用于预防和治疗呼吸道合胞病毒感染的联合抗原和dna疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明提供了使用包含RSV抗原和编码所述RSV抗原的DNA的组合来治疗和预防呼吸道合胞病毒(RSV)感染的症状。
【专利说明】用于预防和治疗呼吸道合胞病毒感染的联合抗原和DNA疫 苗
[0001] 序列表
[0002] 本申请包括以ASCII格式提交的并据此整体以引用方式并入的序列表。2012年8 月2日创建的ASCII拷贝的名称为"030276-9016_SequenceListing_ST25.txt"，其大小为 116, 697个字节。
【技术领域】
[0003] 本发明涉及使用包含RSV抗原肽和编码所述RSV抗原肽的DNA的组合来治疗和预 防呼吸道合胞病毒（RSV)感染。
[0004] 发明背景
[0005] 人RSV属于副黏液病毒科的肺病毒属，是儿童和老年人中下呼吸道感染的主要原 因，但在年龄小于三岁的婴幼儿中最常见。在如今的美国，保守的估计表明老年人中每年有 大约330万呼吸道疾病病例。与甲型流感病毒疾病相似，RSV在每年冬天流行，在整个一生 中反复再次感染RSV非常常见。虽然开发抗RSV的疫苗是一项最优先考虑的工作，但是由于 相关的疫苗诱发疾病（VID)尚无安全有效的抗RSV疫苗可用。VID在受试者中因来自RSV 抗原的增强的炎性CD4+T细胞反应而由强烈的病原性炎症反应导致。
[0006] 更安全有效的RSV疫苗应当无害并诱导针对病毒的正确的免疫反应。然而，第一 种候选疫苗即在20世纪60年代开发的福尔马林灭活RSV(FI-RSV)疫苗在后续自然暴露于 病毒后诱发严重的疾病，而不是用作抗感染的疫苗。其导致80%接种疫苗后的婴幼儿入院 和两例死亡。得自这些儿童的外周血淋巴细胞表明与原初或RSV感染对照相比的T淋巴细 胞高反应性。
[0007] 在用FI-RSV免疫然后用活RSV攻毒的动物模型中揭露了类似的VID发病。小鼠 中增强的VID组织病理学变化可通过RSV攻毒前⑶4+T细胞或IL-4的去除而消除，从而进 一步表明FI-RSV诱导的病理学变化在该动物模型中为T细胞介导的。
[0008]RSV的F和G蛋白用作重要的中和性和主要的保护性抗原，但是也会导致VID。具 体地讲，据发现，用呼吸道合胞病毒（RSV)G糖蛋白（G)免疫的小鼠在RSV攻毒后表现出VID 并发生了非典型肺嗜酸性粒细胞增多。CD4+T细胞的去除导致疾病的严重性较轻，从而表明 G抗原内的序列可能包含过度刺激T细胞反应的表位。
[0009]虽然在RSV攻毒时会发生VID的情况下需要RSV疫苗，但是尚未得到可避免进一 步导致肺病理学变化的过激反应（诸如VID)的RSV疫苗。理想的抗RSV感染的疫苗应当满 足两个要求：1)诱导RSV特异性中和抗体；以及2)不刺激会导致VID的过度T细胞反应。 已经测试了许多方法，诸如使用DNA疫苗、腺病毒载体、Thl型佐剂和经口递送，但是迄今为 止无一取得成功。因此，本领域需要开发将诱导抗RSV感染的中和抗体但抑制炎性CD4+T细 胞的疫苗。
[0010] 发明概述
[0011] 本发明涉及抗呼吸道合胞病毒（RSV)感染的疫苗，该疫苗包含RSV抗原肽和编码 该RSV抗原肽的核酸，其中该疫苗刺激iTreg细胞（CD4+、CD25'F〇XP3+、IL-10+)。该疫苗的RSV抗原肽可以为F糖蛋白、G糖蛋白、SEQIDNO:4(优化的氨基酸RSVG氨基酸序列）、 SEQIDNO:25(优化的氨基酸RSVF氨基酸序列）及其功能片段。该疫苗可以具有选自 5 : 1和1 : 5以及I: 1和2 : 1的核酸和抗原肽质量比。本发明的疫苗可以是核酸。 核酸可以是RNA、DNA或cDNA。该核酸编码选自以下的RSV抗原肽：F糖蛋白、G糖蛋白、SEQ IDNO:4 (优化的氨基酸RSVG氨基酸序列）、SEQIDNO:25 (优化的氨基酸RSVF氨基酸 序列）及其功能片段。DNA可存在于环形质粒的线性表达盒中。质粒可选自pVAX、pcDNA3. 0 和proVAX。质粒还可以包含选自以下的启动子：CMV、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、 金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳氏肉瘤病毒启动子和多角体启动子。
[0012] 本发明还涉及包括疫苗施用装置和如上所述的疫苗的疫苗接种试剂盒。试剂盒的 疫苗施用装置可以为疫苗枪、针或电穿孔装置。试剂盒可以包括微创电穿孔装置。
[0013] 本发明还涉及用于预防或治疗受试者中的呼吸道合胞病毒感染的方法，该方法包 括向有需要的受试者施用如上所述的疫苗。该方法还保护受试者免于发生呼吸道合胞病毒 攻毒后的气道高反应性（AHR)。
[0014] 本发明还涉及诱导抗呼吸道合胞病毒感染的中和抗体并抑制炎性T细胞的方法， 该方法包括向有需要的受试者施用所述疫苗，其中诱导iTreg细胞而抑制自身反应性CD4+ 和CD8+T细胞。疫苗可通过电穿孔而施用，例如使用微创电穿孔装置，其中电穿孔路径选自 皮内和肌内。
[0015] 本发明还涉及治疗或预防进行呼吸道合胞病毒（RSV)免疫的受试者中的疫苗诱 发疾病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用如上所述的疫苗，其中受试者在遭遇自 然RSV感染前已接受了福尔马林灭活RSV(FI-RSV)或RSV抗原的免疫。疫苗可通过电穿孔 而施用，例如使用微创电穿孔装置，其中电穿孔路径可以为皮内和肌内。
[0016] 附图简述
[0017] 图1显示了NIH/3T3细胞中的质粒pr〇VAX/G的真核表达。在用pr〇VAX/G转然后 48h从NIH/3T3细胞提取了总RNA。用于RT-PCR的模板如下：泳道1，得自具有RT的转染 NIH/3T3细胞的cDNA;泳道2,proVAX载体对照转染细胞；泳道3,作为阴性对照的得自非转 染NIH/3T3细胞的RNA。
[0018] 图2A-2B显示了在大肠杆菌（E.coli)BL21(DE3)中重组蛋白表达的SDS-PAGE 的考马斯蓝染色。图2A-2B显示了 ：泳道M，蛋白分子标记；泳道1，未诱导的大肠杆 菌BL21(DE3);泳道2,由IPTG以0. 5mM诱导的大肠杆菌BL21(DE3);泳道3,未诱导的 BL21(DE3)pET28a(+);泳道 4,由IPTG以 0· 5mM诱导的大肠杆菌BL21(DE3)pET28a;泳道 5， 未诱导的大肠杆菌BL21(DE3)pET28a(+)/G;泳道6和10，由IPTG以0.5mM诱导的大肠杆 菌BL21(DE3)pET28a(+)/G;泳道7，纯化的多聚组氨酸标签重组蛋白；泳道8，在0.5mMIPTG 诱导下由pET28a(+)/G转化的大肠杆菌BL21 (DE3)裂解物的上清液；以及泳道9,在0. 5mM IPTG诱导下由pET28a(+) /G转化的大肠杆菌BL21 (DE3)裂解物的沉淀物。
[0019] 图3显示了多聚组氨酸标签重组G蛋白的Western印迹分析。大肠杆菌BL21 (DE3) 裂解物得自在LB肉汤中生长并用0. 5mM IPTG诱导的细胞。将蛋白样品在12% SDS-PAGE 上分离，然后转移到硝酸纤维素膜。使膜与山羊抗RSV抗体反应，并通过与偶联的抗山羊二 抗反应而可视化。泳道1，在0. 5mM IPTG诱导下由pET28a(+)/G转化的大肠杆菌BL21(DE3) 裂解物的上清液；泳道2,由pET28a(+)/G转染的大肠杆菌BL21 (DE3)裂解物的不溶性部 分；泳道3,镍柱纯化的重组RSVG蛋白。
[0020] 图4A-4B显示了体液反应的分析。在最后一次免疫后第7天从Balb/c小鼠采集 血清样品。使用紫外线灭活的RSV通过ELISA确定RSVG特异性抗体（图4A)和RSVF特 异性抗体（图4B)。结果以一式三份的三个组的数据平均值表示，误差条表示标准偏差。所 示的数据总结了三个实验之一，它们都展示出相似的结构。单星号表示P< 〇. 05,双星号表 示p< 0· 01。
[0021] 图5显示了通过DNA和蛋白疫苗联合免疫诱导了T细胞反应的损害。从已用PSB 或proVAX/G或His-G免疫或用proVAX+His-G(抗原错配的）或proVAX/G+OVA(抗原错配 的）联合免疫或用proVAX/G+His-G(抗原匹配的）联合免疫的小鼠中分离了T细胞。将T 细胞用作为特异性抗原的紫外线照射RSV抗原（从左边起的第三个数据列）、作为非特异性 抗原的BSA(从左边起的第二个数据列）或作为阳性对照刺激剂的PMA+Ion(从左边起的第 一个数据列）在体外进行再刺激。如实施例1中所述测定T细胞增殖。所示的数据是得自 三个独立实验的代表性数据。单星号表示P< 〇. 05,双星号表示p< 0. 001。
[0022] 图6A-6B显示了免疫小鼠的肺RSV滴度。
[0023] 图7A-7D显示了在RSV攻毒后与总细胞相比的所存在的嗜酸性粒细胞、淋巴细胞 和单核细胞的量。在最后一次免疫后第14天,将小鼠经鼻内用IO6TCID5tl活RSV进行攻毒。 在RSV攻毒后5天将小鼠处死，并分析BAL。显示了总嗜酸性粒细胞（图7A)、单核细胞（图 7B)、淋巴细胞（图7C)和总细胞（图7D)的平均值土SEM(η= 6/组）。单星号表示与PBS 组相比P< 0.05。
[0024] 图8A-8D显示了在RSV攻毒后与总细胞相比的所存在的嗜酸性粒细胞、淋巴细胞 和单核细胞的量。在最后一次免疫后第14天,将小鼠经鼻内用IO6TCID5tl活RSV进行攻毒。 在RSV攻毒后5天将小鼠处死，并分析BAL。显示了总嗜酸性粒细胞（图8Α)、单核细胞（图 8Β)、淋巴细胞（图8C)和总细胞（图8D)的平均值土SEM(η= 6/组）。单星号表示与PBS 组相比P< 0.05。
