解在指称本文中公开的抗体的特定氨基酸时各种CDR编号系统方案的使用。
[0231]在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括具有SEQ ID NO:11 =EVX1L
x2esggglvkpggslrlscsasgfdfdnawmtwv rqppgkglewvgritgpgegwsvdyaapvegrftisrlnx3in
FLYLE MNNLRMEDSGLYFCARTGKYYDFWSGYPPGEEYFQDWGRGTLVX4VSS(SEQ ID NO ill)的第 26-33位氨基酸(互补决定区1(⑶Rl))、第51-60位氨基酸(⑶R2)和/或第99-120位氨基酸(⑶R3)中的一个或多个区域的重链，其中X1是Q或R，X2是V或A，X3是S或Y，并且X4是T或I。在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的人类单克隆抗体包括具有SEQ ID NO:11的第26-33位(CDRl)、第51-60位(CDR2)和第99-120位(CDR3)氨基酸的重链。在特定实施例中，所述人类单克隆抗体的重链包括SEQ ID NO=Il0
[0232]在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括具有SEQ ID NO:146 =EVX!Lx2EsggglvkpggslrlscsasgFX3FX4X5Awm twvrqppgkglewvgritgpgex6wsvdyaapvegrftisrln
SINFL YLEMNNLRMEDSGLYFCARTGKYYDFffSGYPPGEEYFQDffGRGTL VX7VSS (SEQ ID NO:146)的第26-33位氨基酸(互补决定区I (CDRl))、第51-60位氨基酸(CDR2)和/或第99-120位氨基酸(⑶R3)中的一个或多个区域的重链，其中X1是Q或R，X2是V或A，X3是D或W，X4是D或W，X5是N或W，&是6或W并且^是！1或I。在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的人类单克隆抗体包括具有SEQ ID NO:146的第26-33位(CDRl)、第51-60位(CDR2)和第99-120位(CDR3)氨基酸的重链。在特定实施例中，所述人类单克隆抗体的重链包括SEQ ID NO:146o
[0233]在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括具有SEQ ID NO:187的第26-33位氨基酸(互补决定区I (⑶Rl))、第51-60位氨基酸(⑶R2)和/或第99-120位氨基酸(CDR3)中的一个或多个区域的重链。seq id no:187 如 Ex1X2Lx3Esggx4Lvx5PggsLRLscx6Asgfx7Fx8X9XiciWmtwvrqx11Pgkglewvgrix12-Gx13Gx14X15Wx16X17X18YaX19X2ciVX21GrFX22Is rx23x24x25x^x27X28X29Ylx30Mnx31X32X33X34X35Dx36X37X38Yx39Cx4Ox4Itx42Kx43Yx44Fwx45Gx46Ppgeeyx47X48X49WGXsogtX51VX52VX53S所示，其中X1是V或I ;X2是Q或R ;X3是V或A ;X4是G、R或D ;X5是K或R ;X6是 S 或 A ;X7 是 D、N、S、A 或 W ;X8 是 D、K、W 或 A ；X9 是 N、S、D、A、W、F 或 Y ；X10 是 A、T 或 Q ;X11 是 P 或 A ；X12 是 T、S 或 A ；X13 是 P 或 W ；X14 是 E、A、F、L、M、V 或 W ；X15 是 G 或 W ；X16 是 S、T、A 或 H ;X17 是 V 或 S ；X18 是 D、G 或 A ；X19 是 A 或 E ；X20 是 P、S 或 T ；X21 是 E、K 或 Q ；X22 是 T或 I ;X23 是 L、D、Μ、I 或 N ；Χ24 是 N 或 D ；Χ25 是 S、Μ、W、F、L 或 M ；Χ26 是 I 或 K ；Χ27 是 N 或 D ;X28 是 F、T 或 M ；Χ29 是 L 或 F ；Χ30 是 E 或 Q ；Χ31 是 N、S 或 R ；Χ32 是 L 或 V ；Χ33 是 R 或 K ；Χ34 是Μ、Τ、I 或 P ；Χ35 是 E 或 D ；Χ36 是 S、T 或 W ；Χ37 是 G、A 或 W ；Χ38 是 L、V、S 或 Y ；Χ39 是 F 或 Y ;X40 是 A、T 或 V ；Χ41 是 R、T 或 H ;Χ42 是 G 或 E ;Χ43 是 Y 或 H ；Χ44 是 D、A 或 N ；Χ45 是 S、G 或 R ;X46是Y或A ；Χ47是F或L ；Χ48是Q或E ；Χ49是D或H ；Χ50是R或Q ；Χ51是L或Q ；Χ52是T或I ;并且&3是3或P。在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的人类单克隆抗体包括具有 SEQ ID NO:187 的第 26-33 位(CDRl)、第 51-60 位(CDR2)和第 99-120 位(CDR3)氨基酸的重链。在其他实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括包含SEQ ID NO:187所示的氨基酸序列的重链可变区。
[0234]在数种实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体是中和性的，并且包括包含按照 Kabat,IMGT 或 Clothia编号系统如 SEQ ID NO: 1、3、5、11、146、147-149、187、189-192 和200-204所示的重链可变区序列之一的一个或多个重链互补决定区(OTR)的重链。在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体是中和性的，并且包括包含按照KabatUMGT或Clothia 编号系统如 SEQ ID NO:1、3、5、11、146、147-149、187、189_192 或 200-204 所示的重链可变区序列之一的⑶R1、⑶R2和⑶R3的重链。
[0235]因此，在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括SEQ ID NO:1、3、5、11、146、147-149、187、189-192 和 200-204 之一的第 26-33 位氨基酸(CDRl)、第 51-60 位氨基酸(CDR2)和/或第99-120位氨基酸(CDR3)中的一个或多个区域。在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的人类单克隆抗体包括具有SEQ ID N0:l、3、5、ll、146、147-149、187、189-192 和 200-204 之一的第 26-33 位(CDRl)、第 51-60 位(CDR2)和第 99-120 位(⑶R3)氨基酸的重链。在特定实施例中，所述人类单克隆抗体的重链包括SEQ ID N0:l、3、5、11、146、147-149、187、189-192 和 200-204 之一。
[0236]例如，在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括包含来自于gp41抗体10E8、7H6和/或7N16的一个或多个重链互补决定区(CDR)的重链。gp41抗体10E8的重链如SEQ ID NO:1所示。在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括SEQ IDNO:1的第26-33位氨基酸(图6B中的第27-38位)(CDRl)、第51-60位氨基酸(图6B中的第56-65位)(⑶R2)和/或第99-120位氨基酸(图6B中的第105-126位)(⑶R3)中的一个或多个区域。在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的人类单克隆抗体包括具有SEQ ID NO:1 的第 26-33 位(CDRl)、第 51-60 位(CDR2)和第 99-120 位(CDR3)氨基酸的重链。在特定实施例中，所述人类单克隆抗体的重链包括SEQ ID N0:1。gp41抗体7H6的重链如SEQ ID N0:3所示。因此，在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括SEQ ID NO:3 的第 26-33 位(CDRl)、第 51-60 位(CDR2)和 / 或第 99-120 位(CDR3)氨基酸中的一个或多个区域。在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的人类单克隆抗体包括具有 SEQ ID NO:3 的第 26-33 位(CDRl)、第 51-60 位(CDR2)和第 99-120 位(CDR3)氨基酸的重链。在特定实施例中，所述人类单克隆抗体的重链包括SEQ ID N0:3。gp41抗体7N16的重链如SEQ ID N0:5所示。因此，在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括 SEQ ID NO:5 的第 26-33 位(CDRl)、第 51-60 位(CDR2)和 / 或第 99-120 位(CDR3)氨基酸中的一个或多个区域。在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的人类单克隆抗体包括具有 SEQ ID NO:5 的第 26-33 位(CDRl)、第 51-60 位(CDR2)和第 99-120 位(CDR3)氨基酸的重链。在特定实施例中，所述人类单克隆抗体的重链包括SEQ ID N0:5。
[0237]在其他实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括包含本文中公开的任一10E8样重链的氨基酸序列并进一步在第77位处(根据Kabat编号系统为第74位处)包含氨基酸置换例如S77Y置换(根据Kabat编号系统为S74Y)的重链。在其他实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括包含来自于本文中公开的任一 10E8样重链的一个或多个重链互补决定区(OTR)并进一步在第77位处(根据Kabat编号系统为第74位处)包含氨基酸置换例如S77Y置换(根据Kabat编号系统为S74Y)的重链。在其他实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括包含来自于gp41抗体gVRC-H2dN152或gVRC_H2dN152之一的一个或多个重链互补决定区(CDR)并在第77位处(根据Kabat编号系统为第74位处)具有氨基酸置换的重链。在某些实施例中，所述氨基酸置换是丝氨酸向酪氨酸的置换。gp41抗体gVRC-H2dN152的重链如SEQ ID NO:154所示。因此，在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括SEQ ID NO:154的第26-33位(CDRl)、第51-60位(CDR2)和/或第99-120位(CDR3)氨基酸中的一个或多个区域。在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的人类单克隆抗体包括具有SEQ ID NO:154的第26-33位(CDRl)、第51-60位(CDR2)和第99-120位(CDR3)氨基酸的重链。在特定实施例中，所述人类单克隆抗体的重链包括SEQ ID NO:154。在第77位处(根据Kabat编号系统为第74位处)具有丝氨酸向酪氨酸的置换的gp41抗体gVRC-H2dN152的重链如SEQ ID NO:192所示。因此，在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括SEQ ID NO:192的第26-33位(CDRl)、第51-60位(CDR2)和/或第99-120位(CDR3)氨基酸中的一个或多个区域。在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的人类单克隆抗体包括具有SEQ ID NO:192的第26-33位(⑶Rl)、第51-60位(⑶R2)和第99-120位(⑶R3)氨基酸的重链。在特定实施例中，所述人类单克隆抗体的重链包括SEQ ID NO:192。
[0238]在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括SEQ ID NO:12:SYELTQXJ
gvsvalgrtvvtitcrgdslrshx2aswyqkkpgqapx3llfygknnrpsgx4pdrfsgsasgnrasltix5gaqaedx
6AX7YYCSSRDKSGSRLSVFGGGTKLX8VL(SEQ ID NO:12)的第 26-31 位(CDRl)、第 49-51 位(CDR2)和/或第87-98位(⑶R3)氨基酸的一个或多个轻链互补决定区(⑶R)，其中X1是E或D，X2是Y或H，X3是V或I，X4是V或I，X5是S或T，X6是D或E，X7是E或D，并且X8是T或I。在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的人类单克隆抗体包括具有SEQ ID NO:12的第26-31位(CDRl)、第49-51位(CDR2)和第87-98位(CDR3)氨基酸的轻链。在特定实施例中，所述人类单克隆抗体的轻链包括SEQ ID NO:12o
[0239]在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括SEQ ID NO:188 =X1X2X3LTqx4X5X6Vsvax7X8X9Tvx10Itcx11Gdslrx12X13Yx14X15Wyqx16X17X18X19QapX20-LX21X22YX23X24X25X26RpsX27X28X29DRFSX3(iX31X32SGNX33ASLTIX34GAX35X36X37DX38AX39YYCSSRDKSG SrLX4qX41FGX42GTX43X44X45X46X47的第26-31位(CDRl)、第49-51位(CDR2)和/或第87-98位(CDR3)氨基酸的一个或多个轻链互补决定区(OTR)，其中X1是S或A ;X2是Y或S ;X3是E或D ;X4是E或D ;X5是T或P ;X6 是 G、A 或 T ;X7 是 L 或 F ;X8 是 G、K 或 E ;X9 是 R、Q 或 K ；X10 是 T 或 R ；Xn 是 R 或 Q ；X12是 S、R 或 N ；X13 是 H 或 Y ；X14 是 A、V 或 T ；X15 是 S 或 G ；X16 是 K、E 或 Q ；X17 是 K 或 R ；X18 是P 或 T ；X19 是 G 或 R ；X20 是 1、V 或 K ；X21 是 L 或 V ；X22 是 F、V 或 I ;X23 是 G 或 P ；X24 是 K 或R ；X25 是 N、D 或 H ；X26 是 N 或 I ;X27 是 G 或 P ；X28 是 V 或 I ;X29 是 P、H 或 S ；X30 是 G 或 A ；X31是 S 或 F ；X32 是 A、T 或 S ；X33 是 R 或 T ；X34 是 S、A 或 T ；X35 是 Q 或 E ；X36 是 A 或 G ；X37 是 E或 D ；X38 是 D、E 或 I ;X39 是 E 或 D ；X40 是 S、V ；X41 是 V、T ；X42 是 G、R ；X43 是 K 或 E ；X44 是 L、V或R -J45是T、S或A ；X46是V、T或G ;并且X47是L、V或P。在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的人类单克隆抗体包括具有SEQ ID NO:188的第26-31位(CDRl)、第49-51位(CDR2)和第87-98位(CDR3)氨基酸的轻链。在其他实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括包含SEQ ID NO:188所示的氨基酸序列的轻链可变区。
[0240] 数种实施方式包括分离的抗体，所述抗体特异性结合gp41并且是中和性的，并包括包含根据 Kabat、MGT 或 Clothia 编号系统如 SEQ ID NO:2、4、6、12、150-152、164-186、188或197-199所示的轻链可变区序列之一的一个或多个轻链互补决定区(OTR)的轻链。在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体是中和性的，并包括包含根据KabatUMGT或 Clothia 编号系统如 SEQ ID NO:2、4、6、12、150-152、164-186、188 或 197-199 所示的轻链可变区序列之一的⑶RU⑶R2和⑶R3的轻链。在其他实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括 SEQ ID NO:2、4、6、12、150-152、164-186、188 或 197-199 之一的第 26-31位(图6B中的第27-38位)(CDRl)、第49-51位(图6B中的第56-65位)(CDR2)和/或第87-98位(图6B中的第105-116位)(⑶R3)氨基酸中的一个或多个区域。在其他实施方式中，特异性结合gp41的分离的人类单克隆抗体包括具有SEQ ID NO:2、4、6、12、150-152、164-186、188或 197-199之一的第 26-31 位(CDRl)、第 49-51 位(CDR2)和第 87-98位(CDR3)氨基酸的轻链。在特定实施例中，所述人类单克隆抗体的轻链包括SEQ ID NO:2、4、6、12、150-152、164-186、188 或 197-199 之一。