[0025] 图9A-9D显示了响应于乙酰氯化胆碱的颈静脉内施用的全身体积描记。RSV在攻 毒后5天，通过响应于各种剂量（X轴）下乙酰氯化胆碱的颈静脉内施用的全身体积描记测 量了气道阻塞，并在y轴上表示为动态阻力（Rrs)(图9Α和9C)和动态顺应性（Cldyn)(图 9B和9D)。原初小鼠未进行预处理和攻毒。单星号表示与其它组相比p< 0. 05。
[0026] 图10A-10H显示了苏木精和伊红染色后肺组织的组织学检查。RSV攻毒后5天， 对小鼠实施安乐死，摘除肺组织并在福尔马林中固定。切取石蜡包埋组织的萍切片，用苏 木精和伊红染色。对于得自原初/未攻毒的小鼠（图10A)、PBS小鼠（图10B)、FI-RSV小 鼠（图 10C)、proVAX/G小鼠（图 10D)、His-G小鼠（图 10E)、proVA+His-G小鼠（图 10F)、 proVAX/G+0VA小鼠（图10G)和proVAX/G+His-G小鼠（图10H)的组织，显示了各放大倍数 下（放大倍数100倍或400倍）的（每组6只的）代表性切片。
[0027] 图11A-11H显示了苏木精和伊红染色后肺组织的组织学检查。RSV攻毒后5天， 对小鼠实施安乐死，摘除肺组织并在福尔马林中固定。切取石蜡包埋组织的薄切片，用苏 木精和伊红染色。对于得自原初/未攻毒的小鼠（图11A)、PBS小鼠（图11B)、FI-RSV小 鼠（图 11C)、proVAX/G小鼠（图 11D)、His-G小鼠（图 11E)、proVA+His-G小鼠（图 11F)、 proVAX/G+OVA小鼠（图11G)和proVAX/G+His-G小鼠（图11H)的组织，显示了各放大倍数 下（放大倍数100倍或400倍）的（每组6只的）代表性切片。
[0028] 图12A-12E显示了苏木精和伊红染色后肺组织的组织学检查。RSV攻毒后5天，对 小鼠实施安乐死，摘除肺组织并在福尔马林中固定。切取石蜡包埋组织的薄切片，用苏木精 和伊红染色。对于得自proVAX/F小鼠（图12A)、His-F小鼠（图12B)、proVA+His-F小鼠 (图 12C)、proVAX/F+0VA小鼠（图 12D)和proVAX/F+His-F小鼠（图 12E)的组织，显示了 各放大倍数下（放大倍数100倍或400倍）的（每组6只的）代表性切片。
[0029] 图13显示了图10中所述的肺组织的组织病理学评分。如实施例1中所述，由病 理学家以设盲方式在苏木精和伊红染色组织中评估织病理学评分（HPS)。单星号表示与其 它组相比P< 0.05。
[0030] 图14A-14B显示了在用活RSV攻毒后免疫小鼠的体重损失。在RSV攻毒后，每天 对小鼠称重，并将体重归一化到第0天的基础体重。单星号表示与其它组相比P< 0. 05。
[0031] 图15A-1?显示了在RSV攻毒后第5天通过qPCR检查的小鼠肺组织中的细胞因 子产生情况。测量了IL_4(图15A)、IL-5(图15B)、IL-13(图15C)和IFN-T(图15D)。单 星号表示P<0.05,双星号表示p<0.01，而三星号表示p<0.001。
[0032] 图16A-16N显示了T细胞表型的荧光活化细胞分选（FACS)分析。联合免疫诱导的 iTreg细胞可在体内介导抗原特异性T细胞抑制并在体外抑制同种混合淋巴细胞反应。淋 巴细胞得自最后一次免疫后7天的小鼠，并用抗⑶4-FITC和抗⑶25TECy5mAb染色，然后 用抗IL-10-PE和抗Foxp3-APCmAb进行细胞内染色。图16A显示了SSC-H与FSC-H的关系 图。图16B显示了CD4与CD25的关系图。图16C-16N显示了IL-10(x轴）和Foxp3(y轴） 共表达。将CD4+CD251R1)(图 16I-16N)和CD4+CD25+(图 16C-16H) (R2)T细胞针对IL-10 和Foxp3的共表达进行分类。所示的结果是三个实验的代表性结果。百分率表示双阳性细 胞的百分比。
[0033]图17A-17B显示 了总脾细胞中CD4+CD25Toxp3+IL-10+(图17B)或 ⑶4+CD25+Foxp3+IL-10+(图17A) T细胞的百分率汇总。三星号表示与其它组相比时p < 0·001。
[0034] 图18显示了通过过继转移的⑶细胞介导的抑制。通过已用proVAX/ G+His-G联合免疫的Balb/c小鼠或通过原初小鼠制备了细胞的⑶4+⑶25-或⑶4++⑶25+亚 组，并过继转移到原初Balb/c小鼠中。然后在转移后24小时将受体小鼠用His-G免疫,并 用于在免疫后7天进行脾细胞分离。将受体的脾细胞用作为特异性抗原的紫外线照射RSV 抗原在体外进行再刺激，并通过MTT法测量了增殖反应。
[0035] 图19显示了通过过继转移的⑶4+0025_供体1'细胞介导的抑制。通过已用proVAX/ G+His-G联合免疫的Balb/c小鼠或通过原初小鼠制备了细胞的⑶4+⑶25-或⑶4++⑶25+亚 组，并过继转移到原初Balb/c小鼠中。然后在转移后24小时将受体小鼠用His-G免疫， 并用于在免疫后7天进行脾细胞分离。将受体动物的脾细胞（作为应答细胞）与得自原 初C57BL/6小鼠的用丝裂霉素C处理过的脾细胞（作为同种异体的刺激细胞）混合以进行 MLR。单星号表示p< 0. 05,双星号表示p< 0. 01。
[0036] 图20A-20F显示了通过从联合免疫小鼠过继转移CD4+CD25_iTreg细胞而改善肺 炎性反应。在最后一次免疫后第7天从通过proVAX/G+His-G(抗原错配的）或proVAX/ G+OVA(抗原错配的）联合免疫的小鼠纯化了⑶4+CD25+和⑶4+⑶25_T细胞，将它们经静脉内 过继转移到之前用His-G免疫的小鼠中,然后进行RSV攻毒。RSV攻毒后5天,对小鼠实施 安乐死，摘除肺组织并在福尔马林中固定。切取石蜡包埋组织的薄切片，用苏木精和伊红染 色。对于得自原初小鼠（图20Α)、His-G小鼠（图20Β)、"得自proVAX/G+His-G的CD4+CD25+" 小鼠（图 20C)、"得自proVAX/G+His-G的CD4+CD25"' 小鼠（图 20D)、"得自proVAX/G+OVA 的CD4+CD25+" 小鼠（图 20E)和"得自proVAX/G+OVA的CD4+CD251'小鼠（图 20F)的组织， 显示了各放大倍数下（放大倍数100倍或400倍）的（每组6只的）代表性切片。
[0037] 图21显示了图20中所述的肺组织的组织病理学评分。如实施例1中所述，由病 理学家以设盲方式在苏木精和伊红染色组织中评估织病理学评分（HPS)。单个星号表示p < 0· 05。
[0038] 详细描述
[0039] 本发明涉及用于治疗和保护受试者免受RSV感染同时抑制因之前的RSV抗原免疫 而导致的疫苗诱发疾病的方法。
[0040] 疫苗诱发疾病（VID)的原因是原初（naive)个体在遭遇自然RSV感染前用RSV抗 原（诸如F/G蛋白）免疫时使炎性反应加重的倾向，这些炎性反应包括大量淋巴细胞浸润、 肺嗜酸性粒细胞增多和2型细胞因子产生。然而，抗体在保护中具有重要作用。中和抗体 的被动转移可保护免疫缺陷个体或儿童免受RSV感染，并且小鼠模型已表明用抗RSV中和 单克隆抗体进行治疗明显减少了RSV复制并与疾病严重性的炎性和临床标志的显著降低 相关。由于被动免疫疗法在儿童中的高成本，致力于诱导高水平的抗RSV中和抗体的疫苗 引起了人们的巨大兴趣。
[0041] 本发明的疫苗包含编码RSV蛋白的核酸及其同源重组RSV蛋白以避免RSV感染并 且还改善RSV诱导的肺部炎性疾病。该疫苗通过与福尔马林灭活RSV(FI-RSV)感染一样 高地诱导抗RSV感染中和抗体而提供肺中病毒复制的明显降低，但通过诱导iTreg(⑶4+、 ⑶25-、F〇XP3+、IL10+)细胞而抑制炎性T细胞。通过用DNA和蛋白一起进行联合免疫诱导了 抗原特异性iTreg细胞。iTreg刺激细胞生成高水平的IL-10,其表明刺激B细胞产生中和 抗体。该策略诱导高水平的中和抗体以及抗原特异性iTreg细胞，这些细胞抑制炎性T细 胞并减轻病变。因此，该策略可有效地避免RSV感染，VID即使有也甚微。
[0042] 使用蛋白和编码同源抗原的核酸进行联合免疫而在体内诱导iTreg具有若干优 点：1)其相对简单，因为只需要施用限定的蛋白抗原及其表达质粒；2)其诱导强效的iTreg 而以抗原特异性方式抑制T细胞；3)其还诱导高水平的抗体。该方法可扫除RSV疫苗开发 的主要障碍，因为具有双重功能（如本文所公开，诱导中和抗体和iTreg细胞）的疫苗可能 是有效的，而无VID副作用。
[0043] 1.定义
[0044] 本文所用的术语只是为了描述特定的实施方案，并非旨在进行限制。如在说明书 和所附权利要求书中所用，单数形式"一"、"一个/种"和"该/所述"包括多个指代物，除 非上下文另有明确指出。
[0045] 关于本文中数字范围的引述，明确地包括相同精度的介于其间的每个居间数字。 例如，对于6-9的范围，除了 6和9以外还包括数字7和8,而对于范围6. 0-7. 0,明确地包 括数字 6· 0、6· 1、6· 2、6· 3、6· 4、6· 5、6· 6、6· 7、6· 8、6· 9 和 7. 0。
[0046] 如本文所用的"气道高反应性"（AHR)是指气道异常使得它们太易狭窄和/或对 能够引起气道受限的刺激反应性太高。AHR可以是因气道炎症或气道重塑（诸如，通过胶 原沉积）引起的呼吸系统的功能改变。气流受限是指气道变窄，这可能是不可逆的或可逆 的。胶原沉积、支气管痉挛、气道平滑肌肥大、气道平滑肌收缩、粘液分泌、细胞沉积、上皮破 坏、上皮渗透性的改变、平滑肌功能或敏感性的改变、肺实质异常以及气道内和周围的浸润 疾病可引起气流受限或气道高反应性。许多这些致病因素可与炎症相关。
[0047] 如本文所用的"共有"、"共有序列"或"优化序列"可意指基于特定抗原多种亚型 的比对分析而构建的合成核酸序列或相应的多肽序列。该序列可用于诱导针对特定抗原多 种亚型或血清型的广泛免疫。可将合成抗原（诸如融合蛋白）操纵成共有序列（或共有抗 原）。
[0048] 如本文关于核酸序列所用的"片段"或"功能片段"意指核酸序列或其部分，所述核 酸序列或其部分编码能够引起哺乳动物免疫反应的多肽，所述免疫反应与全长野生型RSV抗原交叉反应。片段可以是选自编码本文所示的蛋白片段的各种核苷酸序列中的至少一种 的DNA片段。片段可以是编码RSV抗原的一部分的核酸序列，其中所述部分编码可在哺乳 动物中引起免疫反应的表位，所述免疫反应与全长野生型RSV抗原交叉反应。
[0049] 如本文关于多肽序列所用的"片段"或"功能片段"意指能够引起哺乳动物免疫 反应的多肽，所述免疫反应与全长野生型RSV抗原交叉反应。共有蛋白的片段可包含共有 蛋白的至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少 80%、至少90%或至少95%。片段可以是特定RSV蛋白（诸如G糖蛋白或F糖蛋白）的 全长多肽抗原的一部分的肽序列，并编码可在哺乳动物中引起免疫反应的表位，该免疫反 应与全长野生型RSV多肽抗原序列交叉反应。RSV蛋白的片段可包含全长RSV蛋白的至少 10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少 90%或至少95%，并能够产生免疫反应。
[0050] 如本文所用的"nTreg细胞"是T细胞（⑶4+、⑶25+、Foxp3+)，其主要机理是通过抑 制常规CD4和CD8T细胞的增殖反应而实现外周耐受，并可抑制自然免疫和变应性疾病。转 录因子Foxp3是必需的并足以实现nTreg细胞的免疫抑制活性。nTreg细胞在体内响应抗 原攻毒或自我平衡扩增而容易地增殖，并表现出比常规CD4T细胞更高的自我平衡分裂速 率。nTreg细胞具有自身抗原的高亲和力T细胞受体，从而允许这些细胞通过自身抗原而得 到有效活化从而抑制自身反应性T细胞。
[0051] 如本文所用的"肽"或"多肽"可意指连接的氨基酸序列并且可以为天然的、合成 的或天然和合成的修饰或组合。
[0052] 如本文所用的"治疗"可意指通过预防、抑制、压制或完全消除疾病而保护动物免 于疾病。预防疾病涉及在疾病发作之前向动物施用本发明的组合物。抑制疾病涉及在引起 疾病后，但是在其临床表现之前向动物施用本发明的组合物。压制疾病涉及在疾病的临床 表现之后向动物施用本发明的组合物。
[0053] 如本文所用的"受试者"可意指想要或需要进行RSV疫苗免疫的哺乳动物。它们 可以为人、黑猩猩、狗、猫、马、牛、小鼠或大鼠。
[0054] 如本文所用的"超抗原"可意指一类抗原，它们导致T细胞的非特异性活化，从而 使得多克隆T细胞活化和大规模细胞因子释放。与普通抗原诱导的T细胞反应相比（其中 机体T细胞中0. 001-0.OOOl%被活化），超抗原能够活化高达20%的机体T细胞。大量的活 化T细胞产生大规模的免疫反应，其不是超抗原上任何特定表位特异性的，因此逐渐损害 适应性免疫系统的基本强度之一，即，其以高亲和力靶向抗原的能力。更重要的是，大量活 化的T细胞分泌大量的细胞因子，其中最重要的干扰素γ(IFN-Y)。该过量的IFN-Y继而 活化巨噬细胞。活化的巨噬细胞继而过量产生促炎性细胞因子，诸如IL-UIL-6和TNF-α。 TNF-a作为机体炎性反应的一部分是尤其重要的。在正常情况下，其以低水平局部释放并 有助于免疫系统打败病原体。然而，当其在血液中并以高水平全身性释放时（由于超抗原 结合所导致的大量T细胞活化），其可导致严重且致命的症状，包括休克和多器官衰竭。
[0055] 如本文所用的"基本上相同的"可意指第一氨基酸序列与第二氨基酸序列在1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、 55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100 个氛 基酸的区域上至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99% 相同。
[0056] 如这里所用的"变体"可意指因氨基酸的插入、缺失或保守取代而使氨基酸序列不 同，但是保持至少一种生物活性的肽或多肽。"生物活性"的代表性实例包括被特异性抗体 结合或促进免疫反应的能力。变体还可以意指其氨基酸序列与参考蛋白的氨基酸序列基本 上相同的蛋白，其保持至少一种生物活性。氨基酸的保守取代，即用具有相似性质（例如， 亲水性、带电荷区域的程度和分布）的不同氨基酸替代氨基酸，在本领域被认为通常涉及 微小的变化。这些微小的变化可部分地通过考虑氨基酸的亲疏水性指数来鉴定，如本领域 中所理解的。Kyte等人，J.Mol.Biol. 157 :105-132 (1982)。氨基酸的亲疏水性指数基于其 疏水性和电荷的考虑。在本领域中已知的是，具有相似亲疏水性指数的氨基酸可被取代并 且仍然保留蛋白功能。在一个方面，具有±2的亲疏水性指数的氨基酸被取代。氨基酸的 亲水性还可用于揭示将产生保留生物功能的蛋白的取代。在肽的背景下对氨基酸的亲水性 的考虑允许计算该肽的最大局部平均亲水性，这一有用的指标已报道与抗原性和免疫原性 相关。具有相似亲水性值的氨基酸的取代可产生保留生物活性例如免疫原性的肽，如本领 域中所理解。可利用亲水性值在彼此±2内的氨基酸进行取代。氨基酸的疏水性指数和亲 水性值受该氨基酸的特定侧链影响。与该观察一致，应理解与生物功能相容的氨基酸取代 依赖于氨基酸的相似性，尤其是那些氨基酸的侧链的相似性，如通过疏水性、亲水性、电荷、 大小和其它性质所揭示。
[0057] 2.疫苗
[0058] 本发明涉及包含呼吸道合胞病毒（RSV)抗原和编码所述RSV抗原的核酸的疫苗。 该疫苗通过如本文所述的病毒RSV抗原和编码所述RSV抗原的核酸使有需要的受试者联合 免疫。该疫苗向有需要的受试者提供在后续RSV攻毒后的抗原特异性免疫反应。抗原特异 性免疫反应生成与通过福尔马林灭活RSV(FI-RSV)疫苗所生成的水平相当的高水平的中 和抗体。然而，该疫苗与基于FI-RSV的疫苗的不同之处在于：对iTreg细胞（⑶4+、⑶25_、 FoxP3+、IL10+)进行诱导，这导致与通过FI-RSV疫苗免疫的受试者相比肺异常的明显减轻。 iTreg刺激的细胞生成高水平的IL-10,其表明刺激B细胞产生中和抗体。iTreg刺激还导 致更少的在使受试者再次暴露于RSV感染时疫苗诱发疾病所特有的总体炎症和T细胞向肺 中的浸润。该疫苗还可以通过保护受试者在RSV攻毒后免于发生气道高反应性（AHR)或气 道阻塞而预防和治疗受试者的呼吸道合胞病毒感染。该疫苗还可以改善RSV感染的肺组织 病理。该疫苗还可以减轻活RSV攻毒后疾病的严重性，包括对抗体重减轻。
[0059]FI-RSV因Th2 (⑶4+)型反应的活化而诱发VID，这导致B细胞活化因子和其它相 关的细胞因子诸如IL-3、IL-4、IL-5、CD40配体、IL-10、IL-13、粒细胞-巨噬细胞集落刺激 因子（GM-CSF)和嗜酸粒细胞趋化因子的释放。RSVG糖蛋白（G)疫苗在RSV攻毒后诱发 VID，因为同时诱导了Thl和Th2型反应。Thl释放巨噬细胞活化效应子和其它相关细胞因 子，诸如干扰素-￥(正^￥)、61?^、肿瘤坏死因子〇〇'呖-〇)、11^-3、了呖-0和11^-2。所 述疫苗以抗原依赖性方式同时抑制Thl和Th2反应，而生成与Th2辅助细胞所生成的相似 的中和抗体滴度，从而诱导中和并降低RSV感染水平。
[0060] 该疫苗通过疫苗接种而消除T细胞（Thl、Th2、Thl7)反应。疫苗联合免疫活性诱 导iTreg(CD4+、CD25_、Foxp3+)细胞。iTreg细胞在调节对急性感染的适应性和固有性免疫 反应中以及在消除病毒清除后的炎症中均发挥着作用。iTreg刺激的细胞可生成高水平的 IL-10,其刺激B细胞生成中和抗体。该疫苗不诱导nTreg细胞。RSV感染实际上可引起受 RSV感染的受试者中⑶4+⑶25+nTreg的去除，从而导致疾病严重性增加，包括体重损失加 重、固有细胞募集到支气管肺泡灌洗（BAL)液和肺以及产IFN-Y的⑶4+和⑶8+T细胞的 水平增加。
[0061] 用所述疫苗进行联合免疫不仅保护了受试者免受RSV攻毒的影响，还抑制了会导 致VID的加重的肺部炎症。对RSV感染的预防和VID的减少的原因可能是诱导了高水平的 抗原特异性中和抗体和iTreg细胞，而iTreg细胞可以抗原特异性方式抑制T细胞记忆增 殖。这种联合免疫上调抗炎细胞因子IL-10的水平，而下调RSV诱导的炎性细胞因子，诸如 IL-4、IL-5、IL-13 和IFN-γ。
[0062] 该疫苗可具有质量比为 10 : 1、9 : 1、8 : 1、7 : 1、6 : 1、5 : 1、4 : 1、3 : 1、 2 : 1、1 : 1、1 : 2、1 : 3、1 : 4、1 : 5、1 : 6、1 : 7、1 : 8、1 : 9 或I: 10 的 RSV编码 核酸与RSV抗原。该疫苗可具有10 : 1至I : 10、9 : 1至I: 9、8 : 1至8 : 1、7 : 1 至I: 7、6 ： 1至I: 6、5 ： 1至I : 5、4 : 1至 I : 4、3 ： 1至 1 : 3 或 2 ： 1至 1 : 2 的RSV编码核酸与RSV抗原质量比范围。
[0063]a.抗原
[0064] 该疫苗可包含RSV抗原。RSV抗原可由核酸编码。核酸可以为编码RSV抗原或其 片段的DNA、RNA或cDNA。RSV抗原可以为导致免疫反应的肽或蛋白。抗原可触发免疫系统 产生抗体。核酸可编码为全长RSV抗原的片段的RSV抗原，并具有存在于RSV抗原上能够 触发免疫应发的表位。RSV抗原可以为全长RSV抗原的片段，并具有存在于RSV抗原上能够 触发免疫应发的表位。通过免疫反应所生成的抗体然后可杀灭或中和被视为外来物和可能 有害的侵入者的抗原。RSV抗原可以是被主要组织相容性复合体（MHC)结合并呈递到T细 胞受体的任何分子或分子片段。RSV抗原可以是免疫原，其为能够促使适应性免疫反应的分 子。