[0241]例如，在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括来自于gp41抗体10E8、7H6和/或7N16的一个或多个轻链互补决定区(CDR)。gp41抗体10E8的轻链如SEQID N0:2所示。因此，在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括SEQ ID NO:2的第26-31位(图6B中的第27-38位)(CDRl)、第49-51位(图6B中的第56-65位)(⑶R2)和/或第87-98位(图6B中的第105-116位)(⑶R3)氨基酸中的一个或多个区域。在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的人类单克隆抗体包括具有SEQ ID NO:2的第26-31位(CDRl)、第49-51位(CDR2)和第87-98位(CDR3)氨基酸的轻链。在特定实施例中，所述人类单克隆抗体的轻链包括SEQ ID NO:2。gp41抗体7H6的轻链如SEQ ID NO:4所示。因此，在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括SEQ ID NO:4的第26-31位(CDRl)、第49-51位(CDR2)和/或第87-98位(CDR3)氨基酸中的一个或多个区域。在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的人类单克隆抗体包括具有SEQ ID N0:4的第26-31位(CDRl)、第49-51位(CDR2)和第87-98位(CDR3)氨基酸的轻链。在特定实施例中，所述人类单克隆抗体的轻链包括SEQ ID N0:4。gp41抗体7N16的轻链如SEQ IDN0:6所示。因此，在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括SEQ ID NO:6的第26-31位(CDRl)、第49-51位(CDR2)和/或第87-98位(CDR3)氨基酸中的一个或多个区域。在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的人类单克隆抗体包括具有SEQ ID NO:6的第26-31位(CDRl)、第49-51位(CDR2)和第87-98位(CDR3)位氨基酸的重链。在特定实施例中，所述人类单克隆抗体的重链包括SEQ ID N0:6。
[0242]在其他实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括包含来自于gp41抗体10E8gL03的一个或多个重链互补决定区(CDR)的重链。gp41抗体10E8gH03的轻链如SEQID NO:152所示。因此，在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括SEQ ID NO:152的第26-31位(CDRl)、第49-51位(CDR2)和/或第87-98位(CDR3)氨基酸中的一个或多个区域。在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的人类单克隆抗体包括具有SEQID NO:152 的第 26-31 位(CDRl)、第 49-51 位(CDR2)和第 87-98 位(CDR3)氨基酸的重链。在特定实施例中，所述人类单克隆抗体的重链包括SEQ ID N0:152。
[0243]其他实施方式包括分离的抗体，所述抗体特异性结合gp41并且是中和性的，并且分别包括包含按照KabatUMGT或Clothia编号系统如SEQ ID NO:1、3、5、11、146、147_149、187、189-192和200-204所示的重链可变区序列之一的一个或多个重链互补决定区(OTR)的重链，以及按照 Kabat、MGT 或 Clothia 编号系统如 SEQ ID NO:2、4、6、12、150-152、164-186、188或197-199所示的轻链可变区序列之一的一个或多个轻链互补决定区(OTR)。其他实施方式包括分离的抗体，所述抗体特异性结合gp41并且是中和性的，并且分别包括包含按照 Kabat、IMGT 或 Clothia 编号系统如 SEQ ID NO:1、3、5、11、146、147_149、187、189-192和200-204所示的重链可变区序列之一的重链互补决定区I (HCRDl)、HCRD2和HCDR3 的重链，以及按照 KabatUMGT 或Clothia编号系统如 SEQ ID NO:2、4、6、12、150-152、164-186、188或197-199所示的轻链可变区序列之一的轻链互补决定区I (HCRDl)、HCRD2和HCDR3。
[0244]因此，在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括包含SEQ ID NO:1、3、5、11、146、147-149、187、189-192 和 200-204 之一的第 26-33 位(图 6B 中的第 27-38 位)氨基酸(⑶Rl)、第51-60位(图6B中的第56-65位)氨基酸(⑶R2)和/或第99-120位(图6B中的第105-126位)氨基酸(CDR3)的重链，以及包含SEQ ID NO:2、4、6、12、150-152、164-186、188 或 197-199 之一的第 26-31 位(图 6B 中的第 27-38 位)(CDRl)、第 49-51 位(图6B中的第56-65位)(CDR2)和/或第87-98位(图6B中的第105-116位)(CDR3)氨基酸的轻链。在其他实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括包含SEQ ID N0:l、3、5、11、146、147-149、187、189-192 和 200-204 之一的第 26-33 位(图 6B 中的第 27-38 位)氨基酸(⑶Rl)、第51-60位(图6B中的第56-65位)氨基酸(⑶R2)和第99-120位(图6B中的第105-126位)氨基酸(CDR3)的重链，以及包含SEQ ID NO:2、4、6、12、150-152、164-186、188 或 197-199 之一的第 26-31 位(图 6B 中的第 27-38 位)(CDRl)、第 49-51 位(图6B中的第56-65位)(CDR2)和第87-98位(图6B中的第105-116位)(CDR3)氨基酸的轻链。
[0245]在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括包含SEQ ID NO:1的第26-33位(图6B中的第27-38位)氨基酸(CDRl)、第51-60位(图6B中的第56-65位)氨基酸(⑶R2)和/或第99-120位(图6B中的第105-126位)氨基酸(⑶R3)的重链，以及包含SEQ ID NO:2的第26-31位(图6B中的第27-38位)(CDRl)、第49-51位(图6B中的第56-65位)(⑶R2)和/或第87-98位(图6B中的第105-116位)(⑶R3)氨基酸的轻链。在某些实施方式中 ，特异性结合gp41的分离的抗体包括包含SEQ ID NO:154的第26-33位(图6B中的第27-38位)氨基酸(CDRl)、第51-60位(图6B中的第56-65位)氨基酸(⑶R2)和/或第99-120位(图6B中的第105-126位)氨基酸(⑶R3)的重链，以及包含SEQ ID NO:152的第26-31位(图6B中的第27-38位)(CDRl)、第49-51位(图6B中的第56-65位)(⑶R2)和/或第87-98位(图6B中的第105-116位)(⑶R3)氨基酸的轻链。在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括包含SEQ ID NO:192的第26-33位(图6B中的第27-38位)氨基酸(CDRl)、第51-60位(图6B中的第56-65位)氨基酸(⑶R2)和/或第99-120位(图6B中的第105-126位)氨基酸(⑶R3)的重链，以及包含SEQ ID NO:152的第26-31位(图6B中的第27-38位)(CDRl)、第49-51位(图6B中的第56-65位)(⑶R2)和/或第87-98位(图6B中的第105-116位)(⑶R3)氨基酸的轻链。
[0246]在其他实施例中，特异性结合gp41并且是中和性的分离的抗体包括重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包括SEQ ID NO:1、3、5、11、146、147-149、187、189-192或200-204之一所示的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包括SEQ ID N0:2、4、6、12、150-152、164-186、188或197-199之一所不的氨基酸序列。在一个实施例中，重链可变区包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，并且轻链可变区包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。在另一个实施例中，重链可变区包括SEQ ID NO:192所示的氨基酸序列，并且轻链可变区包括SEQ ID NO:152所示的氨基酸序列。在其他实施例中，重链可变区包括SEQ ID NO:154所示的氨基酸序列，并且轻链可变区包括SEQ ID NO:152所示的氨基酸序列。
[0247]在其他实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括重链可变区，所述重链可变区包括与 SEQ ID NO:1、3、5、11、146、147-149、187、189-192 和 200-204 之一相比包含不超过10个(例如超过1、2、3、4、5、6、7、8个或不超过9个)氨基酸置换的氨基酸序列。在其他实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括轻链可变区，所述轻链可变区包括与SEQ ID NO:2、4、6、12、150-152、164-186、188 或 197-199 之一相比包含不超过 10 个(例如超过1、2、3、4、5、6、7、8个或不超过9个)氨基酸置换的氨基酸序列。在其他实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括与SEQID NO:1、3、5、11、146、147-149、187、189-192 和 200-204 之一相比包含不超过 10 个(例如超过1、2、3、4、5、6、7、8个或不超过9个)氨基酸置换的氨基酸序列，所述轻链可变区包括与 SEQ ID NO:2、4、6、12、150-152、164-186、188 或 197-199 之一相比包含不超过 10 个(例如超过1、2、3、4、5、6、7、8个或不超过9个)氨基酸置换的氨基酸序列。
[0248]在其他实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括与SEQ ID NO:1相比包含不超过10个(例如超过1、2、3、4、5、6、7、8个或不超过9个)氨基酸置换的氨基酸序列，所述轻链可变区包括与SEQ ID NO:2相比包含不超过10个(例如超过1、2、3、4、5、6、7、8个或不超过9个)氨基酸置换的氨基酸序列。
[0249]在其他实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括包含SEQ ID NO:187所示的氨基酸序列的重链可变区，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比包括不超过25个(例如超过 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23个或不超过24个)氨基酸置换。在其他实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括包含SEQID NO:188所示的氨基酸序列的轻链可变区，其中所述氨基酸序列与SEQ ID N0:2相比包括不超过 33 个(例如超过 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32个或不超过33个)氨基酸置换。在其他实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括包含SEQ ID NO:187所示的氨基酸序列的重链，其中所述氨基酸序列与SEQ ID N0:1相比包括不超过25个(例如超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23个或不超过24个)氨基酸置换；以及包含SEQID NO:188所示的氨基酸序列的轻链，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2相比包括不超过 33 个(例如超过 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32个或不超过33个)氨基酸置换。
[0250]在其他实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括重链可变区，所述重链可变区包括与 SEQ ID NO:1、3、5、11、146、147-149、187、189-192 和 200-204 之一相比具有不超过10个(例如超过1、2、3、4、5、6、7、8个或不超过9个)氨基酸置换的氨基酸序列，并且其中所述置换选自图60A和60B中列出的氨基酸置换。在其他实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括轻链可变区，所述轻链可变区包括与SEQ ID NO:2、4、6、12、150-152、164-186、188或197-199之一所示的氨基酸序列之一相比包含不超过10个(例如超过1、2、3、4、5、6、7、8个或不超过9个)氨基酸置换的氨基酸序列，并且其中所述置换选自图6IA和61B中示出的氨基酸置换。在其他实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括重链可变区，所述重链可变区包括与 SEQ ID NO:1、3、5、11、146、147-149、187、189-192 和 200-204之一相比具有不超过10个(例如超过1、2、3、4、5、6、7、8个或不超过9个)氨基酸置换的氨基酸序列，其中所述置换选自图60A和60B中示出的氨基酸置换；以及轻链可变区，所述轻链可变区包括与 SEQ ID NO:2、4、6、12、150-152、164-186、188 或 197-199 之一所示的氨基酸序列之一相比包含不超过10个(例如超过1、2、3、4、5、6、7、8个或不超过9个)氨基酸置换的氨基酸序列，并且其中所述置换选自图61A和61B中列出的氨基酸置换。在其他实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括重链可变区，所述重链可变区包括与SEQ IDNO:1相比具有不超过10个(例如超过1、2、3、4、5、6、7、8个或不超过9个)氨基酸置换的氨基酸序列，其中所述置换选自图60A和60B中列出的氨基酸置换；以及轻链可变区，所述轻链可变区包括与SEQ ID NO:2相比具有不超过10个(例如超过1、2、3、4、5、6、7、8个或不超过9个)氨基酸置换的氨基酸序列，并且其中所述置换选自图61A和61B中列出的氨基酸置换。
[0251]在其他实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括在SEQ ID N0:11的第26-31位(CDRl)、第49-51位(CDR2)和第87-98位(CDR3)氨基酸中具有至多I个、至多2个、至多3个或至多4个氨基酸置换的重链，以及轻链。在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括在SEQ ID NO:1的第26-33位(CDRl)、第51-60位(CDR2)和第99-120位(⑶R3)氨基酸中具有至多I个、至多2个、至多3个、至多4个或至多5个氨基酸置换的重链。
[0252]在某些实施方式中，抗体可以包括在SEQ ID NO:3的第26_33位(CDRl)、第51-60位(⑶R2)和第99-120位( ⑶R3)氨基酸中具有至多I个、至多2个、至多3个、至多4个或至多5个氨基酸置换的重链。在某些实施方式中，抗体可以包括在SEQ ID NO:5的第26-33位(CDRl)、第51-60位(CDR2)和第99-120位(CDR3)氨基酸中具有至多I个、至多2个、至多3个、至多4个或至多5个氨基酸置换的重链。在某些实施方式中，抗体可以包括在SEQID NO:154 的第 26-33 位(CDRl)、第 51-60 位(CDR2)和第 99-120 位(CDR3)氨基酸中具有至多I个、至多2个、至多3个、至多4个或至多5个氨基酸置换的重链。
[0253]在其他实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括在SEQ ID N0:12的第26-31位(CDRl)、第49-51位(CDR2)和第87-98位(CDR3)氨基酸中具有至多I个、至多2个、至多3个或至多4个氨基酸置换的轻链。在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括在 SEQ ID NO:2 的第 26-31 位(CDRl)、第 49-51 位(CDR2)和第 87-98 位(CDR3)氨基酸中具有至多I个、至多2个、至多3个或至多4个氨基酸置换的轻链。在某些实施方式中，抗体可以包括在SEQ ID NO:4的第26-31位(CDRl)、第49-51位(CDR2)和第87-98位(⑶R3)氨基酸中具有至多I个、至多2个、至多3个或至多4个氨基酸置换的轻链。在某些实施方式中，抗体可以包括在SEQ ID NO:6的第26-31位(CDRl)、第49-51位(CDR2)和第87-98位(⑶R3)氨基酸中具有至多I个、至多2个、至多3个或至多4个氨基酸置换的轻链。在某些实施方式中，抗体可以包括在SEQ ID NO:152的第26-31位(⑶Rl)、第49-51位(⑶R2)和第87-98位(⑶R3)氨基酸中具有至多I个、至多2个、至多3个或至多4个氨基酸置换的轻链。