[0065] 根据本发明，RSV抗原可衍生自任何类型，诸如亚型A或亚型B，或天然存在的或 重组的RSV的任何菌株，优选地衍生自人类RSV菌株。RSV菌株的实例包括但不限于亚型A 菌株，诸如Long(ATCC?VR-26)、A2(ATCC?VR-1540)、RSB1734、RSB5857、RSB6190、 RSB6256、RSB642 和RSB6614;亚型B菌株，诸如Bl、18537、8/60 和 9320、S2、RSS-2、RSP112/ Sweden/02-03、RSP120/Sweden/02-03、RSP121/Sweden/02-03、RSP122/Sweden/02-03、RSP13/Sweden/02-03)、RSP140/Sweden/02-03、RSP16/Sweden/02-03、RSP171/ Sweden/02-03、RSP 183/Sweden/02-03、RSP191/Sweden/02-03、RSP199/Sweden/02-03、 RSP212/Sweden/02-03、RSP41/Sweden/02-03、RSP45/Sweden/02-03、RSP56/Sweden/02-03、 RSP58/Sweden/02-03、RSP67/Sweden/02-03和RSP94/Sweden/02-03。
[0066] 本公开证实了通过用编码RSVF抗原的DNA疫苗及其F蛋白进行联合免疫或通过 用编码RSVG抗原的DNA疫苗及其G蛋白进行联合免疫得到的保护效力，其得到的对RSV 攻毒的保护与通过FI-RSV得到的相当。其它RSV抗原可具有相似的效力。该保护可归因 于与FI-RSV类似的对高水平中和抗体的诱导，然而，联合免疫保护与iTreg的诱导相关并 导致更少的炎症和T细胞向肺的浸润，S卩，明显减少肺异常。
[0067] 该疫苗包含RSV抗原肽和编码所述RSV抗原肽的DNA。在一些实施方案中，RSV抗 原肽选自人RSVF和G蛋白。
[0068] 本文还提供编码所述抗原的DNA。该DNA可包含编码所述抗原的编码序列。该DNA 还可以包含另外的序列，其编码通过肽键连接到抗原的接头或标签序列。
[0069] (I)RSVF和G抗原
[0070]RSV抗原可以是人RSV融合蛋白（在本文也称为"RSVF"、"RSVF蛋白"和"F蛋 白"）或其片段或变体。人RSV融合蛋白在RSV亚型A与B之间是保守的。RSV抗原可以是 得自RSVLong菌株（GenBankAAX23994.I;SEQIDNO:1)的RSVF蛋白或其片段或变体， 其由SEQIDNO:26的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列对应于GenBankAY911262. 1(SEQ IDNO:6)的第 5660-7384 位。RSV抗原可以是得自RSVA2 菌株（GenBankAAB59858. 1)的 RSVF蛋白或其片段或变体。RSV抗原可以是单体、RSVF蛋白的二聚体或三聚体、或其片 段或变体。RSV抗原可以是优化氨基酸RSVF氨基酸序列或其片段或变体。例如，RSV抗 原可以是RSVF的第412-524位氨基酸或其优化氨基酸序列。RSV抗原可以是RSVF的第 412-524位氨基酸或其优化氨基酸序列的二聚体的融合蛋白，诸如SEQIDNO:25。RSV抗 原可以是由SEQIDNO:23、24或26编码的RSVF蛋白。
[0071]RSVF的融合后形式在免疫动物中引起高滴度的中和抗体并保护动物免受RSV攻 毒的影响。本发明利用受权利要求书保护的疫苗中的这种免疫反应。根据本发明，RSVF蛋 白可以是融合前形式或融合后形式。
[0072]RSV抗原可以是人RSV附着糖蛋白（在本文也称为"RSVG"、"RSVG蛋白"和"G 蛋白"）或其片段或变体。人RSVG蛋白在RSV亚型A与B之间不同。抗原可以是得自RSV Long菌株（GenBankAAX23993;SEQIDN0:2)的RSVG蛋白或其片段或变体，其由SEQID N0:19的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列对应于GenBankAY911262. 1(SEQIDN0:6)的 第4687-5583位。RSV抗原可以是得自以下的RSVG蛋白或其片段或变体：RSV亚型B分 离株H5601(SEQIDNO:46)、RSV亚型B分离株H1068(SEQIDNO:48)、RSV亚型B分离株 H5598(SEQIDN0:50)、RSV亚型B分离株H1123(SEQIDN0:52)。RSV抗原可以是优化氨 基酸RSVG氨基酸序列或其片段或变体。例如，抗原可以是RSVG蛋白的第67-298位氨基 酸或其优化氨基酸序列，诸如SEQIDN0:4。RSV抗原可以是由SEQIDN0:3、5、19、20、21、 22、45、47、49或51编码的RSVG蛋白。
[0073] (2)其它RSV抗原
[0074]RSV抗原可以是人RSV非结构蛋白1( "NS1蛋白"）或其片段或变体。例如，RSV 抗原可以是得自RSVLong菌株（GenBankAAX23987.I;SEQIDNO:28)的RSVNSl蛋白 或其片段或变体，其由SEQIDNO:27的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列对应于GenBank AY911262.I(SEQIDNO:6)的第 99-518 位。
[0075]RSV抗原可以是人RSV非结构蛋白2 ( "NS2蛋白"）或其片段或变体。例如，RSV 抗原可以是得自RSVLong菌株（GenBankAAX23988.1;SEQIDN0:30)的RSVNS2 蛋白 或其片段或变体，其由SEQIDNO:29的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列对应于GenBank AY911262.I(SEQIDNO:6)的第 628-1002 位。
[0076]RSV抗原可以是人RSV核衣壳（"N"）蛋白或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是 得自RSVLong菌株（GenBankAAX23989.I;SEQIDNO:32)的RSVN蛋白或其片段或变体， 其由SEQIDNO:31的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列对应于GenBankAY911262. 1(SEQ IDNO:6)的第 1140-2315 位。
[0077]RSV抗原可以是人RSV磷蛋白（"P"）或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是得 自RSVLong菌株（GenBankAAX23990.I;SEQIDNO:34)的RSVP蛋白或其片段或变体，其 由SEQIDN0:33的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列对应于GenBankAY911262. 1(SEQID NO:6)的第 2346-3071 位。
[0078]RSV抗原可以是人RSV基质蛋白（"M"）或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是 得自RSVLong菌株（GenBankAAX2399LI;SEQIDNO:36)的RSVM蛋白或其片段或变体， 其由SEQIDNO:35的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列对应于GenBankAY911262. 1(SEQ IDNO:6)的第 3261-4031 位。
[0079]RSV抗原可以是人RSV小疏水（"SH"）蛋白或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是 得自RSVLong菌株（GenBankAAX23992.I;SEQIDNO:38)的RSVSH蛋白或其片段或变体， 其由SEQIDNO:37的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列对应于GenBankAY911262. 1(SEQ IDNO:6)的第 43〇2_4496 位。
[0080]RSV抗原可以是人RSV基质蛋白2-1 ( "M2-1"）或其片段或变体。例如，RSV抗 原可以是得自RSVLong菌株（GenBankAAX23995.I;SEQIDNO:40)的RSVM2-1 蛋白或 其片段或变体，其由SEQIDNO:39的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列对应于GenBank AY911262.I(SEQIDNO:6)的第 7605-8189 位。
[0081]RSV抗原可以是人RSV基质蛋白2-2( "M2-2"）或其片段或变体。例如，RSV 抗原可以是得自RSVLong菌株（GenBankAAX23997.1;SEQIDN0:42)的RSVM2-2 蛋 白或其片段或变体，其由SEQIDNO:41的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列对应于 GenBankAY9Il262. 1(SEQIDNO:6)的第 8158_843〇 位。
[0082]RSV抗原可以是人RSV聚合酶L("L"）蛋白或其片段或变体。例如，RSV抗原可以 是得自RSVLong菌株（GenBankAAX23996.I;SEQIDNO:44)的RSVL蛋白或其片段或变 体，其由SEQIDN0:43的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列对应于GenBankAY911262. 1(SEQ IDNO:6)的第 8497-14994 位。
[0083]RSV抗原可以是NSl、NS2、N、P、M、SH、M2-1、M2-2或L蛋白的优化氨基酸序列。
[0084] (3)RSV抗原汇总
[0085]RSV抗原可以是人RSV抗原或重组抗原，诸如由人RSV基因组（SEQIDNO:6)编码 的蛋白的任何一种。抗原可以是SEQIDN0:l、2、4、25、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、 48、50或52的人RSV或其重组蛋白或共有蛋白、其片段或其变体。RSV抗原可以是由SEQ 10勵：3、5、19、20、21、22、23、24、26、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49或51编码的 人RSV或其重组蛋白或共有蛋白、其片段或其变体。
[0086] SEQIDNO: 1和26表示得自RSVLong菌株的RSVF蛋白的氨基酸和核苷酸序列。
[0087] SEQIDNO:2和19表示得自RSVLong菌株的RSVG蛋白的氨基酸和核苷酸序列。
[0088] SEQIDNO:3、5、20、21和22表示编码SEQIDNO:4的优化氨基酸RSVG氨基酸序 列的核苷酸序列。SEQIDNO:20编码SEQIDNO:4的氨基酸序列。SEQIDNO:3和21表 示编码SEQIDNO:4的氨基酸序列的原核（大肠杆菌）密码子优化序列，并且SEQIDNO: 5和22表示编码SEQIDNO:4的氨基酸序列的原核的真核（小鼠）密码子优化序列。
[0089] SEQIDNO:6表示RSVLong菌株的人RSV基因组的核苷酸序列。
[0090] SEQIDNO: 23和24表示编码SEQIDNO: 25的优化氨基酸RSVF氨基酸序列的 核苷酸序列。SEQIDNO:23编码SEQIDNO:25的氨基酸序列。SEQIDNO:24表示编码 SEQIDNO:25的氨基酸序列的原核（大肠杆菌）密码子优化序列。
[0091] SEQIDNO:27和28表示得自RSVLong菌株的RSVNSl蛋白的氨基酸和核苷酸 序列。
[0092] SEQIDNO:29和30表示得自RSVLong菌株的RSVNS2蛋白的氨基酸和核苷酸 序列。
[0093] SEQIDNO:31和32表示得自RSVLong菌株的RSVN蛋白的氨基酸和核苷酸序 列。
[0094] SEQIDNO:33和34表示得自RSVLong菌株的RSVP蛋白的氨基酸和核苷酸序 列。
[0095] SEQIDNO:35和36表示得自RSVLong菌株的RSVM蛋白的氨基酸和核苷酸序 列。
[0096] SEQIDNO:37和38表示得自RSVLong菌株的RSVSH蛋白的氨基酸和核苷酸序 列。
[0097] SEQIDNO:39和40表示得自RSVLong菌株的RSVM2-1蛋白的氨基酸和核苷酸 序列。
[0098] SEQIDNO:41和42表示得自RSVLong菌株的RSVM2-2蛋白的氨基酸和核苷酸 序列。
[0099] SEQIDNO:43和44表示得自RSVLong菌株的RSVL蛋白的氨基酸和核苷酸序 列。
[0100]SEQIDNO:45和46表示得自RSV亚型B分离株H5601的RSVG蛋白的氨基酸和 核苷酸序列。
[0101]SEQIDNO:47和48表示得自RSV亚型B分离株H1068的RSVG蛋白的氨基酸和 核苷酸序列。
[0102] SEQIDNO:49和50表示得自RSV亚型B分离株H5598的RSVG蛋白的氨基酸和 核苷酸序列。
[0103] SEQIDNO:51和52表示得自RSV亚型B分离株H1123的RSVG蛋白的氨基酸和 核苷酸序列。
[0104]b.载体
[0105] 该疫苗可包含编码抗原的RSV核酸，并且该核酸可位于载体中。载体因此可包含 编码上述抗原的核酸。载体能够表达抗原。载体可以为表达构建体，其通常为用于将特定基 因引入靶细胞的质粒。一旦表达载体处于细胞内部，就通过细胞转录和翻译机制核糖体复 合物生成由基因编码的蛋白。常常对质粒进行工程改造以含有用作增强子和启动子区并导 致表达载体上所携带的基因有效转录的调节序列。本发明的载体表达大量的稳定信使RNA， 并因此表达蛋白。
[0106] 包含编码抗原的DNA的特定DNA载体为proVAX/G(SEQIDNO:22)，其对应于RSV G糖蛋白（全长核苷酸序列对应于GenBank:AY911262. 1(RSV基因组；SEQIDNO:6)的第 4687-5583位；全长核苷酸序（SEQIDNO:19))的第67-298位氨基酸的编码区。包含编码 抗原的DNA的另一种特定DNA载体为proVAX/F(SEQIDN0:23)，其对应于RSVF融合蛋白 (全长核苷酸序列对应于GenBank:AY911262.I(SEQIDNO:6)的第5660-7384位；全长F 融合蛋白核苷酸序列（SEQIDNO:26))的第412-524位氨基酸的编码区的二聚体。编码区 可进行密码子优化，即，在一种生物体中相对于另一种生物体、远亲生物体更频繁应用的密 码子，以及添加或修饰Kozak序列和/或内含子的修饰，和/或除去不希望的序列，比如潜 在转录因子结合位点。
[0107] 载体可具有表达信号，诸如强启动子、强终止密码子，启动子与克隆基因之间距离 的调节，以及转录终止序列和PTIS(便携式翻译起始序列）的插入。
[0108] (1)表达载体
[0109] 载体可以为环形质粒或线性核酸。环形质粒和线性核酸能够在适当的受试者细胞 中指导特定核苷酸序列的表达。载体可具有可操作地连接到编码抗原的核苷酸序列的启动 子，所述核苷酸序列可以可操作地连接到终止信号。载体还可以含有核苷酸序列正确翻译 所需的序列。包含所关注的核苷酸序列的载体可以是嵌合的，这意味着其至少一种组分与 其至少一种其它组分异源。核苷酸序列在表达盒中的表达可受组成型启动子或诱导型启动 子的控制，所述启动子仅在宿主细胞暴露于一些特定的外部刺激时才开始转录。
[0110] 就多细胞生物而言，启动子也可对特定的组织或器官或发育阶段有特异性。
[0111] (2)环形或线性载体
[0112] 载体可以为环形质粒，其可通过整合进细胞基因组而转化靶细胞或在染色体外存 在（例如，具有复制起点的自主复制质粒）。
[0113] 载体可以为pVAX、pcDNA3.0或proVAX，或能够表达DNA并且使细胞能够将序列翻 译成由免疫系统识别的抗原的任何其它表达载体。本文还提供了能够经由电穿孔有效递送 至受试者并表达一种或多种所需抗原的线性核酸疫苗或线性表达盒（"LEC"）。LEC可以 为无任何磷酸骨架的任何线性DNA。DNA可编码一种或多种抗原。LEC可含有启动子、内含 子、终止密码子、多腺苷酸化信号。抗原的表达可受启动子控制。LEC可不含任何抗生素抗 性基因和/或磷酸骨架。LEC可不含与所需抗原基因表达无关的其它核酸序列。
[0114]LEC可源自能够被线性化的任何质粒。质粒能够表达抗原。质粒可以为pNP(波多 黎各/34)或pM2 (新喀里多尼亚/99)。质粒可以为pVAX、pcDNA3. 0或proVAX，或能够表达 DNA并且使细胞能够将序列翻译成由免疫系统识别的抗原的任何其它表达载体。
[0115] LEC可以为pcrM2。LEC可以为pcrNP。pcrNP和pcrMR可分别源自pNP(波多黎各 /34)和pM2(新喀里多尼亚/99)。LEC可与抗原以5 : 1与1 : 5之间，或I: 1与2 : 1 之间的质量比结合。
[0116] (3)启动子、内含子、终止密码子和多腺苷酸化信号
[0117] 载体可具有启动子。启动子可以为能够驱动基因表达并调节分离核酸的表达的任 何启动子。这种启动子为经由DNA依赖性RNA聚合酶转录所需的顺式作用序列元件，该聚合 酶转录本文所述的抗原序列。对用于指导异源核酸的表达的启动子的选择取决于特定的应 用。启动子在载体中可定位在与其在自然环境中距转录起始位点的大约相同距离。然而， 可允许该距离的变化，而不丧失启动子功能。
[0118] 启动子可与编码抗原的核酸序列和转录物的有效多腺苷酸化、核糖体结合位点和 翻译终止所需的信号可操作地连接。启动子可以为CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚 期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳氏肉瘤病毒启动子、多角体蛋白 启动子或经证实在真核细胞中表达有效的另一启动子。
[0119] 载体可包括增强子和具有功能剪接供体和受体位点的内含子。载体可含有结构基 因下游的转录终止区以提供有效终止。终止区可从与启动子序列相同的基因获得或可从不 同的基因获得。
[0120]c.疫苗的赋形剂和其它组分
[0121] 疫苗还可以包含其它组分，诸如转染促进剂、药学上可接受的赋形剂、佐剂。药学 上可接受的赋形剂可以是作为媒介物、佐剂、载体或稀释剂的功能分子。药学上可接受的赋 形剂可以是转染促进剂，其可包含表面活性剂例如免疫刺激复合物（ISCOMS)、弗氏不完全 佐剂、LPS类似物（包括单磷酰脂质A)、胞壁酰肽、醌类似物、小囊泡例如角鲨烯和角鲨烯、 透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒或其它已知的 转染促进剂。