[0254]在某些实施方式中，本文中公开的特异性结合gp41的分离的抗体在抗体的重链、抗体的轻链或抗体的重链和轻链的构架区(例如根据Kabat、Clothia或MGT编号系统)中包括最多10个氨基酸置换(例如最多1、2、3、4、5、6、7、8个或最多9个氨基酸置换)。
[0255]在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括重链可变区，所述重链可变区在 SEQ ID NO:1、3、5、11、146、147-149、187、189-192 和 200-204 之一的构架区中包括不超过 10个(例如 1、2、3、4、5、6、7、8 或9个)氨基酸置换。SEQ ID NO:1、3、5、11、146、147-149、187、189-192 和 200-204 的构架区分别包括 SEQ ID NO:1、3、5、11、146、147_149、187、189-192 的 200-204 的第 1-25 位(FRl)、第 34-50 位(FR2)、第 61-66 位(FR3)和第121-131位(FR4)氨基酸(按照Kabat编号系统)。在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括轻链可变区，所述轻链可变区分别在SEQ ID NO:2、4、6、12、150-152、164-186、188或197-199的构架区中包括不超过10个(例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个)氨基酸置换。SEQ ID NO:2 的构架区分别包括 SEQ ID NO:2、4、6、12、150-152、164-186、188或 197-199 的第 1-25 位(LFR2)、第 32-48 位(LFR2)、第 52-86 位(LFR3)和第 99-108 位(0FR4)氨基酸(按照Kabat编号系统)。
[0256]在其他实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括在SEQ ID N0:1的构架区中包含不超过10个(例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个)氨基酸置换的重链可变区，以及在SEQ ID N0:2的构架区中包含不超过10个(例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个)氨基酸置换的轻链可变区。在其他实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括在SEQ ID NO:154的构架区中包含不超过10个(例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个)氨基酸置换的重链可变区，以及在SEQ ID NO: 152的构架区中包含不超过10个(例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个)氨基酸置换的轻链可变区。在其他实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括在SEQ IDNO:192的构架区中包含不超过10个(例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个)氨基酸置换的重链可变区，以及在SEQ ID NO:152的构架区中包含不超过10个(例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个)氨基酸置换的轻链可变区。
[0257]在某些实施方式中，人类单克隆抗体的重链包括与SEQ ID NO:1、3、5、11、146、147-149、187、189-192或200-204之一所示的氨基酸序列具有至少80% (例如至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或至少 99% )序列同一性的氨基酸序列。在其他实施例中，重链包括SEQ ID NO:1、3、5、11、146、147-149、187、189-192或200-204之一所示的氨基酸序列。在某些实施例中，人类单克隆抗体的轻链包括与SEQ IDNO:2、4、6、12、150-152、164-186、188或197-199之一所示的氨基酸序列具有至少80% (例如至少 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少 99% )序列同一性的氨基酸序列。在其他实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包括与SEQ ID NO:1、3、5、11、146、147-149、187、189-192或200-204之一所示的氨基酸序列具有至少80% (例如至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99% )序列同一性的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包括与 SEQ ID NO:2、4、6、12、150-152、164-186、188 或 197-199 之一所示的氨基酸序列具有至少 80% (例如至少 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99% )序列同一性的氨基酸序列。
[0258]正如本文中所公开的，使用深度测序来鉴定以基本上相同的取向结合于gp41表面上与10E8、7H6和/或7N16所结合的表位基本上相似的表位的其他抗体。编码抗体重链的示例性核酸序列如随附的序列表中的SEQ ID NO:35-115所示。这些序列编码与10E8抗体重链可变区(SEQ ID NO:1)具有至少约80%同一性的抗体重链可变区。因此，本文公开了编码抗体重链可变区的核酸分子，所述抗体重链可变区与SEQ ID NO:1所示的重链可变区具有至少约80%同一性，例如与SEQ ID NO:1具有至少约80%、至少约81%、至少约82 %、至少约83 %、至少约84%、至少约85 %、至少约86 %、至少约87 %、至少约88 %、或甚至至少约89%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或甚至至少约99%同一性。编码10E8样抗体轻链的示例性核酸序列如随附的序列表中的SEQ ID NO:116-145所示。编码抗体轻链的示例性核酸序列如随附的序列表中的SEQ ID NO:116-145所示。这些序列编码与10E8抗体轻链可变区(SEQ ID NO:2)具有至少约80%同一性的抗体轻链可变区。因此，本文中公开了编码抗体轻链可变区的核酸分子，所述抗体轻链可变区与SEQ ID NO:2所示的轻链可变区具有至少约80%同一性，例如与SEQ ID NO:2具有至少约80%、至少约81%、至少约82 %、至少约83 %、至少约84%、至少约85 %、至少约86 %、至少约87 %、至少约88 %、或甚至至少约89%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95 %、至少约96 %、至少约97 %、至少约98 %或甚至至少约99 %同一性。
[0259]在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括由SEQ ID NO:35-115之一所示的核酸序列编码的一个或多个重链互补决定区(CDR)。在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的人类单克隆抗体包括具有由SEQ ID NO:35-115之一所示的核酸序列编码的所有CDR的重链。在特定实施例中，所述人类单克隆抗体的重链包括由SEQ ID NO:35-115之一所示的核酸序列编码的氨基酸序列。
[0260]在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括由SEQ ID NO:116_145之一所示的核酸序列编码的一个或多个轻链互补决定区(CDR)。在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的人类单克隆抗体包括具有由SEQ ID NO:116-145之一所示的核酸序列编码的所有CDR的轻链。在特定实施例中，所述人类单克隆抗体的轻链包括由SEQ ID NO:116-145之一所示的核酸序列编码的氨基酸序列。
[0261]在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括由源自于IGHV3-15种系等位基因来源例如 IGHV3-15*01、IGHV3-15*02、IGHV3_15*03、IGHV3_15*04、IGHV3_15*05、IGHV3-15*06、 IGHV3_15*07、 IGHV3_15*08、 IGHV3_15*09、 IGHV3_15*10、 IGHV3_15*11、IGHV3-15*12、IGHV3_15*13、IGHV3_15*14 或 IGHV3_15*15 种系等位基因来源的核酸编码的重链可变区。在某些实施方式中，重链可变区由源自于IGHV3-15种系等位基因来源例如 IGHV3-15*01、 IGHV3-15*02、 IGHV3_15*03、 IGHV3_15*04、 IGHV3_15*05、 IGHV3_15*06、IGHV3-15*07、 IGHV3_15*08、 IGHV3_15*09、 IGHV3_15*10、 IGHV3_15*11、 IGHV3_15*12、IGHV3-15*13、IGHV3_15*14或IGHV3_15*15种系等位基因来源的核酸编码，并且与相应的重链种系序列相比具有约10%、15%、20%、25%、30%、35%或40%，例如约15%至40%的趋异性。
[0262] 在某些实施方式中，特异性结合gp41的分离的抗体包括由源自于IGLV3-19种系等位基因来源例如IGLV3-19*01种系等位基因来源的核酸编码的轻链可变区。在某些实施方式中，轻链由源自于IGLV3-19种系等位基因来源例如IGLV3-19*01种系等位基因来源的核酸编码，并且与相应的轻链种系序列相比具有约10%、15%、20%、25%、30%、35%或40%，例如约15%至40%的趋异性。
[0263]在某些实施例中，重链可变结构域是来自于供体N152的克隆变体，其中重链由VH3-15基因和VJ-1J基因编码。在其他实施例中，轻链可变结构域是来自于供体N152的克隆变体，其中轻链由LV3-19V基因和LJ-3J基因编码。分离的单克隆抗体可以包括重链和轻链，其中所述重链可变区是来自于具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变区的供体N152的克隆变体。所述重链源自于VH3-15基因和LJ-3J基因。轻链可变结构域是来自于具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的轻链可变区的供体N152的克隆变体。所述轻链源自于LV3-19V基因和LJ-3J基因，所述单克隆抗体特异性结合gp41，与10E8竞争与gp41的结合，并且是中和性的。
[0264]在某些实施方式中，10E8样抗体的重链可以用10E8、7H6和/或7N16抗体的轻链补充，并仍保留对gp41的结合，例如保留对10E8表位的特异性结合。在某些实施方式中，10E8样抗体的轻链可以用10E8、7H6和/或7N16抗体的重链补充，并仍保留对gp41的结合，例如保留对10E8表位的特异性结合。因此，本文中公开了可以通过10E8、7H6和/或7N16的重链或轻链的互补来鉴定的10E8样抗体。
[0265]一旦鉴定到目标重链或轻链可变结构域之后，可以使用交叉互补分析来确定与gp41或目标表位(例如10E8表位)的结合。简单来说，如果目标可变结构域是重链可变结构域，产生该重链可变结构域的氨基酸序列。然后将重链可变结构域与参比序列轻链可变结构域例如 10E8 (SEQ ID NO:2)、7H6 (SEQ ID NO:4)和 / 或 7N16(SEQ ID NO:6)轻链可变结构域配对，并确定抗体是否以指定的亲和性例如10_8、10_9或10,的Kd特异性结合抗原(或表位)。同样地，如果目标可变结构域是轻链可变结构域，产生该氨基酸序列。然后将轻链可变结构域与参比序列重链可变结构域例如10E8 (SEQ ID NO:1)、7H6 (SEQ ID NO:
3)和/或7N16(SEQ ID NO:5)重链可变结构域配对，并确定抗体是否以指定的亲和性例如10_8、1-9或10,的Kd 特异性结合抗原(或表位)。
[0266]完全人类的单克隆抗体包括人类构架区。因此，本文中特异性结合gp41的任何抗体都可以包括人类构架区，并且可以包括SEQ ID NO:1-6、11、12和/或146-192之一所示的或由SEQ ID NO:35-145之一编码的氨基酸序列的构架区。然而，构架区可以来自于另一个来源。可以使用的构架序列的其他实例包括PCT公布号W02006/074071中公开的重链和轻链的氨基酸构架序列(参见例如SEQ ID NO:1-16)，所述公布通过参考并入本文。
[0267]在某些实施方式中，将来自于SEQ ID NO:1_6、11、12和/或146-192之一所示的或由SEQ ID NO:35-145编码的gp41抗体的一个或多个重链和/或轻链互补决定区(OTR)表达在另一种蛋白例如支架蛋白的表面上。抗体的结构域在支架蛋白表面上的表达在本领域中是已知的(参见例如Liu等，J.Virology85 (17):8467-8476, 2011)。这样的表达产生嵌合蛋白，所述嵌合蛋白保留对gp41的结合，例如对10E8表位的特异性结合。正如在实施例I中描述的，10E8类型的抗体通过重链CDR进行其大部分接触(参见例如作为图27-30给出的表，以及在图4、5、12、15、16和39-41A中示出的分子模型)。因此，在某些特定实施方式中，将一个或多个重链⑶R嫁接到支架蛋白上，例如SEQ ID NO:1、3、5、11、146-149、153-163、187、189-192 或 200-204 之一所示的或由 SEQ ID NO:35-115 之一编码的一个或多个重链⑶R1、⑶R2和/或⑶R3。
[0268]单克隆抗体可以是任何同种型。单克隆抗体可以是例如IgM或IgG抗体，例如IgGpIgG2UgG3或IgG4。特异性结合gp41的抗体的类型可以彼此转换。在一种情况下，使用本领域公知的方法分离编码'或Vh的核酸分子，使得它分别不包括编码轻链或重链的恒定区的任何核酸序列。
[0269]在特定实施例中，Vh氨基酸序列如 SEQ ID NO:1、3、5、11、146-149、153_163、187、189-192或200-204之一所示或由SEQ ID NO:35-115之一编码。在其他实施例中，Vl氨基酸序列如 SEQ ID NO:2、4、6、12、150-152、164-186、188 或 197-199 之一所示或由 SEQ IDNO:116-145之一编码。然后将编码'或Vh的核酸分子可操作地连接到编码来自于不同类别的免疫球蛋白分子的Q或Ch的核酸序列。正如本领域中已知的，这可以使用包含Q或Ch链的载体或核酸分子来实现。例如，最初为IgM的特异性结合gp41的抗体可以被类别转换成IgG。可以使用类别转换将一种IgG亚类转变成另一种亚类，例如从IgG1转变成IgG2、IgG3*IgG4。
[0270]在某些实施例中，所公开的抗体是抗体的寡聚体，例如二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体等。在某些实施例中，抗体是五聚体。
[0271]在某些实施例中，抗体或其抗体结合片段被修饰成使得它对感染的细胞具有直接细胞毒性，或者利用天然防御例如补体、抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)或巨噬细胞的吞噬作用。
[0272]本公开涵盖抗体片段，例如包含重链和轻链可变区并特异性结合gp41的Fab、?(&13’)2和？1这些抗体片段保留与抗原选择性结合的能力，并且是“抗原结合”片段。这些片段包括:
[0273](l)Fab，该片段含有抗体分子的单价抗原结合片段，可以通过用木瓜蛋白酶消化整个抗体以得到完整轻链和一条重链的一部分来生产；
[0274]⑵Fab’，该抗体分子片段可以通过用胃蛋白酶处理整个抗体，然后进行还原以得到完整轻链和一部分重链来获得；每个抗体分子获得两个Fab’片段；
[0275](3) (Fab’)2，该抗体片段可以通过用胃蛋白酶处理整个抗体而不进行随后的还原来获得；F(ab’)2是由两个二硫键保持在一起的两个Fab’片段的二聚体；
[0276](4) Fv，一种遗传工程改造的片段，其含有作为两条链表达的轻链可变区和重链可变区；以及
[0277](5)单链抗体(例如scFv)，其被定义为一种含有通过适合的多肽连接物相连的轻链可变区和重链可变区的遗传工程改造的分子，是遗传融合的单链分子。
[0278](6)单链抗体的二聚体(ScFV2)，其被定义为scFV的二聚体。它也被称为“微型抗体”。
[0279]制造这些片段的方法在本领域中是已知的(参见例如Harlow和Lane，《抗体实验指南》(Antibodies:A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, NewYork, 1988).
[0280]在另一组实施方式中，抗体是Fv抗体，其通常为约25kDa并含有完整的抗原结合位点，每条重链和每条轻链具有3个⑶R。为了产生这些抗体，可以在宿主细胞中从两个单独的核酸构建物表达Vh和八。在特定实施例中，Vh氨基酸序列包括来自于SEQ ID NO:U3,5、11、146-149、153-163、187 或 189-192 之一或由 SEQ ID NO:35-115 之一编码的 CDR。在其他实施例中，八氨基酸序列包括来自于SEQ ID NO:2、4、6、12、150-152、164-186、188或197-199或由SEQ ID NO:116-145之一编码的CDR。在其他实施例中，V1^基酸序列包括SEQID NO:1、3、5、11、146-149、153-163、187 或 189-192 之一所示或由 SEQ ID NO:35-115 之一编码的氨基酸序列。在其他实施例中，' 氨基酸序列包括SEQ ID N0:2、4、6、12、150-152、164-186,188或197-199所示或由SEQ ID NO =116-145之一编码的氨基酸序列。
[0281]如果Vh和\被非毗连地表达，则通常通过非共价相互作用将Fv抗体的链保持在一起。然而，这些链在稀释后倾向于解离，因此已经开发了通过戊二醛、分子间二硫键或肽连接物来将链交联的方法。因此，在一个实施例中，Fv可以是二硫键稳定的Fv (dsFv)，其中重链可变区和轻链可变区通过二硫键化学连接。
[0282]在其他实施例中，Fv片段包括通过肽连接物相连的V1^P'链。这些单链抗原结合蛋白(scFv)通过构建包括由寡核苷酸相连的编码V1^P'结构域的DNA序列的结构基因来制备。将所述结构基因插入到表达载体中，随后将其导入到宿主细胞例如大肠杆菌中。重组宿主细胞合成带有桥接两个V结构域的连接肽的单一多肽链。用于生产scFv的方法在本领域中是已知的(参见Whitlow等，Methods:a Compan1n to Methods inEnzymology，Vol.2，97 页，1991 ；Bird 等，Science242:423，1988 ;美国专利号 4，946，778 ；Pack等,B1/Technologyll: 1271, 1993 ;和Sandhu,同上)。也考虑到了单链抗体的二聚体(ScFV2)。
[0283]抗体片段可以通过抗体的蛋白水解或通过在大肠杆菌中表达编码所述片段的DNA来制备。抗体片段可以通过用常规方法对整个抗体进行胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化来获得。例如，抗体片段可以通过用胃蛋白酶对抗体进行酶切割来生产，以提供被称为F(ab’)2的5S片段。这种片段可以使用巯基还原剂和任选地用于由二硫键的切割产生的巯基的阻断基团来进一步切割，以产生3.5S的Fab’单价片段。或者，使用胃蛋白酶的酶切割直接产生两个单价Fab’片段和Fe片段(参见美国专利号4，036，945和美国专利号4，331，647以及其中包含的参考文献；Nisonhoff 等，Arch.B1chem.B1phys.89:230，1960 ；Porter,B1chem.J.73:119,1959 ；EdeIman 等，Methods in Enzymology, Vol.1, 422页，Academic Press, 1967 ；以及 Coligan 等，2.8.1-2.8.10 和 2.10.1-2.10.4 部分)。
[0284]也可以使用切割抗体的其他方法，例如分离重链以形成单价轻链-重链片段，进一步切割片段，或其他酶、化学或遗传技术，只要所述片段结合于完整抗体所识别的抗原即可。
[0285]技术人员将会认识到，可以产生抗体的保守变体。在抗体片段例如dsFv片段或scFv片段中使用的这样的保守变体会保留Vh与\区之间的正确折叠和稳定化所必需的关键氨基酸残基，并且会保留残基的电荷特性以便保持分子的低Pl和低毒性。可以在
Vl区中进行氨基酸置换(例如至多I个、至多2个、至多3个、至多4个或至多5个氨基酸置换)，以提高得率。在特定实施例中，Vh序列是SEQ ID NO:1、3、5、11、146-149、153-163、187或189-192或由SEQ ID NO:35-115之一所编码。在其他实施例中，Vl序列是SEQ IDNO:2、4、6、12、150-152、164-186、188 或 197-199 或由 SEQ ID NO:116-145 之一所编码。提供功能上相似的氨基酸的保守氨基酸置换表对于本领域普通技术人员来说是公知的。下面的6个组是被认为是彼此的保守置换的氨基酸的实例:
[0286]I)丙氨酸(A)，丝氨酸⑶，苏氨酸⑴；
[0287]2)天冬氨酸⑶，谷氨酸(E)；
[0288]3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；
[0289]4)精氨酸(R)，赖氨酸(K);
[0290]5)异亮氨酸⑴，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；以及[0291 ] 6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸⑴，色氨酸(W)。
[0292]本文中公开的抗体可以使用包封抗原来分离，如PCT公布号W02009/100376中所描述的。简单来说，将抗原包封以将抗原的抗原性靶向被目标抗体例如中和性抗体特异性结合的特定表位。
[0293]特异性结合与本文中公开的特异性结合gp41的抗体所结合的表位相同的gp41表位的其他重组人类中和性抗体可以通过筛选重组组合抗体文库例如Fab噬菌体展示文库来分离(参见例如美国专利申请公布号2005/0123900)。在某些情况下，使用从源自于人类淋巴细胞的mRNA制备的重链和轻链的可变区cDNA来制备噬菌体展示文库。用于制备和筛选这样的文库的方法在本领域中是已知的。存在用于产生噬菌体展示文库的可商购的试剂盒(例如Pharmacia重组曬菌体抗体系统，目录号27-9400-01 ;以及Stratagene SurfZAP?噬菌体展示试剂盒，目录号240612)。还存在可用于产生和筛选抗体展示文库的其他方法和试剂(参见例如美国专利号5，223，409 ；PCT公布号W092/18619 ；PCT公布号W091/17271 ；PCT 公布号 W092/20791 ；PCT 公布号 W092/15679 ；PCT 公布号 W093/01288 ；PCT 公布号W092/01047 ；PCT 公布号 W092/09690 ；Fuchs 等，B1/Technology9:1370-1372，1991 ；Hay 等，Hum.Antibod.Hybridomas3:81-85, 1992 ；Huse 等，Science246:1275-1281，1989 ；McCafferty 等，Nature348:552-554，1990 !Griffiths 等，EMBO J.12:725-734，1993)。
[0294]在一种实施方式中，为了分离特异性结合gp41的其他人类抗体，首先将本文中所描述的特异性结合gp41的中和性抗体用于选择对gp41具有相似结合活性的人类重链和轻链序列，例如使用在PCT公布号W093/06213中所公开的表位印记方法。在这种方法中使用的抗体文库是使用例如在PCT公布号W092/01047 ；McCafferty等，Nature348:552-554, 1990 ;和 / 或Griffiths 等，EMBO J.12:725-734，1993 中所描述的方法，使用gpl20制备和筛选得到的scFv文库。
[0295]一旦选择到初始的人类可变轻链和可变重链(Vh)区段之后，进行“混合和匹配”实验来选择目标/\对组合，在所述实验中筛选不同对的最初选择的\和Vh区段的gp41结合。此外，为了提高抗体的结合亲和性，可以在与天然免疫应答期间负责抗体亲和性成熟的体内体细胞突变过程相类似的过程中，在例如H-⑶R3区或L-⑶R3区内对' 和Vh区段进行随机突变。因此，可以通过使用分别与H-⑶R3或L-⑶R3互补的PCR引物扩增Vh和Vl区，来实现体外亲和性成熟。在这一过程中，引物在某些位置处已被“掺有”4种核苷酸碱基的随机混合物，使得得到的PCR产物编码其中已在Vh和/或\的CDR3区中导入随机突变的％和'区段。可以对这些随机突变的Vh和'区段进行测试，以确定对gp41的结合亲和性。在特定实施例中，Vh氨基酸序列是SEQ ID NO:1、3、5或11、146-149、153-163、187、189-192或200-204或由SEQ ID NO:35-115之一所编码。在其他实施例中，'氨基酸序列是 SEQ ID NO:2、4、6、12、150-152、164-186、188 或 197-199 或由 SEQ ID NO:116-145 之一所编码。
[0296]在从重组免疫球蛋白展示文库筛选和分离结合gp41的抗体之后，可以通过本文中所描述的标准的重组DNA技术从展示包装物(例如从噬菌体基因组)回收编码所选抗体的核酸，并将其亚克隆到其他表达载体中。如果需要，也可以如本文中所述对核酸进行进一步操作以产生其他抗体片段。为了表达通过筛选组合文库而分离到的重组抗体，可以如本文中所述将编码抗体的DNA克隆到重组表达载体中，并导入哺乳动物宿主细胞中。
[0297]可以使用本领域技术人员已知的各种手段将效应子分子例如治疗性、诊断性或检测部分连接到目标抗体。可以使用共价和非共价附连手段两者。用于将效应子分子附连于抗体的程序随着效应子的化学结构而变。多肽通常含有各种官能团，例如羧基(COOH)、游离胺基(-NH2)或巯基(-SH)，其可用于与抗体上的适合官能团反应，引起效应子分子的结合。或者，将抗体衍生化以暴露或附连其他反应性官能团。衍生化可以包括附连多种连接物分子中的任一种，例如可以从Pierce Chemical Company, Rockford, IL获得的连接物分子。连接物可以是用于将抗体联结到效应子分子的任何分子。连接物能够与抗体和效应子分子两者形成共价键。适合的连接物对于本领域技术人员来说是公知的，并且包括但不限于直链或支链碳连接物、杂环碳连接物或肽连接物。在抗体和效应子分子是多肽的情况下，可以将连接物通过组成氨基酸的侧链基团(例如通过半胱氨酸的二硫键)联结到所述组成氨基酸，或联结到末端氨基酸的α碳氨基和羧基。
[0298]在某些情况下，当免疫偶联物到达其靶位点时，希望从抗体上去除效应子分子。因此，在这些情况下，免疫偶联物包括在靶位点附近可以被切割的连键。切割连接物以从抗体释放效应子分子，可以通过免疫偶联物在靶细胞内或靶位点附近所经历的酶活性或条件来促进。
[0299]鉴于已报道了大量方法用于将各种放射诊断化合物、放射治疗化合物、标记物(例如酶或荧光分子)、药物、毒素和其他药剂附连到抗体，本领域技术人员能够确定用于将给定药剂附连到抗体或其他多肽的适合方法。
[0300]本文中公开的抗体或抗体片段可以被衍生化或连接到另一种分子(例如另一种肽或蛋白质)。一般来说 ，将抗体或其部分衍生化，使得与gp41的结合不受衍生化或标记的不利影响。例如，可以将抗体功能性连接(通过化学偶联、遗传融合、非共价结合等)到一种或多种其他分子实体，例如另一种抗体(例如双特异性抗体或双体抗体)、检测试剂、药剂和/或蛋白质或肽，其能够介导抗体或抗体部分与另一种分子(例如链霉亲和素核心区域或多组氨酸标签)的结合。
[0301]一种类型的衍生化抗体通过对两种或更多种抗体(相同类型或不同类型，以例如产生双特异性抗体)进行交联来产生。适合的交联剂包括具有被适合的间隔物分隔开的两个不同反应性基团的具有异源双功能的交联剂(例如(m-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)或具有同源双功能的交联剂(例如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)。这样的连接物可以从 Pierce Chemical Company (Rockford, IL)获得。
[0302]特异性结合gP41的抗体可以用可检测的部分标记。有用的检测试剂包括荧光化合物，包括荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、5-二甲基胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白、镧系元素磷光体等。也可以使用生物发光标志物例如荧光素酶、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白。还可以将抗体用可用于检测的酶标记，例如辣根过氧化物酶、β -半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。当将抗体用可检测的酶标记时，它可以通过添加被酶利用以产生可以被辨别的反应产物的其他试剂来检测。例如，当存在试剂辣根过氧化物酶时，添加过氧化氢和二氨基联苯胺能够产生可以目测检测的有色反应产物。抗体也可以用生物素标记，并通过亲和素或链霉亲和素结合的间接测量来检测。应该指出，亲和素本身可以用酶或突光标记物标记。
[0303]抗体可以用磁性试剂例如钆标记。抗体也可以用镧系元素(例如铕和镝)和锰标记。顺磁性粒子例如超顺磁氧化铁也可以用作标记物。抗体也可以用被第二报告物(例如亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)识别的预定的多肽表位来标记。在某些实施方式中，通过各种长度的间隔物臂来附连标记物，以减小潜在的空间位阻。
[0304]抗体也可以用放射性标记的氨基酸进行标记。发射性标记物可用于诊断和治疗两种目的。用于多肽的标记物的实例包括但不限于下列放射性同位素或放射性核苷酸:3h，14C, 15N, 35S790Y, "Tc, 111In, 1251,13110
[0305]抗体也可以用化学基团例如聚乙二醇(PEG)、甲基或乙基或糖基来衍生化。这些基团可用于改进抗体的生物学特性，例如增加血清半衰期或增加组织结合。
[0306]检测这样的标记物的手段对于本领域技术人员来说是公知的。因此，例如，可以使用照相底片或闪烁计数器来检测放射性标记物，可以使用光检测器检测发出的光来检测荧光标志物。酶标记物通常通过为所述酶提供底物并检测由酶对底物的作用产生的反应产物来检测，比色标记物通过简单地将有色标记物可视化来检测。
[0307]本公开还涉及从与gp41 (或gp41肽)复合的10E8、7H6和/或7N16抗体或其部分获得的晶体，与gp41 (或gp41肽)复合的10E8、7H6和/或7N16抗体或其部分的晶体结构，与gp41 (或gp41肽)复合的10E8、7H6和/或7N16抗体或其部分的三维坐标，以及与gp41 (或gp41肽)复合的10E8、7H6和/或7N16抗体或其部分的模型的三维结构。
[0308]本领域技术人员将会理解，与gp41或其部分复合的10E8、7H6和/或7N16抗体或其部分的一组结构坐标是定义了三维形状的相对的一组点。因此，有可能完全不同的一组坐标可以定义相似或相同的结构。此外，单个坐标的轻微变化对整个形状几乎没有影响。上面讨论的坐标的变化可能由结构坐标的数学操作产生。