[0122] 转染促进剂可以为聚阴离子、聚阳离子，包括多聚L谷氨酸（LGS)或脂质。转染促 进剂可以为多聚L-谷氨酸。多聚L-谷氨酸可以低于6mg/ml的浓度存在于疫苗中。转染 促进剂还可以包括表面活性剂例如免疫刺激复合物（ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似 物（包括单磷酰脂质A)、胞壁酰肽、醌类似物、小囊泡例如角鲨烯和角鲨烯，并且也可将透 明质酸与基因构建体一同施用。在一些实施方案中，DNA质粒疫苗还可以包含转染促进剂 例如脂质、脂质体，包括作为DNA-脂质体混合物的卵磷脂脂质体或其它本领域已知的脂质 体（参见例如W09324640)、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒或其它已知 的转染促进剂。转染促进剂为聚阴离子、聚阳离子，包括多聚L-谷氨酸（LGS)或脂质。疫 苗中转染剂的浓度低于4mg/ml、低于2mg/ml、低于lmg/ml、低于0. 750mg/ml、低于0. 500mg/ ml、低于 0· 250mg/ml、低于 0· 100mg/ml、低于 0· 050mg/ml或低于 0· 010mg/ml。
[0123] 药学上可接受的赋形剂可以为佐剂。佐剂可以是在替代质粒中表达的其它基因， 或作为蛋白与疫苗中的上述质粒一起递送。佐剂可选自：α-干扰素（IFN-a)、i3-干扰素 (IFN-β)、γ-干扰素、血小板衍生生长因子（TOGF)、TNFa、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子 (EGF)、皮肤T细胞吸引趋化因子（CTACK)、上皮胸腺表达趋化因子（TECK)、粘膜相关上皮 趋化因子（MEC)、IL-12、IL-15、MHC、⑶80、⑶86,包括信号序列缺失的并任选包含来自IgE 的信号肽的IL-15。佐剂可以为IL-12、IL-15、IL-28、CTACK，TECK、血小板衍生生长因子 (PDGF)、TNFa、TNFP、GM-CSF、表皮生长因子（EGF)、IL-I、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18或其组合。
[0124] 可以为有用佐剂的其它基因包括编码以下的基因：MCP-l、MIP-la、MIP-lp、IL-8、 RANTES、L-选择素、P-选择素、E-选择素、CD34、GlyCAM-I、MadCAM-I、LFA-I、VLA-I、Mac-1、 ρ150· 95、PECAM、ICAM-I、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18 突变形 式、⑶40、⑶40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长 因子、Fas、TNF受体、Fit、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、 KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-l、Ap-l、Ap-2、p38、p65Rel、 MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、失活NIK、SAPK、SAP-1、JNK、干扰素应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、 TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANKLIGAND、0x40、0x40LIGAND、 NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPI、TAP2 及其功能片段。
[0125] 疫苗还可以包含1994年4月I日提交的美国专利No. 021，579(其以引用方式整 体并入本文）中描述的基因疫苗促进剂。
[0126] 可根据待使用的施用模式来配制疫苗。注射用疫苗药物组合物可以是无菌、无热 原以及无颗粒的。可使用等渗制剂或溶液。等渗添加剂可包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山 梨醇和乳糖。疫苗可包含血管收缩剂。等渗溶液可包括磷酸缓冲盐水。疫苗还可以包含稳 定剂，包括明胶和白蛋白。稳定剂可使制剂在室温或环境温度下稳定更长时间，包括LGS或 聚阳离子或聚阴离子。
[0127] 3.接种疫苗进行治疗或预防的方法
[0128] 本发明还涉及用于预防和治疗患者中的呼吸道合胞病毒（RSV)感染的方法。该方 法包括向有需要的受试者施用如本文所述的抗RSV疫苗。疫苗包含RSV抗原肽和编码所述 RSV抗原肽的核酸。联合免疫疫苗可刺激iTreg细胞，包括但不限于⑶4+、⑶25_、FoxP3+、 IL-IO+O
[0129]联合免疫可用于治疗或改善疫苗诱发疾病（VID)，疫苗诱发疾病的原因是原初个 体在遭遇自然RSV感染前用FI-RSV或其G抗原或其F抗原免疫时使炎性反应加重的倾向， 这些炎性反应包括大量淋巴细胞浸润、肺嗜酸性粒细胞增多和2型细胞因子产生。VID改善 可通过病毒攻毒后肺组织病理学变化的减小而指示，和/或与淋巴细胞和嗜酸性粒细胞的 增殖和浸润的明显抑制相关。例如，VID的改善可由表现出⑶4+⑶25_FoxP3+IL-10+表型的 G抗原特异性iTreg细胞的诱导所致。iTreg刺激的细胞可生成高水平的IL-10,其刺激B 细胞产生中和抗体。
[0130] 联合免疫可诱导抗炎细胞因子11-10水平的上调，而下调RSV诱导的炎性细胞因 子,诸如IL-4、11-5、IL-13 和IFN-γ。
[0131] 疫苗剂量可以为1μg至IOmg活性组分/kg体重/次,并且可以为20μg至IOmg 组分/kg体重 / 次。可每 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用疫苗。用于有效治疗的疫苗剂量数可以为1、2、 3、4、5、6、7、8、9 或 10。
[0132]a.施用
[0133] 可根据制药领域的技术人员熟知的标准技术配制疫苗。可考虑诸如特定受试者的 年龄、性别、体重和状况以及施用途径等因素，按医学领域技术人员熟知的剂量和技术施用 此类组合物。受试者可以为哺乳动物，诸如人、马、牛、猪、绵羊、猫、狗、大鼠或小鼠。
[0134] 可预防性或治疗性地施用疫苗。在预防性施用中，可按足以诱导iTreg反应的量 施用疫苗。在治疗性应用中，可按足以引起治疗效果的量向有需要的受试者施用疫苗。将 足以实现这一目的的量定义为"治疗有效剂量"。对该用途有效的量将取决于（例如）所施 用的疫苗方案的特定组成、施用方式、疾病的阶段和严重程度、患者的总体健康状况和处方 医师的判断。
[0135]可通过如Donnelly等人（Ann.Rev.Immunol.I5 :617_648 (I"7));Felgner等人 (美国专利No. 5, 580, 859,1996年 12 月 3 日公布）；Felgner(美国专利No. 5, 703, 055,1997 年12月30日公布）以及Carson等人（美国专利No. 5, 679, 647,1997年10月21日）中描 述的本领域熟知的方法施用疫苗，所有这些参考文献的内容均以引用方式整体并入本文。 疫苗的DNA可复合到可（例如）使用疫苗枪施用给个体的颗粒或小珠。本领域的技术人员 将了解，药学上可接受的载体（包括生理学上可接受的化合物）的选择取决于（例如）表 达载体的施用途径。
[0136] 可经由多种途径递送疫苗。典型的递送途径包括肠胃外施用，例如皮内、肌内或皮 下递送。其它途径包括经口施用、鼻内和阴道内途径。尤其对于疫苗的DNA而言，可将疫苗 递送至个体组织的胞间隙（Feigner等人，美国专利No. 5, 580, 859和No. 5, 703, 055,它们的 内容均以引用方式整体并入本文）。也可将疫苗施用至肌肉，或可经由皮内或皮下注射，或 经皮，诸如通过离子电渗疗法施用。也可采用疫苗的表皮施用。表皮施用可涉及机械或化 学刺激表皮的最外层以刺激对刺激物的免疫反应（Carson等人，美国专利No. 5, 679, 647， 其内容以引用方式整体并入本文）。
[0137] 也可配制疫苗用于经由鼻通道施用。其中载体为固体的适合鼻腔施用的制剂可包 括粒度（例如）在约10至约500微米范围内的粗粉，以采用鼻烟的方式，即通过鼻通道从 接近鼻子的粉末容器中迅速吸入而施用所述粗粉。制剂可以为鼻喷剂、滴鼻剂，或通过喷雾 器经气溶胶施用。制剂可包括疫苗的水或油溶液。
[0138] 疫苗可以为液体制剂，诸如混悬剂、糖浆剂或酏剂。疫苗也可以为供肠胃外、皮下、 皮内、肌内或静脉内施用（例如，注射用）的制剂，诸如无菌混悬剂或乳剂。
[0139] 可将疫苗掺入脂质体、微球或其它聚合物基质（Feigner等人，美国专利 No. 5, 703, 055 ;Gregoriadis，LiposomeTechnology，第ItoIII卷（第 2 版，1993 年），其 内容以引用方式整体并入本文）。脂质体可由磷脂或其它脂质组成，并且可以为制备和施用 相对简单的无毒、生理学上可接受且可代谢的载体。
[0140] 可经由电穿孔，诸如通过其内容以引用方式并入本文的美国专利No. 7, 664, 545 中描述的方法施用疫苗。电穿孔可通过美国专利No. 6, 302, 874、No. 5, 676, 646、 No. 6, 241，701、No. 6, 233, 482、No. 6, 216, 034、No. 6, 208, 893、No. 6, 192, 270、 No. 6, 181，964、No. 6, 150, 148、No. 6, 120, 493、No. 6, 096, 020、No. 6, 068, 650 和 No. 5, 702, 359中描述的方法和/或设备进行，它们的内容以引用方式整体并入本文。可经 由微创装置进行电穿孔。