[0309]本公开还提供了旨在为能够在对象中引发免疫应答的抗原性化合物产生结构和/或进行合理药物或化合物设计的系统，例如计算机系统。所述系统可以含有下列一项或多项或所有项:10E8、7H6和/或7N16抗体复合物的原子坐标数据或其子集，以及通过同源性建模从其产生的图，定义了 10E8、7H6和/或7N16抗体复合物或其至少一个亚结构域的三维结构的数据，或gp41的结构因子数据，所述结构因子数据可以从10E8、7H6和/或7N16抗体复合物的原子坐标数据或其子集和所述图产生。
[0310]B.多核苷酸和表达
[0311]编码本文中提供的多肽(包括但不限于抗体)的核酸分子(也称为多核苷酸)可以由本领域技术人员容易地产生。例如，可以使用本文中提供的氨基酸序列(例如CDR序列、重链和轻链序列)来产生这些核酸。
[0312]本领域技术人员可以容易地使用遗传密码来构建各种功能上等同的核酸，例如序列不同但编码同一抗体序列的核酸或编码包含 '和/或Vh核酸序列的偶联物或融合蛋白的核酸。
[0313]编码特异性结合gp41的抗体的核酸序列可以通过任何适合的方法来制备，所述方法包括例如适合序列的克隆，或通过例如下列方法直接化学合成:Narang等，Meth.Enzymol.68:90-99，197 的憐酸三酯方法；Brown 等，Meth.Enzymol.68:109-151，1979 的磷酸二酯方法；Beaucage等，Tetra.Lett.22:1859-1862, 1981的二乙基亚磷酰胺方法；Beaucage&Caruthers, Tetra.Letts.22 (20): 1859-1862，1981 所描述的固相亚憐酸胺三酯方法，例如如 Needham-VanDevanter 等，Nucl.Acids Res.12:6159-6168，1984 中所述使用自动化合成仪；以及美国专利号4，458，066的固相支持物方法。化学合成产生单链寡核苷酸。这可以通过与互补序列杂交或通过使用单链作为模板用DNA聚合酶进行聚合而转变成双链DNA。技术人员将会认识到，尽管DNA的化学合成一般限于约100碱基的序列，但通过连接较短的序列可以获得更长的序列。
[0314]示例性的核酸可以通过克隆技术来制备。适合的克隆和测序技术以及足以通过许多克隆练习来指导本领域技术人员的指南的实例存在于Samtoook等，同上，Berger和Kimmel主编，同上，和Ausubel,同上中。来自于生物试剂和实验设备制造商的产品信息也提供有用的信息。这样的制造商包括SIGMA Chemical Company (SaintLouis, MO)、R&D Systems (Minneapolis, MN)、Pharmacia Amersham (Piscataway, NJ) >CLONTECH Laboratories,Inc.(Palo Alto, CA)、Chem Genes Corp.、Aldrich ChemicalCompany(Milwaukee, WI)> Glen Research,Inc.、GIBCO BRL Life Technologies,Inc.(Gaithersburg, MD)、Fluka Chemica-B1chemika Analytika(Fluka ChemieAG, Buchs, Switzerland)> Invitrogen(Carlsbad,CA)和 Applied B1systems(FosterCity, CA)，以及技术人员已知的许多其他商业来源。
[0315]核酸可以通过扩增方法来制备。扩增方法包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、基于转录的扩增系统(TAS)、自维持序列复制系统(3SR)。对于本领域技术人员来说，广泛的各种克隆方法、宿主细胞和体外扩增方法是公知的。
[0316]编码本文中公开的任何抗体、Vh和/或 '(或其片段)的任何核酸可以在重组工程改造的细胞例如细菌、植物、酵母、昆虫和哺乳动物细胞中进行表达。这些抗体可以作为单个的％和/或'链表达，或者可以作为融合蛋白表达。还可以表达免疫粘附素。因此，在某些实施例中，提供了编码Vh和' 以及免疫粘附素的核酸。核酸序列可以任选地编码前导序列。
[0317]为了产生单链抗体(scFv)，将编码V1^Pt的DNA片段可操作地连接到编码柔性连接物例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另一个片段，使得Vh和'序列可以被表达为毗连的单链蛋白，其中'和Vh结构域由柔性连接物联结(参见例如Bird等，Science242:423-426，1988 ；Huston 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85: 5879-5883，1988 ；McCafferty等，Nature348:552-554, 1990)。任选地，可以在连接物中包含切割位点，例如弗林蛋白酶切割位点。
[0318]编码Vh和/或\的核酸任选地可以编码Fe结构域(免疫粘附素)。Fe结构域可以是IgA、IgM或IgG的Fe结构域。Fe结构域可以是优化过的Fe结构域，如已公布的美国专利申请号20100/093979中所述，所述专利申请通过参考并入本文。在一个实施例中，免疫粘附素是IgG1Ft在一个实施例中，免疫粘附素是IgG3Fc15
[0319]如果仅使用单个V1^P\，则单链抗体可以是单价的，如果使用两个V1^P \，则单链抗体可以是双价的，或者如果使用超过两个Vh和'，则单链抗体可以是多价的。可以产生特异性结合于gpl20和另一个分子例如gp41的双特异性或多价抗体。编码的V1^P '任选地可以在Vh与\结构域之间包含弗林蛋白酶切割位点。
[0320]预期本领域技术人员会了解可获得的用于蛋白质表达的大量表达系统，包括大肠杆菌、其他细菌宿主、酵母和各种高等真核细胞例如COS、CHO、HeLa和骨髓瘤细胞系。
[0321]宿主细胞可以是革兰氏阳性细菌，包括但不限于芽孢杆菌(Bacillus)、链球菌(Streptococcus)、链霉菌(Streptomyces)、葡萄球菌(Staphylococcus)、肠球菌(Enterococcus)、乳杆菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、梭状芽抱杆菌(Clostridium)、地芽抱杆菌(Geobacillus)和海洋芽抱杆菌(Oceanobacillus)。用于在革兰氏阳性细菌例如乳杆菌(Lactobacillus)中表达蛋白的方法在本领域中是公知的，参见例如已公布的美国专利申请号20100/080774。用于乳杆菌的表达载体被描述在例如美国专利号6，100, 388和美国专利号5，728，571中。为了在乳杆菌中表达，可以包含前导序列。革兰氏阴性细菌包括但不限于大肠杆菌(E.coli)、假单胞菌(Pseudomonas)、沙门氏菌(Salmonella)、弯曲杆菌(Campylobacter)、螺旋杆菌(Helicobacter)、黄杆菌(Flavobacterium)、梭形杆菌(Fusobacterium)、泥杆菌(Ilyobacter)、奈瑟氏菌(Neisseria)和服原体(Ureaplasma)。
[0322]编码抗体或其片段的一个或多个DNA序列可以通过将DNA转移到适合的宿主细胞中进行体外表达。细胞可以是原核或真核的。该术语还包括对象宿主细胞的任何后代。应该理解，由于可能存在复制期间发生的突变，因此所有后代不一定与亲代细胞相同。稳定转移的方法在本领域中是已知的，所述稳定转移意味着将外来DNA连续维持在宿主中。本公开还涵盖表达目标抗体的杂交瘤。
[0323]编码本文中描述的分离的蛋白的核酸的表达可以通过将DNA或cDNA可操作地连接到启动子(其是组成型或诱导型的)、然后掺入到表达盒中来实现。启动子可以是任何目标启动子，包括巨细胞病毒启动子和人类T细胞嗜淋巴病毒启动子(HTLV)-l。任选地，在构建物中包含增强子，例如巨细胞病毒增强子。表达盒可以适合于在原核细胞或真核细胞中复制和整合。典型的表达盒含有可用于调控编码蛋白质的DNA的表达的特定序列。例如，表达盒可以包含适合的启动子、增强子、转录和翻译终止子、起始序列、蛋白质编码基因前方的起始密码子(即ATG)、用于内含子的剪接信号、用于维持基因的正确阅读框以允许mRNA的正确翻译的序列以及终止密码子。载体可以编码可选择标志物，例如编码药物抗性(例如氨苄青霉素或四环素抗性)的标志物。
[0324]为了获得被克隆基因的高水平表达，希望构建至少含有指导转录的强启动子、用于翻译起始的核糖体结合位点(内部核糖体结合序列)和转录/翻译终止子的表达盒。对于大肠杆菌来说，这包括启动子例如HUrp、Iac或λ启动子,核糖体结合位点以及优选地转录终止信号。对于真核细胞来说，控制序列可以包括源自于例如免疫球蛋白基因、HTLV、SV40或巨细胞病毒的启动子和/或增强子以及多腺苷化序列，并且还可以包含剪接供体和/或受体序列(例如CMV和/或HTLV剪接受体和供体序列)。表达盒可以通过公知的方法转移到所选的宿主细胞内，所述方法例如用于大肠杆菌的转化或电穿孔以及用于哺乳动物细胞的磷酸钙处理、电穿孔或脂转染。被表达盒转化的细胞可以通过由表达盒中包含的基因例如amp、gpt、neo和hyg基因所赋予的抗生素抗性进行选择。
[0325] 当宿主是真核细胞时，可以使用的DNA转染方法为磷酸钙共沉淀、常规的机械程序例如微注射、电穿孔、插入被包装在脂质体中的质粒或病毒载体。也可以用编码抗体、标记的抗体或其抗体结合片段的多核苷酸序列以及编码可选择表型的第二种外来DNA分子例如单纯性疱疹病毒胸苷激酶基因来共转化真核细胞。另一种方法是使用真核病毒载体例如猿猴病毒40 (SV40)或牛乳头瘤病毒来瞬时感染或转化真核细胞并表达蛋白(参见例如〈〈真核病毒载体〉〉(Eukaryotic Viral Vectors), Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman主编，1982)。本领域技术人员可以容易地使用表达系统例如质粒和载体，用于在细胞中生产蛋白，所述细胞包括高等真核细胞例如COS、CHO、HeLa和骨髓瘤细胞系。
[0326]可以对编码本文中描述的多肽的核酸进行修饰，而不降低其生物活性。可以做出一些修饰以便于克隆、表达或将靶向分子掺入到融合蛋白中。这样的修饰对于本领域技术人员来说是公知的，并且包括例如终止密码子、在氨基端添加甲硫氨酸以提供起始位点、在任一端放置其他氨基酸以产生位置方便的限制性位点、或协助纯化步骤的其他氨基酸(例如聚His)。除了重组方法之外，本发明的免疫偶联物、效应子部分和抗体也可以使用本领域中公知的标准肽合成来完全或部分地构建。
[0327]在表达后，重组免疫偶联物、抗体和/或效应子分子可以按照本领域的标准程序进行纯化，所述程序包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析等(总的来说参见R.Scopes，《蛋白质纯化》(PROTEIN PURIFICAT1N)，Springer-Verlag, N.Y.，1982)。抗体、免疫偶联物和效应子分子不必是100%纯的。一旦根据需要部分纯化或纯化至均质后，如果在治疗上使用，多肽应该基本上不含内毒素。
[0328]用于从细菌例如大肠杆菌表达抗体和/或重折叠成适合的活性形式、包括单链抗体的方法已被描述并且是公知的，而且适用于本文中公开的抗体。参见Buchner等，Anal.B1chem.205:263-270，1992 ;Pluckthun,B1technology9:545, 1991 ；Huse 等，Science246:1275, 1989 和 Ward 等，Nature341:544, 1989。
[0329]通常，将来自于大肠杆菌或其他细菌的功能不均一的蛋白从包含体分离，并需要使用强变性剂溶解，随后重新折叠。在溶解步骤期间，正如本领域中公知的，必须存在还原剂以分开二硫键。含有还原剂的示例性缓冲液是:0.1M Tris pH8，6M胍，2mM EDTA，0.3MDTE (二硫苏糖醇)。二硫键的再氧化可以在还原和氧化形式的低分子量巯基试剂的存在下发生，正如在Saxena等，B1chemistry9:5015-5021, 1970中所描述的，特别是由Buchner等，同上所描述的。
[0330]复性通常通过将变性和还原的蛋白质在重折叠缓冲液中稀释(例如100倍)来实现。示例性的缓冲液是0.1M Tris,pH8.0,0.5M L-精氨酸，8mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)和2mM EDTA。
[0331]作为对双链抗体纯化流程的修改，将重链和轻链区独立地溶解和还原，然后组合在重折叠溶液中。当这两种蛋白以使一种蛋白超过另一种蛋白的摩尔过量倍数不超过5倍的摩尔比混合时，获得了示例性的得率。在氧化还原穿梭完成之后，可以向重折叠溶液加入过量的氧化型谷胱甘肽或其他氧化性低分子量化合物。
[0332]除了重组方法之外，本文中公开的抗体、标记的抗体及其抗体结合片段还可以使用标准的肽合成来全部或部分地构建。长度小于约50个氨基酸的多肽的固相合成可以通过将序列的C-端氨基酸附连于不溶性支持物，然后顺序添加序列中的其余氨基酸来实现。用于固相合成的技术被描述在下列文献中:Barany&Merrifield,《肽:分析,合成，生物学》第2卷:肽合成中的特殊方法，部分A (The Peptides:Analysis, Synthesis, B1logy.Vol.2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A.), pp.3-284 ；Merrifield等，J.Am.Chem.Soc.85:2149-2156，1963 ;以及 Stewart 等，《固相妝合成》(Solid PhasePeptide Synthesis),第二版,Pierce Chem.C0., Rockford, 111., 1984。长度更长的蛋白可以通过将较短片段的氨基和羧基端进行缩合来合成。通过羧基端末端的活化(例如利用偶联剂N，N’ - 二环己基碳二酰亚胺)形成肽键的方法在本领域中是公知的。
[0333]C.组合物和治疗方法
[0334]本文中公开了用于预防或治疗HIV感染例如HIV-1感染的方法。预防可以包括抑制HIV-1的感染。所述方法包括将细胞与有效量的本文中公开的特异性结合gp41的人类单克隆抗体或其抗体结合片段或编码这样的抗体或其抗体结合片段的核酸相接触。所述方法还可以包括向对象施用治疗有效量的所述人类单克隆抗体或其抗体结合片段或编码这样的抗体或其抗体结合片段的核酸，例如所述抗体结合片段可以是嫁接在蛋白质支架上的一个或多个CDR。在某些实施例中，抗体或其抗体结合片段或编码这样的抗体或其抗体结合片段的核酸可以在暴露后预防中使用。在某些实施例中，抗体或其抗体结合片段或编码这样的抗体或其抗体结合片段的核酸可用于消除病毒贮库。例如，可以将治疗有效量的抗体或其抗体结合片段或编码这样的抗体或其抗体结合片段的核酸施用于用抗病毒疗法治疗的对象。在某些实施例中，对抗体或其抗体结合片段进行修饰以使它对被感染的细胞具有直接细胞毒性，或利用天然防御例如补体、抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)或巨噬细胞的吞噬作用。
[0335]测定中和活性的方法包括但不限于在Martin等，(2003) NatureB1technology21:71-76中描述的单循环感染测定法。在这种测定法中，通过其活性反映出样品中的活病毒的量的可选择标志物测量病毒的活性水平，并确定IC50。在其他测定法中，可以在PMl细胞系或原代细胞(正常PBMC)中监测急性感染。在这种测定法中，可以通过使用ELISA测定p24浓度来监测病毒的活性水平。参见例如Martin等，(2003)NatureB1technology21:71-76。
[0336]对于有效的组合物来说，HIV感染不必被完全消除。例如，与不存在组合物情况下的HIV感染相比，组合物可以将HIV感染降低所需量，例如至少10 %、至少20 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %、至少98 %或甚至至少100 % (消除可检测到的HIV感染细胞)。在实施例中，还将细胞与有效量的其他药剂例如抗病毒药剂相接触。细胞可以是体内或体外的。方法可以包括施用本领域中已知的一种或多种其他药剂。在其他实施例中，通过类似的方法可以减少或抑制HIV复制。对于有效的组合物来说，HIV复制不必被完全消除。例如，与不存在组合物情况下的HIV复制相比，组合物可以将HIV复制降低所需量，例如至少10 %、至少20 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90%、至少95%、至少98%或甚至至少100% (消除可检测到的HIV)。在一个实施例中，还将细胞与有效量的其他药剂例如抗病毒药剂相接触。细胞可以是体内或体外的。
[0337]提供了在载体中包含本文中所公开的一种或多种特异性结合gp41的抗体或其抗体结合片段或编码这样的抗体或其抗体结合片段的核酸的组合物。可以将组合物制备成单位剂型用于施用于对象。施用的量和时间安排由治疗医师决定，以实现所需目的。可以将抗体配制成用于全身或局部施用。在一个实施例中，特异性结合gp41的抗体或其抗体结合片段或编码这样的抗体或其抗体结合片段的核酸被配制成用于肠胃外施用例如静脉内施用。
[0338]用于施用的组合物可以包括溶解在药学可接受的载体例如水性载体中的特异性结合gp41的抗体或其抗体结合片段或编码这样的抗体或其抗体结合片段的核酸的溶液。可以使用各种水性载体例如缓冲盐水等。这些溶液是无菌的，并且一般不含不想要的物质。这些组合物可以通过常规的公知的灭菌技术来灭菌。根据需要，组合物可以含有药学可接受的辅助物质以接近生理条件，例如PH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。在这些制剂中的抗体浓度可以广泛变化，并且按照所选择的具体施用方式和对象的需要，主要根据流体体积、粘度、体重等来选择。
[0339]用于静脉内施用的典型的药物组合物包括每天每位对象约0.1至1mg抗体。可以使用每天每位对象0.1mg至约10mg的剂量，特别是如果药剂被施用到计划位点并且不进入循环或淋巴系统，例如进入体腔或进入器官的内腔的话。用于制备可施用组合物的真正方法对于本领域技术人员来说是已知的或明显的，并且被更详细地描述在诸如《雷明顿制药学》(Remington’s Pharmaceutical Science),第 19 版，Mack PublishingCompany, Easton, PA (1995)的出版物中。
[0340]抗体或其抗体结合片段或编码这样的抗体或其抗体结合片段的核酸可以以冷冻干燥形式提供并在施用之前用无菌水重新水合，尽管它们也可以被提供为已知浓度的无菌溶液。然后将抗体或其抗体结合片段或编码这样的抗体或其抗体结合片段的核酸的溶液加入到含有0.9%氯化钠USP的输注袋中，并通常以0.5至15mg/kg体重的剂量施用。自从RITUXAN?在1997年被批准以来，在本领域中可以获得相当多的关于在美国销售的抗体药物的施用的经验。抗体或其抗体结合片段或编码这样的抗体或其抗体结合片段的核酸可以通过缓慢输注而不是静脉内快速输注或推注来施用。在一个实施例中，施用较高的负荷剂量，随后以较低水平施用维持剂量。例如，可以在约90分钟的时间段内输注4mg/kg的初始负荷剂量，如果先前的剂量被良好耐受的话，随后进行4-8周的在30分钟时间段内输注2mg/kg的每周维持剂量。
[0341]人类gP41特异性抗体或其抗体结合片段或编码这样的抗体或其抗体结合片段的核酸的治疗有效量取决于疾病和/或感染的严重性以及患者的总体健康状况。抗体的治疗有效量是提供症状的主观缓解或者由临床医生或其他有资格的观察人员注意到的客观可辨识的改善的量。这些组合物可以同时或顺序地与另一种治疗剂联合施用。
[0342]在一种实施方式中，所述抗体或其抗体结合片段或编码这样的抗体或其抗体结合片段的核酸的施用导致对象中HIV感染的建立减少和/或随后的HIV疾病进展减轻。HIV感染的建立减少和/或随后的HIV疾病进展减轻包含HIV活性的任何统计学显著的减少。在某些实施方式中，公开了用于治疗患有HIV-1感染的对象的方法。这些方法包括向对象施用治疗有效量的抗体或编码所述抗体的核酸，由此预防或治疗HIV-1感染。
[0343]研究显示，当将齐多夫定在妊娠和分娩期间施用于感染HIV的女性并在出生后施用于子女时，HIV从母亲传播到婴儿的比率被显著降低(Connor等，1994Pediatr InfectDis J14:536-541) 0数项HIV的母婴传播研究证实了分娩时的母体病毒载量与HIV向儿童的传播风险之间的关联性。本公开提供了可用于减少HIV从母亲向婴儿传播的分离的人类单克隆抗体。因此，在某些实施例中，施用治疗有效量的人类gp41特异性抗体或其抗体结合片段或编码这样的抗体或其抗体结合片段的核酸，以便防止HIV从母亲向婴儿的传播或降低HIV从母亲向婴儿传播的风险。在某些实施例中，在分娩时向母亲和/或婴儿施用治疗有效量的抗体或其抗体结合片段或编码这样的抗体或其抗体结合片段的核酸。在其他实施例中，在哺乳之前向母亲和/或婴儿施用治疗有效量的抗体，以便防止病毒向婴儿的传播或降低病毒向婴儿传播的风险。在某些实施方式中，向母亲和/或婴儿施用治疗有效量的抗体和治疗有效量的另一种药剂例如齐多夫定两者。
[0344]对于任何应用来说，抗体或其抗体结合片段或编码这样的抗体或其抗体结合片段的核酸可以与抗反转录病毒疗法组合。抗反转录病毒药物在广义上通过所述药物抑制的反转录病毒生活周期的阶段进行分类。本公开的抗体可以与下列药物联合施用:核苷类似物反转录酶抑制剂(例如齐多夫定、去羟肌苷、扎西他宾、司他夫定、拉米夫定、阿巴卡韦、恩曲他滨、恩替卡韦和apricitabine)，核苷酸反转录酶抑制剂(例如替诺福韦和阿德福韦)，非核苷反转录酶抑制剂(例如依法韦仑、奈韦拉平、地拉韦啶、依曲韦林和利匹韦林)，蛋白酶抑制剂(例如沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦、安泼那韦、洛匹那韦、福沙那韦、阿扎那韦、替拉那韦和达芦那韦)，进入或融合抑制剂(例如马拉维若和恩夫韦地)，成熟抑制剂(例如bevirimat和vivecon)或广谱抑制剂例如天然抗病毒剂。在某些实施例中，所公开的抗体或其活性片段或编码它们的核酸与IL-15联合施用或偶联于IL-15施用。
[0345]在某些实施例中，对象被进一步施用一种或多种结合HIV糖蛋白例如gpl20和gp41的其他抗体。可以与本公开的抗体联合施用的中和性抗体的实例可以在2011年3月31日公布的国际专利公布号W02011/038290中找到，所述专利的全部内容特别地通过参考并入本文。
[0346]包含本文公开的抗体的组合物的单次或多次施用根据患者所需和耐受的剂量和频率来进行。在任何情况下，组合物应该提供足够量的至少一种本文公开的抗体，以有效地治疗患者。剂量可以被施用一次，但是可以周期性地使用直至实现治疗效果或直至副作用要求中断治疗。在一个实施例中，每隔一日，在30分钟内输注一剂抗体。在这一实施例中，可以施用约I至约10剂， 例如可以每隔一日施用共3或6剂。在其他实施例中，进行约5至约10日的连续输注。对象可以以规则的间隔例如每月进行治疗，直至获得所需治疗结果。一般来说，剂量足以治疗或改善疾病的症状和征兆，并且不对患者产生不可接受的毒性。
[0347]受控释放的肠胃外制剂可以被制造成植入物、油性注射液或作为颗粒系统。对于蛋白质递送系统的广泛概述，参见Banga，A.J.，《治疗性肽和蛋白质:配制、加工和递送系统〉〉(Therapeutic Peptides and Proteins:Formulat1n, Processing, and DeliverySystems), Technomic Publishing Company, Inc.，Lancaster, PA, (1995)。颗粒系统包括微球、微粒、微囊、纳米囊、纳米球和纳米粒子。微囊含有治疗性蛋白例如细胞毒素或药物作为中央核心。在微球中，治疗药剂分散在整个粒子中。小于约Iym的粒子、微球和微囊一般分别被称为纳米粒子、纳米球和纳米囊。毛细管具有约5 μ m的直径，使得只有纳米粒子可以被静脉内施用。纳米粒子的直径通常为100 μ m左右，并且通过皮下或肌内施用。参见例如 Kreuter, J.，《胶体药物递送系统》(Colloidal Drug Delivery Systems), J.Kreuter主编，Marcel Dekker, Inc., New York, NY, pp.219-342 (1994);和 Tice&Tabibi,《受控药物递送专题论文》(Treatise on Controlled Drug Delivery), A.Kydonieus 主编，MarcelDekker, Inc.New York, NY, pp.315-339，(1992)。
[0348]聚合物可用于本文公开的抗体组合物的离子控制的释放。各种用于受控药物递送的可降解和不可降解的聚合物基质是本领域已知的(Langer, Accounts Chem.Res.26:537-542, 1993)。例如，嵌段共聚物泊洛沙姆407，在低温下作为粘稠但仍可流动的液体存在，但在体温下形成半固体凝胶。已显示，它是用于重组白介素-2和脲酶的配制和持续递送的有效介质(Johnston 等，Pharm.Res.9:425-434，1992 ;和 Pec 等，J.Parent.Sc1.Tech.44(2):58-65, 1990)。可替选地，已将羟基磷灰石用作蛋白质受控释放的微型载体(Ijntema等,Int.J.Pharm.112:215-224，1994)。在另一种情况下,将脂质体用于脂质包封的药物的受控释放以及药物祀向(B etageri等，《脂质体药物递送系统》(LiposomeDrug Delivery Systems), Technomic Publishing C0.，Inc.，Lancaster, PA(1993))。用于治疗性蛋白的受控释放的大量其他系统是已知的(参见美国专利号5，055，303，美国专利号5，188，837，美国专利号4，235，871，美国专利号4，501，728，美国专利号4，837，028，美国专利号4，957，735，美国专利号5，019, 369，美国专利号5，055, 303，美国专利号5，514，670，美国专利号5，413，797，美国专利号5，268，164，美国专利号5，004，697，美国专利号4，902，505，美国专利号5，506，206，美国专利号5，271，961，美国专利号5，254，342和美国专利号 5，534，496)。
[0349]在某些实施例中，对象被施用编码抗体或其抗体结合片段的DNA，例如抗体结合片段可以是嫁接到蛋白质支架上的一个或多个CDR，以例如使用对象的细胞机制来提供体内抗体生产。用核酸构建物进行免疫在本领域中是公知的，并在例如美国专利号5，643，578、美国专利号5，593，972和美国专利号5，817，637中有教导。美国专利号5，880，103描述了将编码核酸递送到生物体的数种方法。所述方法包括核酸的脂质体递送。本领域普通技术人员可以将这样的方法应用于抗体或其抗体结合片段的生产。
[0350]一种核酸施用方法是使用质粒DNA例如使用哺乳动物表达质粒的直接施用。可以将编码本公开的抗体或其抗体结合片段的核苷酸序列置于启动子的控制之下以提高表达。
[0351]在使用核酸的另一种方法中，也可以通过减毒的病毒宿主或载体或细菌载体来表达本公开的抗体或其抗体结合片段。可以使用重组痘苗病毒、腺相关病毒(AAV)、疱疹病毒、反转录病毒、巨细胞病毒或其他病毒载体来表达抗体。例如，痘苗病毒载体和方法以及有用的方案被描述在美国专利号4，722，848中。BCG(卡介苗(Bacillus Calmette Guerin))提供了用于表达本公开的抗体的另一种载体(参见Stover, Nature351:456-460, 1991)。
[0352]在一种实施方式中，将编码本公开的抗体或其抗体结合片段的核酸直接导入到细胞中。例如，可以通过标准方法将核酸装载到金微球上，并通过诸如B1-Rad的HEL10S?基因枪的装置导入到皮肤中。核酸可以是“裸露的”，由在强启动子的控制之下的质粒构成。
[0353]通常将DNA注射到肌肉内，尽管它也可以被直接注射到其他位点中。用于注射的剂量通常为约0.5 μ g/kg至约50mg/kg,通常为约0.005mg/kg至约5mg/kg(参见例如美国专利号 5，589,466)。
[0354]D.诊断方法和试剂盒
[0355]本文提供了用于在体外或体内检测gp41的表达的方法。在一个实施例中，检测生物样品中gp41的表达，并且当样品中存在HIV-1时可以将gp41的表达用于检测HIV-1感染。样品可以是任何样品，包括但不限于来自于活检、尸检和病理样本的组织。生物样品还包括组织切片，例如为组织学目的而获取的冷冻切片。生物样品还包括体液，例如血液、血清、血浆、痰液、脑脊液或尿液。
[0356]在数种实施方式中，提供了用于在对象中检测AIDS和/或HIV-1感染的方法。本公开提供了用于在生物样品中检测HIV-1的方法，其中所述方法包括将生物样品与抗体在有助于免疫复合物形成的条件下相接触并检测所述免疫复合物，以检测生物样品中的gp41。在一个实施例中，样品中gp41的检测表明对象具有HIV感染。在另一个实施例中，样品中gp41的检测表明对象患有AIDS。在另个实施例中，样品中gp41的检测证实了对象中AIDS和/或HIV-1感染的诊断。
[0357]在某些实施方式中，本公开的抗体被用于测试疫苗。例如，测试疫苗组合物是否采取与gp41肽相同的构象。因此，本文提供了用于测试疫苗的方法，其中所述方法包括将含有疫苗例如gp41免疫原的样品与抗体在有助于免疫复合物形成的条件下相接触并检测所述免疫复合物，以检测样品中的疫苗。在一个实施例中，样品中免疫复合物的检测表明疫苗组分例如gp41免疫原采取能够结合抗体的构象。