[0141] 微创电穿孔装置（"MID"）可以为用于将上述疫苗和相关流体注射进机体组织的 设备。该装置可包括空心针、DNA盒和流体递送机构，其中该装置适于启动使用中的流体递 送机构以便在将针插入所述机体组织的同时（例如，自动地）将DNA注射进机体组织。这 样的优点在于，在插入针的同时能够逐渐注射DNA和相关流体，导致流体在机体组织更均 匀的分布。由于注射的DNA在更大的区域分布，注射时经受的疼痛可得以减轻。
[0142]MID可将疫苗注射进组织，无需使用针。MID可注射作为细流或射流的疫苗，其 力量使得疫苗刺入组织表面并进入下层组织和/或肌肉。细流或射流后面的力可通过压 缩气体（诸如二氧化碳）在一瞬间通过微型孔的膨胀提供。微创电穿孔装置及其使用方 法的实例在已公布的美国专利申请No. 20080234655、美国专利No. 6, 520, 950、美国专利 No. 7, 171，264、美国专利No. 6, 208, 893、美国专利No. 6, 009, 347、美国专利No. 6, 120, 493、 美国专利No. 7, 245, 963、美国专利No. 7, 328, 064和美国专利No. 6, 763, 264中有描述，它们 每一者的内容以引用方式并入本文。
[0143]MID可包括产生无痛刺入组织的高速液体射流的注射器。此类无针注射器可 商购获得。本文可用的无针注射器的实例包括美国专利No. 3, 805, 783、No. 4, 447, 223、 No. 5, 505, 697和No. 4, 342, 310中描述的无针注射器，它们每一者的内容以引用方式并入 本文。
[0144] 可使用无针注射器，通常通过使组织表面与注射器接触，以便用足以使疫苗穿透 进组织的力启动药剂射流的递送，将呈适于直接或间接电迁移形式的所需疫苗引入（例 如，注射）至待治疗的组织中。例如，如果待治疗的组织为粘膜、皮肤或肌肉，则用足够的力 将药剂射向粘膜或皮肤表面以使药剂穿透角质层并进入真皮层，或分别进入下层组织和肌 肉。
[0145] 无针注射器很适合将疫苗递送至所有类型的组织，尤其是皮肤和粘膜。在一些实 施方案中，无针注射器可用于将含有疫苗的液体推至表面并进入受试者的皮肤或粘膜。可 使用本发明方法治疗的各类组织的代表性实例包括胰腺、喉、鼻咽、下咽部、口咽、唇、咽喉、 肺、心脏、肾、肌肉、乳房、结肠、前列腺、胸腺、睾丸、皮肤、粘膜组织、卵巢、血管或其任何组 合。
[0146]MID可具有使组织电穿孔的针电极。通过在多电极阵列中多对电极之间产生脉冲 (例如呈矩形或正方形模式的设置）提供比在一对电极之间产生脉冲改善的结果。例如， 标题为"NeedleElectrodesforMediatedDeliveryofDrugsandGenes" 的美国专利 No. 5, 702, 359公开了针阵列，其中在治疗期间可使多对针产生脉冲。在如同全面阐述地 以引用方式并入本文的该申请中，将针布置成圆形阵列，但是具有使得能够在反向针电极 对之间产生脉冲的连接器和转换设备。可使用用于将重组表达载体递送至细胞的一对针 电极。在美国专利No. 6, 763, 264中描述了这种装置和系统，其内容以引用方式并入本文。 作为另外一种选择，可使用单针装置，其允许用类似于普通注射针的单根针来注射DNA和 进行电穿孔并施加比目前使用的装置递送的脉冲电压低的脉冲，从而减轻患者经受的电感 觉。
[0147]MID可包括一个或多个电极阵列。阵列可包括两根或更多根具有相同直径或不同 直径的针。针均匀或不均匀地间隔开。针可在0.005英寸与0.03英寸之间，在0.01英寸 与0.025英寸之间，或在0.015英寸与0.020英寸之间。针的直径可以为0.0175英寸。针 可间隔开 〇· 5mm、I. 0mm、I. 5mm、2. 0mm、2. 5mm、3. 0mm、3. 5mm、4.Omm或更远。
[0148]MID可由脉冲发生器和一步递送疫苗和电穿孔脉冲的两针或多针疫苗注射器 组成。脉冲发生器可允许经由以闪存卡运行的个人计算机灵活编程脉冲和注射参数， 以及全面记录并存储电穿孔和患者数据。脉冲发生器可在短时间内递送多个电压脉 冲。例如，脉冲发生器可在持续期间递送3个IOOms的15V脉冲。这种MID的实例为 Inovio Pharmaceuticals的Elgen 1000系统，其在内容以引用方式并入本文的美国专利 No. 7, 328, 064中有描述。
[0149] MID可以为CELLECTRA(Inovio Pharmaceuticals)装置和系统，这是促进将大分 子（诸如DNA)引入机体或植物中的选定组织的细胞内的模块化电极系统。该模块化电极 系统可包括多个针电极；皮下针；提供从可编程恒定电流脉冲控制器向所述多个针电极的 导电性连接的电连接器；和电源。操作员可握住安装在承载结构上的所述多个针电极并将 它们牢牢插入机体内或植物的选定组织。然后大分子经由皮下针递送至选定的组织。激活 可编程恒定电流脉冲控制器并将恒定电流电脉冲施加到所述多个针电极。施加的恒定电 流电脉冲促进大分子引入所述多个电极之间的细胞。通过借助恒定电流脉冲限制组织内 的功率耗散将由于细胞过热导致的细胞死亡减到最少。美国专利No. 7, 245, 963中描述了 Cellectra装置和系统，其内容以引用方式并入本文。
[0150] Elgen 1000系统可包括提供空心针的装置；和流体递送机构，其中该设备适于启 动使用中的流体递送机构以便在将针插入所述机体组织的同时（例如，自动地）将流体 (本文所述的疫苗）注射进机体组织。优点是在插入针的同时能够逐渐注射流体，导致流体 在机体组织更均匀的分布。还认为，由于注射的流体的体积在更大的区域分布，注射时经受 的疼痛得以减轻。
[0151] 另外，自动注射流体有利于自动监测并记录注射的实际流体剂量。如果需要，可通 过控制单元对该数据进行存储以用于通过文件进行记录的目的。
[0152] 应了解，注射速率可以为线性的或非线性的并且可在将针插入待治疗受试者的皮 肤后和将其进一步插入机体组织的同时进行注射。
[0153] 可通过本发明的设备将流体注入其中的合适组织包括肿瘤组织、皮肤或肝组织， 但是可以为肌肉组织。
[0154] 该设备还可以包括用于指导将针插入机体组织内的针插入机构。流体注射速率受 针插入速率控制。这样的优点在于，可控制针插入和流体的注射，使得可根据需要使插入速 率与注射速率匹配。这还使得仪器更易于为使用者操作。如果需要，可提供用于自动将针 插入机体组织内的机构。
[0155] 使用者可选择何时开始流体注射。然而理想的是，当针尖到达肌肉组织时开始注 射并且所述设备可包括用于感测针已经插入开始流体注射的足够深度的机构。这意味着， 当针已到达所需深度（通常为肌肉组织开始的深度）时可自动提示开始流体注射。例如可 取肌肉组织开始的深度为预设针插入深度，例如将认为足够使针通过皮肤层的4mm的值。
[0156] 感测机构可包括超声探针。感测机构可包括用于感测阻抗或电阻变化的机构。在 这种情况下，所述机构可能不会同样记录针在机体组织内的深度，但是将更适于感测当针 从不同类型的机体组织移至肌肉内时阻抗或电阻的变化。这些替代方案的任一种提供相对 准确且操作简档的感测可开始注射的机构。如果需要，可进一步记录针的插入深度并可将 其用于控制流体的注射，使得在记录针插入的深度时确定待注射的流体体积。
[0157] 所述设备还可以包括：支撑针的底座；和将底座容纳于其中的壳，其中底座可相 对于壳移动，使得当底座相对于壳处于第一向后位置时针缩回在壳内，并当底座处于壳内 的第二向前位置时针伸出壳外。这对于使用者而言有利，因为可在患者的皮肤上将壳对准， 然后可通过相对于底座移动壳将针插入患者的皮肤内。
[0158] 如上所述，可取的是实现受控的流体注射速率，使得当将针插入皮肤时使流体在 针的长度上均匀地分布。流体递送机构可包括适于以受控的速率注射流体的活塞传动机 构。例如可通过伺服电机激活活塞传动机构。然而，可通过使底座相对于壳以轴向移动而 启动活塞传动机构。应了解，可提供用于流体递送的替代机构。因此，例如，可提供可挤压 以按受控或不受控速率进行流体递送的密闭容器代替注射器和活塞系统。
[0159] 上述设备可用于任何类型的注射。然而，设想在电穿孔领域中尤其有用，因此其还 包括用于向针施加电压的机构。这允许针不仅用于注射，还在电穿孔期间用作电极。这特 别有利，因为这意味着向与注射流体相同的区域施加电场。电穿孔一直存在的问题在于，很 难使电极与先前注射的流体精确对准，因此使用者往往在更大的区域注射大于所需体积的 流体并且向更大的区域施加电场以试图保证注射物质与电场之间的重叠。使用本发明，在 实现电场与流体之间的良好切合的同时可减小注射流体的体积和施加电场的大小。
[0160] 4.接种抗RSV感染的疫苗的方法
[0161] 本发明还涉及为受试者接种抗RSV感染的疫苗的方法。该方法包括向有需要的受 试者施用如本文所述的抗RSV疫苗。疫苗可包含RSV抗原肽和编码所述RSV抗原肽的核酸。 疫苗可刺激iTreg细胞，包括但不限于CD4+、CD25_、FoxP3+、IL-10+，其继而生成抗原特异性 响应。iTreg刺激细胞可生成高水平的IL-10,其刺激B细胞产生中和抗体。
[0162] 5.用于诱导抗RSV感染的中和抗体并抑制炎性T细胞的方法
[0163] 本发明还涉及用于在受试者中诱导抗RSV感染的中和抗体并抑制炎性T细胞的方 法。该方法包括向有需要的受试者施用如本文所述的抗RSV疫苗。该疫苗可包含RSV抗 原肽和编码所述RSV抗原肽的核酸。该疫苗可刺激iTreg细胞，包括但不限于⑶4+、⑶25' F〇xP3+、IL-10+。iTreg刺激细胞可生成高水平的IL-10,其刺激B细胞生成中和抗体。抑制 炎性T细胞包括诱导iTreg细胞。
[0164] 该方法利用抗原特异性免疫反应，该免疫反应通过用如上所述的RSV抗原和编码 所述RSV抗原的核酸对受试者进行联合免疫而产生。
[0165] 6.用于抑制RSV攻毒后的自身反应性CD4+T细胞诱导的方法