[0358]在一种实施方式中，将抗体用可检测标记物直接标记。在另一种实施方式中，结合gp41的抗体(第一抗体)是未标记的，并且使用能够与结合gp41的抗体结合的第二抗体或其他分子。正如本领域技术人员公知的，选择能够特异性结合特定物种和类别的第一抗体的第二抗体。例如，如果第一抗体是人类IgG，那么第二抗体可以是抗人类IgG抗体。能够结合于抗体的其他分子包括但不限于蛋白A和蛋白G，二者是可商购的。
[0359]适用于抗体或第二抗体的标记物如上文所描述，并包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、磁性试剂和放射活性材料。适合的酶的非限制性实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β -半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶。适合的辅基复合物的非限制性实例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素。适合的荧光材料的非限制性实例包括伞形酮、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白。非限制的示例性发光材料是鲁米诺；非限制的示例性磁性试剂是钆，非限制的示例性放射活性标记物包括1251、1311、35S 或 3η。
[0360]本文公开的免疫测定和方法可用于大量目的。用于检测多肽的试剂盒通常包括结合gp41的抗体，例如本文中公开的任何抗体。在某些实施方式中，试剂盒中包括抗体片段，例如Fv片段或Fab。在其他实施方式中，抗体被标记(例如使用荧光、放射活性或酶标记物)。
[0361]在一种实施方式中，试剂盒包括公开了使用方式的说明材料。说明材料可以是书面的、采取电子形式(例如计算机磁盘或光盘)，或者可以是可视的(例如视频文件)。试剂盒还可以包括其他组分，以便于为试剂盒所设计的特定应用。因此，例如，试剂盒还可以含有检测标记物的手段(例如用于酶标记物的酶底物，用于检测荧光标记物的滤光片组，适合的第二标记物例如第二抗体等)。试剂盒还可以包括缓冲液和常规用于特定方法的实践的其他试剂。这样的试剂盒和适合的内含物对于本领域技术人员来说是公知的。
[0362]在一种实施方式中，诊断试剂盒包括免疫测定体系。尽管免疫测定体系的详细情况可能随着所使用的具体形式而变，但检测生物样品中gp41的方法一般包括将生物样品与在免疫反应性条件下与gp41特异性反应的抗体相接触。允许抗体在免疫反应性条件下特异性结合以形成免疫复合物，并直接或间接检测免疫复合物(结合的抗体)的存在。
[0363]E.鉴定目标抗体的方法
[0364] 提供了用于产生特异性结合于靶抗原的单克隆抗体的方法。这些方法包括从已经暴露于靶抗原的对象分离记忆性B细胞群体，其中所述记忆性B细胞是CD19+IgA-1gD-1gM-B细胞。将分离的记忆性B细胞群体与有效量的IL_21、IL_2和CD40配体(CD40L)相接触，并从分离的记忆性B细胞群体分离mRNA。从细胞分离编码抗体的可变重链和可变轻链的核酸，并表达所述可变重链和可变轻链。然后从可变重链和可变轻链的组合选择包括特异性结合于靶抗原的可变重链和可变轻链的单克隆抗体。
[0365]在某些实施方式中，从来自于以前暴露于目标抗原的对象的生物样品分离记忆性B细胞群体。将记忆性B细胞群体分成亚群，将所述亚群与有效量的⑶40L、IL-2和IL-21接触足以使记忆性B细胞经历细胞分裂并产生抗体的时间量。为记忆性B细胞的亚群确定特异性结合于目标抗原的抗体的存在或不存在。如果确定记忆性B细胞亚群产生特异性结合于目标抗原的抗体，则选择该亚群。可以确定由所选亚群的记忆性B细胞产生的抗体的重链和轻链可变结构域的编码核酸序列，并生产含有由所选亚群的记忆性B细胞产生的抗体的重链和轻链可变区的单克隆抗体。测定单克隆抗体对目标抗原的特异性结合，并选择特异性结合于目标抗原的抗体，由此鉴定特异性结合于目标抗原的抗体。
[0366]还提供了从对象分离特异性针对靶抗原的B细胞的全部组成成分的方法。这些方法包括从已经暴露于靶抗原的对象分离记忆性B细胞群体，其中所述记忆性B细胞是CD19+IgA-1gD-1gM-B细胞。将分离的记忆性B细胞群体与有效量的IL_21、IL_2和CD40相接触，并从所述群体选择表达特异性结合靶抗原的抗体的B细胞。这些方法还可以包括分离核酸文库，所述文库编码从核酸分离的免疫球蛋白的可变重链和可变轻链。然后表达可变重链和可变轻链的文库，以从对象分离特异性针对靶抗原的B细胞的全部组成成分。
[0367]针对实体例如病原体或疫苗的体液全部组成成分、包括但不限于全体液全部组成成分，可以提供多维信息(例如特异性、亲和性、稳定性、基因区段序列偏好性等)，其可以被认为是对象的体液应答的“分布情况”。这些参数的定量(Story等，2008PNAS105(46): 17902-17907)可用于与针对病原体的保护或缺乏保护相关联。然后可以将这一信息以迭代方式告知疫苗设计，为特定抗原的多参数诊断测定法提供基础，或者直接用于鉴定针对给定病原体的单个或多个中和性抗体。
[0368]在某些实施方式中，可以对抗体进行表征。例如，可以收集描述所述特征例如特异性、亲和性、稳定性、同种型、基因区段序列偏好性等的多参数数据集(Story等，2008PNAS105 (46): 17902-17907)。在某些代表性的非限制性实施方式中，可以使用分布情况或多参数数据集以迭代方式告知疫苗设计，为特定抗原的多参数诊断测定法提供基础，或者直接用于鉴定针对给定病原体的单个或多个中和性抗体。
[0369]因此，本文公开的方法可用于分离特异性结合靶抗原的一种或多种单克隆抗体，和/或可用于在样品或对象中分离结合靶抗原的B细胞全部组成成分。靶抗原可以来自于病原体，包括病毒、寄生虫、真菌和细菌。在某些实施方式中，病原体是病毒，例如但不限于来自于下列病毒科之一的病毒:反转录病毒科(Retroviridae)(例如人免疫缺陷病毒(HIV)、人类T细胞白血病病毒(HTLV));小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)(例如脊髓灰质炎病毒、甲肝病毒、丙肝病毒、肠病毒、人类柯萨奇病毒、鼻病毒、艾柯病毒、手足口病病毒)；杯状病毒科(Calciviridae)(例如引起肠胃炎的病毒株)；披膜病毒科(Togaviridae)(例如马脑炎病毒、风疫病毒)；黄病毒科(Flaviridae)(例如登革病毒、黄热病病毒、西尼罗病毒、圣路易斯脑炎病毒、日本脑炎病毒和其他脑炎病毒)；冠状病毒科(Coronaviridae)(例如冠状病毒、严重急性呼吸综合征(SARS)病毒)；弹状病毒科(Rhabdoviridae)(例如水泡性口炎病毒、狂犬病病毒)；纤丝病毒科(Filoviridae)(例如埃博拉病毒)；副粘病毒科(Paramyxoviridae)(例如副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒(RSV));正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如流感病毒)；布尼亚病毒科(Bunyaviridae)(例如汉坦病毒、辛诺桕病毒、裂谷热病毒、布尼亚病毒、白蛉病毒和内罗病毒)；砂粒病毒科(Arena viridae)(出血热病毒、马秋波病毒、胡宁病毒)；呼肠孤病毒科(Reoviridae)(例如呼肠孤病毒、环状病毒和轮状病毒)；双核糖核酸病毒科(Birnaviridae);嗜肝病毒科(Hepadnaviridae)(乙肝病毒)；细小病毒科(Parvoviridae)(细小病毒)；乳多空病毒科(Papovaviridae)(乳头瘤病毒、多瘤病毒、BK病毒)；腺病毒科(Adenoviridae)(大多数腺病毒)；疱疫病毒科(Herpesviridae)(单纯性疱疹病毒(HSV)-1和HSV-2、巨细胞病毒(CMV)、Epstein-Bair病毒(EBV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)和其他疱疹病毒，包括HSV-6);痘病毒科(Poxviridae)(天花病毒、痘苗病毒、痘病毒)；和虹彩病毒科(Iridoviridae)(例如非洲猪瘟热病毒)；纤丝病毒科(Filoviridae)(例如埃博拉病毒、马尔堡病毒)；嵌杯病毒科(Caliciviridae)(例如诺瓦克病毒)和未分类的病毒(例如海绵状脑病的病原、丁型肝炎的因子(据认为是乙肝病毒的缺陷的卫星)和星状病毒)。
[0370]在其他实施方式中，靶抗原是来自于细菌的抗原，例如但不限于幽门螺旋杆菌(Helicobacter pyloris)、伯氏疏螺旋体(Borelia burgdorferi)、嗜肺性军团菌(Leg1nella pneumophilia)、分枝杆菌属菌种(Mycobacteria sps)(例如结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、鸟分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.1ntracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansaii)、戈登分枝杆菌(M.gordonae))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、酿胺链球菌(Streptococcus pyogenes) (A群链球菌)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae) (B群链球菌)、链球菌(Streptococcus)(草绿色(viridans)群)、类链球菌(Streptococcus faecalis)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、链球菌(Streptococcus)(厌氧性(anaerobic)菌种)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、病原性弯曲杆菌菌种(pathogenic Campylobacter sp.)、肠球菌菌种(Enterococcus sp.)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)、白喉棒状杆菌(corynebacterium diphtheriae)、棒状杆菌菌种(corynebacterium sp.)、红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhus1pathiae)、产气夹膜梭状芽胞杆菌(Clostridium perfringers)、破伤风梭状芽胞杆菌(Clostridium tetani)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、多杀巴氏杆菌(Pasturella multocida)、拟杆菌属菌种(Bacteroides sp.)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、念珠状链杆菌(StreptobaciIIus moniliformis)、梅毒密螺旋体(Treponema pallidium)、细弱密螺旋体(Treponema pertenue)、钩端螺旋体(Leptospira)或以色列放线菌(Actinomycesisraelii)。
[0371]在其他实施方式中，抗原来自于真菌，例如新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)、荚膜组织胞衆菌(Histoplasma capsulatum)、粗球抱子菌(Coccid1idesimmitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)或白假丝酵母(Candida albicans)。在其他实施方式中，抗原来自于寄生虫，例如但不限于恶性痕原虫(Plasmodium falciparum)或刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)。
[0372]在某些实施方式中，抗原是癌抗原。癌症可以是实体肿瘤或血液癌。在特定实施例中，实体肿瘤是肉瘤或癌例如纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨性肉瘤或另一种肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、恶性淋巴瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸癌、膀胱癌或CNS肿瘤(例如神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤，听神经瘤、少突胶质细胞瘤、menang1ma、黑素瘤、神经母细胞瘤或视网膜母细胞瘤)。
[0373]在某些实施例中，血液癌是白血病，例如急性白血病(例如急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性髓性白血病以及成髓细胞性、早幼粒细胞性、髓单核细胞性、单核细胞性和红细胞性白血病)、慢性白血病(例如慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性髓性白血病和慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(无痛和高级形式)、多发性骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病或脊髓发育不良。
[0374]肿瘤抗原在本领域中是公知的，并包括例如癌胚抗原(CEA)、人类绒毛膜促性腺激素(HCG)、α -甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP(AFP_L3)、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CAIX、人类端粒酶反转录酶(hTERT)、RUU RU2 (AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70_2、M-CSF、前列腺酶、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-ULAGE-la, p53、prostein、PSMA, Her2/neu、存活素和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1 (PCTA-1)、黑素瘤相关抗原(MAGE)、ELF2M、中性粒细胞弹性蛋白酶、ephrinB2和⑶22。CH2或CH3结构域分子也可以结合任何癌相关蛋白例如IGF-1, IGF-1I, IGR-1R或间皮素。其他肿瘤相关抗原被提供在下面的表中:
[0375]示例性肿瘤及其肿瘤抗原
[0376]

【权利要求】
1.一种分离的人类单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含重链和轻链，其中 所述重链包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列； 所述抗体或抗原结合片段特异性结合gp41 ； 所述抗体或抗原结合片段直接接触LWNWFDITNWLWYIR(SEQ ID NO:26，第14-28位残基)所不的氣基酸序列中用粗体不出的L、WF> Lff和R ;并且 所述抗体或抗原结合片段是中和性的。
2.一种分离的人类单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含重链和轻链，其中 所述重链包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列； 所述抗体或抗原结合片段特异性结合gp41 ； 所述抗体或抗原结合片段是中和性的；并且其中 (a)所述抗体或抗原结合片段直接接触SLWNWFDITNWLWYIR(SEQID NO:26，第13-28位残基)所示的氨基酸序列中用粗体示出的SLW、WF、LW和R ;
(b)所述抗体或抗原结合片段接触LELDKWASLWNWFDITNWLWYIR(SEQID勵:26，第6_28位残基)所示的氨基酸序列中用粗体示出的L、DK、SLffNWF, TN、Lff和IR ； (c)所述抗体或抗原结合片段接触NWFDITNWLWYIR(SEQID NO: 13，第7_19位残基)所示的氨基酸序列中用粗体示出的NWF、T和R ;或者 (d)所述抗体或抗原结合片段接触KWASLWNWFDITNWLWYIR(SEQID NO:13)所示的氨基酸序列中用粗体示出的K、SLNWF, T和IR。
3.权利要求1或权利要求2的分离的人类单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含 SEQ ID NO:1、3、5、147-149、189-192 或 200-204 之一的第 26-33 位(HCDRl)、第 51-60 位(HCDR2)和第 99-120 位(HCDR3)氨基酸。
4.权利要求1或权利要求2的分离的人类单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含与SEQ ID NO:1、3、5、147-149、189-192或200-204之一所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。
5.权利要求1或权利要求2的分离的人类单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含互补决定区和构架区，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:1、3、5、147-149、189-192或200-204之一所示的氨基酸序列并具有至多10个氨基酸置换，其中所述氨基酸置换在所述构架区中。
6.权利要求1或权利要求2的分离的人类单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，其中X1是Q或R，X2是V或A，X3是S或Y，并且乂‘是！1或I。
7.权利要求1或权利要求2的分离的人类单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体的重链可变区包含SEQ ID NO:1、3、5、147-149、189-192或200-204之一所示的氨基酸序列。
8.前述权利要求任一项的分离的人类单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少约80%同一性的氨基酸序列。
9.权利要求1-8任一项的分离的人类单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含 SEQ ID NO:2、4、6、150-152 或 164-186 之一的第 26-31 位(LCDRl)、第 49-51 位(IXDR2)和第 87-98 位(IXDR3)氨基酸。
10.权利要求1-8任一项的分离的人类单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:2、4、6、12、150-152或164-186之一所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。
11.权利要求1-8任一项的分离的人类单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列，其中X1是E或D，X2是Y或H，X3是V或I，X4是V或I，X5是S或T，X6是D或E，X7是E或D，并且X8是T或I。
12.权利要求1-8任一项的分离的人类单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:2、4、6、150-152或164-186之一所示的氨基酸序列。
13.权利要求1-8任一项的分离的人类单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含互补决定区和构架区，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:2、4、6、150-152或164-186之一所示的氨基酸序列并具有至多10个氨基酸置换，其中所述氨基酸置换在所述构架区中。
14.权利要求1或权利要求2的分离的人类单克隆抗体或其抗原结合片段，其中: 所述重链可变区包含与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列； 所述重链可变区包含与SEQ ID NO:154所示的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:152所示的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列；或者 所述重链可变区包含与SEQ ID NO:192所示的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:152所示的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。
15.权利要求1或权利要求2的分离的人类单克隆抗体或其抗原结合片段，其中: 所述重链可变区包含SEQ ID NO:1的第26-33位(HCDRl)、第51-60位(HCDR2)和第99-120位(HCDR3)氨基酸，并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:2的第26-31位(LCDRl)、第 49-51 位(LCDR2)和第 87-98 位(LCDR3)氨基酸； 所述重链可变区包含SEQ ID NO:154的第26-33位(HCDRl)、第51-60位(HCDR2)和第99-120位(HCDR3)氨基酸，并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:152的第26-31位(LCDRl)、第 49-51 位(LCDR2)和第 87-98 位(LCDR3)氨基酸；或者 所述重链可变区包含SEQ ID NO:192的第26-33位(HCDRl)、第51-60位(HCDR2)和第99-120位(HCDR3)氨基酸，并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:152的第26-31位(LCDRl)、第 49-51 位(LCDR2)和第 87-98 位(LCDR3)氨基酸。
16.权利要求1或权利要求2的分离的人类单克隆抗体或其抗原结合片段，其中: 所述重链可变区包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含SEQID NO: 2所示的氨基酸序列； 所述重链可变区包含SEQ ID NO:154所示的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含SEQID NO:152所示的氨基酸序列；或者 所述重链可变区包含SEQ ID NO:192所示的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含SEQID NO:152所示的氨基酸序列。
17.前述权利要求任一项的分离的人类单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区是来自于供体N152的克隆变体，其中重链由VH3-15基因和VJ-1J基因编码。
18.前述权利要求任一项的分离的人类单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区是来自于供体N152的克隆变体，其中轻链由LV3-19V基因和LJ-3J基因编码。
19.权利要求1-18任一项的分离的人类单克隆抗体，其中所述抗体是IgG、IgM或IgA抗体。
20.前述权利要求任一项的分离的人类单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以低于50 μ g/ml的抑制浓度(IC50)中和图17C-17F中列出的至少98%的HIV-1分离株。
21.前述权利要求任一项的分离的人类单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以低于I μ g/ml的抑制浓度(IC50)中和图17C-17F中列出的至少72%的HIV-1分离株。
22.—种双特异性抗体，其包含前述权利要求任一项的分离的人类单克隆抗体或其抗原结合片段。
23.权利要求1-22任一项的抗原结合片段。
24.权利要求23的抗原结合片段，其中所述片段是Fab片段、Fab’片段、F(ab) ’ 2片段、单链Fv蛋白(scFv)或二硫键稳定的Fv蛋白(dsFv)。
25.权利要求24的抗原结合片段，其中所述片段是Fab片段。
26.权利要求23-25任一项的分离的抗原结合片段，其连接到Fe结构域和/或IL-15。
27.权利要求1-26任一项的分离的人类单克隆抗体或抗原结合片段，其连接到效应子部分。
28.权利要求27 的分离的人类单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述效应子部分是毒素或可检测标记物。
29.一种支架蛋白，其包含权利要求23-25任一项的抗原结合片段。
30.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1-25任一项的抗体或抗原结合片段。
31.权利要求30的分离的核酸分子，其可操作地连接到启动子。
32.—种表达载体,其包含权利要求30或权利要求31的分离的核酸分子。
33.一种分离的宿主细胞，其被权利要求33-35任一项的核酸分子或载体转化。
34.一种组合物，其包含: (a)权利要求1-28任一项的抗体或抗原结合片段，权利要求29的支架蛋白，权利要求30或31的核酸分子，权利要求32的表达载体，或其两种或更多种的组合；以及 (b)药学可接受的载体。
35.一种在对象中检测人免疫缺陷病毒(HIV)-1感染的方法，所述方法包括: 将来自于所述对象的生物样品与权利要求1-28任一项的分离的人类单克隆抗体或抗原结合片段或权利要求29的支架蛋白在足以形成免疫复合物的条件下相接触；以及 检测来自于所述对象的样品上所述免疫复合物的存在，其中来自于所述对象的样品上所述免疫复合物的存在指示所述对象具有HIV-1感染。
36.权利要求35的方法，其中所述分离的人类单克隆抗体被直接标记。
37.权利要求35的方法，其中所述接触是体内的。
38.权利要求35的方法，其中所述接触是体外的。
39.权利要求35-38任一项的方法，其还包括: 将所述样品与特异性结合所述分离的人类单克隆抗体或抗原结合片段的第二抗体相接触；以及 检测所述第二抗体与所述样品的结合； 其中与所述第二抗 体与对照样品的结合相比所述第二抗体与所述样品的结合的增加，检测到所述对象存在HIV-1感染。
40.一种用于在对象中预防或治疗人免疫缺陷病毒(HIV)-1感染的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的权利要求34的组合物，由此预防或治疗HIV-1感染。
41.权利要求40的方法，其中所述方法是用于治疗HIV-1感染的方法，并且其中所述对象患有获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。
42.权利要求40或权利要求41的方法，其还包括向所述对象施用其他抗病毒剂。
43.权利要求42的方法，其中所述其他抗病毒剂包含核苷类似物反转录酶抑制剂、核苷酸反转录酶抑制剂、非核苷反转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、进入或融合抑制剂、成熟抑制剂或广谱抑制剂或其组合。
44.权利要求40-43任一项的方法，其还包括向所述对象施用一种或多种其他抗体或编码这样的抗体的核酸，其中所述其他抗体特异性结合gpl20和/或gp41。
45.权利要求40-44任一项的方法，其还包括向所述对象施用有效量的IL-15。
46.权利要求40-44任一项的方法，其还包括测量所述对象中的HIV-1病毒滴度。
47.一种用于测试潜在的免疫原的方法，所述方法包括将所述潜在的免疫原与权利要求1-28任一项的抗体或其抗体结合片段或权利要求29的支架蛋白相接触；以及检测所述抗体、抗原结合片段或支架蛋白与所述免疫原的结合，由此确定所述免疫原可用于产生针对人免疫缺陷病毒的免疫应答。
48.一种试剂盒，其包含: (a)权利要求1-28任一项的抗体或抗原结合片段，权利要求29的支架蛋白，权利要求30或31的核酸分子，权利要求32的表达载体，权利要求34的组合物，其两种或更多种的组合；以及 (b)使用所述试剂盒的说明书。
49.权利要求1-38任一项的分离的单克隆抗体或抗原结合片段、权利要求29的支架蛋白、权利要求30或31的核酸分子、权利要求32的表达载体、权利要求34的组合物或其两种或更多种的组合用于在对象中抑制或预防I型人免疫缺陷病毒感染的用途。
【文档编号】C12N15/13GK104080805SQ201280065580
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2012年11月7日 优先权日:2011年11月7日
【发明者】马克·康纳斯, 黄竞荷, 利奥·B·劳布, 邝达平, 嘉里·纳贝尔, 约翰·R·玛斯考拉, 张宝山, 里贝卡·S·里迪塞尔, 伊万琳·格奥尔基耶夫, 杨永平, 朱江, 吉拉德·欧费克 申请人:美国政府健康及人类服务部