[0166] 本发明还涉及用于在受试者中抑制RSV攻毒后的自身反应性CD4+T细胞诱导的方 法。该方法包括向有需要的受试者施用如本文所述的抗RSV疫苗。该疫苗可包含RSV抗 原肽和编码所述RSV抗原肽的核酸。该疫苗可刺激iTreg细胞，包括但不限于⑶4+、⑶25、 F〇xP3+、IL-10+。iTreg刺激细胞可生成高水平的IL-10,其刺激B细胞生成中和抗体。抑制 炎性T细胞包括抑制自身反应性⑶4+和⑶8+T细胞。
[0167] 7.改善疫苗诱发疾病（VID)的方法
[0168] 本发明还涉及改善VID的方法。该方法包括向有需要的受试者施用如本文所述的 抗RSV疫苗。疫苗可包含RSV抗原肽和编码所述RSV抗原肽的核酸。该疫苗可刺激iTreg 细胞，包括但不限于CD4+、CD25_、FoxP3+、IL-10+。iTreg刺激细胞可生成高水平的IL-10,其 刺激B细胞生成中和抗体。可将受试者在遭遇自然RSV感染前用福尔马林灭活RSV(FI-RSV) 或RSV抗原免疫。
[0169] 8.用于保护受试者免于发生RSV攻毒后的气道高反应性（AHR)的方法
[0170] 本发明还涉及用于保护受试者免于发生RSV攻毒后的气道高反应性（AHR)的方 法。该方法包括向有需要的受试者施用如本文所述的抗RSV疫苗。疫苗可包含RSV抗原 肽和编码所述RSV抗原肽的核酸。该疫苗可刺激iTreg细胞，包括但不限于⑶4+、⑶25' F〇xP3+、IL-10+。iTreg刺激细胞可生成高水平的IL-10,其刺激B细胞生成中和抗体。可将 受试者在遭遇自然RSV感染前用福尔马林灭活RSV(FI-RSV)或RSV抗原免疫。该方法利用 抗原特异性免疫反应，该免疫反应通过用如上所述的RSV抗原和编码所述RSV抗原的核酸 对受试者进行联合免疫而产生。
[0171]RSV可在之前对RSV致敏的受试者中触发AHR。对RSV致敏是指之前暴露于RSV 一次或多次使得产生对RSV的免疫反应。与变态反应相关的反应（例如组胺释放、鼻炎、浮 肿、血管舒张、支气管收缩、气道炎症）通常不会在将原初个体首次暴露于RSV时发生，但是 一旦产生了针对RSV的细胞和体液免疫反应后，个体即对RSV"致敏"。AHR或气道阻塞可 在致敏受试者再次暴露于RSV时发生。一旦受试者对RSV致敏，变态反应可在随后每次暴 露于RSV时变得更糟，因为每次重新暴露于不仅产生变态症状，还进一步增加针对RSV产生 的抗体的水平和针对RSV的T细胞反应的水平。
[0172] 有发生气道高反应性风险的受试者是这样的受试者，其已暴露于足以触发AHR的 RSV或有暴露于足以触发AHR的RSV的风险，但尚未表现出可测量或可检测的AHR特征或症 状。有发生RSV诱发的AHR风险的哺乳动物是这样的哺乳动物，其之前已对RSV致敏，并已 暴露于一定量的足以触发AHR的RSV或有暴露于一定量的足以触发AHR的RSV(即，RSV的 触发剂量或攻毒剂量）的风险，但尚未表现出可测量或可检测的AHR特征或症状。
[0173]炎症的特征通常在于炎性介质（例如细胞因子或趋化因子）的释放，这些炎性介 质将炎症中涉及到的细胞募集到组织。RSV攻毒后的AHR涉及引起一种类型的针对RSV的 免疫反应（例如Th2型免疫反应），这可导致释放炎性介质，这些炎性介质募集哺乳动物炎 症中涉及到的细胞，其存在可导致组织损害，有时会导致死亡。Th2型免疫反应的特征部分 在于释放诱导IL-4、IL-5和IL-13的细胞因子。
[0174] 9.联合疗法
[0175] 如本文所用，术语"联合"在施用其它疗法的背景下是指使用不止一种疗法。使用 术语"联合"不限制向感染个体施用疗法的顺序。可以在将第二疗法施用给已患有或疑似 患有RSV感染、中耳炎或与之相关的呼吸道病症的受试者之前（例如1分钟、45分钟、30分 钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、 2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周）、同时或之后（例如1分钟、45分钟、30分钟、45分 钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3 周、4周、5周、6周、8周或12周）施用第一疗法。任一另外的疗法可以按任何顺序与其它 另外的疗法一起施用。在某些实施方案中，可以将本发明的疫苗与一种或多种疗法（例如， 同时施用以预防、治疗、管理和/或改善RSV感染（例如，急性RSV疾病或RSVURI和/或 LRI)、中耳炎和/或症状或呼吸道病症或与之相关的其它症状的疗法）联合施用。
[0176] 可与本发明的疫苗联合施用的疗法的非限制性实例包括任何合适且有效量的组 合物或药物组合物中的任一种，所述组合物包含对此调节、治疗或疗法有需要的细胞、组 织、器官、动物或患者的至少一种RSV抗体，任选地还包含选自以下的至少一种：至少一种 TNF拮抗剂（例如但不限于TNF抗体或片段、可溶性TNF受体或片段、其融合蛋白或小分 子TNF拮抗剂）、抗风湿药物（例如甲氨喋呤、金诺芬、金硫葡糖、硫唑嘌呤、依那西普、硫代 苹果酸金钠、硫酸羟氯喹、来氟米特、柳氮磺胺吡啶）、肌肉松弛剂、麻醉药物、非留体抗炎 药（NSAID)、止痛药物、麻醉药物、镇静药物、局部麻醉药物、神经肌肉阻断剂、抗微生物药 物（例如氨基糖苷、抗真菌药物、抗寄生虫药物、抗病毒药物、碳青霉烯、头孢菌素、氟喹诺 酮、大环内酯、青霉素、磺酰胺、四环素、另外的抗微生物药物）、抗牛皮癣药、皮质类固醇、促 合成代谢类留醇、糖尿病相关药物、矿物质、营养剂、甲状腺剂、维生素、钙相关激素、止泻药 物、镇咳药物、止吐药物、抗溃疡药物、轻泻药物、抗凝血剂、促红细胞生成素（例如促红素 α)、非格司亭（例如G-CSF、Neupogen)、沙格司亭（GM-CSF、Leukine)、免疫疗法、免疫球蛋 白、免疫抑制剂（例如巴利昔单抗、环胞菌素、达珠单抗）、生长激素、激素替代药物、雌激 素受体调节剂、散瞳剂、睫状肌麻痹剂、烷基化剂、抗代谢药物、有丝分裂抑制剂、放射药物、 抗抑郁药物、抗狂躁剂、安定药、抗焦虑药、催眠药、拟交感神经药、刺激剂、多奈哌齐、他克 林、哮喘药物、β激动剂、吸入类固醇、白三烯抑制剂、甲基黄嘌呤、色苷酸、肾上腺素或类似 物、阿法链道酶（Pulmozyme)、细胞因子或细胞因子拮抗剂，或U.S.Pharmacopoeia和/或 Physician'sDeskReference中所列的任何其它药剂。此类细胞因子的非限制性实例包 括但不限于IL-I至IL-23的任一者。合适的剂量是本领域熟知的。参见例如Wells等人编 辑，PharmacotherapyHandbook，第 2 版，AppletonandLange，Stamford，Conn. (2000);PDR Pharmacopoeia,TarasconPocketPharmacopoeia2000,精装本，TarasconPublishing, LomaLinda,Calif. (2000)，这些参考文献的每一者均以引用方式整体并入本文。
[0177] 10.试剂盒
[0178]本文提供可用于对受试者进行疫苗接种的试剂盒。该试剂盒可包括疫苗，其包含 抗原肽和编码所述抗原肽的DNA;以及MID。该试剂盒还可以包括使用试剂盒并进行分析、 监测或治疗的说明。
[0179]试剂盒还可以包括一个或多个容器，诸如小瓶或瓶子，而每个容器容纳单独的试 齐IJ。试剂盒还可以包括书面说明，其可以描述如何开展或解读分析、监测、治疗或本文所述 的方法。试剂盒还可以包括疫苗施用装置。疫苗施用装置可以为疫苗枪、用于施用疫苗的 针、或连接到用于递送疫苗的导管的电穿孔装置。
[0180]本发明具有通过以下非限制性实施例示出的多个方面。 实施例
[0181] 实施例1
[0182] 材料和方法
[0183] 以下是用于下述实施例2-8的材料和方法的描述。
[0184]对于动物和细胞，6-8周龄的Balb/c小鼠购自中国北京中国医学科学院实验动 物研究所，在12小时的光照循环下照料，并喂养无病原体的食物和水。所有动物方案均得 到中国农业大学动物福利委员会的批准。将NIH/3T3细胞系（美国典型培养物保藏中心 (八丁0：)，1?〇。1^1116，]\?，旧六0(^-1658)和冊口-2(六丁0：，〇(^-23)维持在设为371：和5%0) 2 的潮湿培养箱中的达尔伯克氏改良伊格尔培养基（DMEM) (Gibco/BRL，NY，USA)中，该培养 基补充有10%胎牛血清$03)和青霉素/链霉素（6让〇〇/81^)。
[0185]对于细菌菌株和质粒，将大肠杆菌TOP 10(中国北京天根生化科技有限公司）用 作进行操纵的宿主菌株，并将大肠杆菌BL21(DE3)(天根公司）用作表达菌株。真核表达载 体proVAX之前在该实验室中由巨细胞病毒（CMV)启动子和hCG-β先导序列构建（Du等 人，TheJournalofGeneMedicine9 :136-146(2007))。原核表达载体pET28a(+)(Novagen Inc，WI，USA)包含T7启动子并允许表达融合到多聚组氨酸标签的重组蛋白。所有细菌培 养均使用在适当时补充有卡那霉素的LB培养基（中国上海生工生物工程技术服务有限公 司）在摇瓶中进行。蛋白表达通过购自Invitrogen(CA,USA)的异丙基β-D-I-巯基半乳 糖苷（IPTG)诱导。
[0186] 对于质粒构建和真核表达，使用了编码RSVG糖蛋白的第67-298位氨基酸的优化 形式的基因（全长RSVG核苷酸序列对应于GenBank:ΑΥ911262. 1(RSV基因组；SEQIDNO: 6)的第 4687-5583 位；RSVG糖蛋白氨基酸序列（GenBankAAX23993;SEQIDNO:2);RSV G糖蛋白核苷酸序列（SEQIDNO:19))。优化氨基酸RSVG氨基酸序列的核苷酸序列（SEQ IDNO:20)通过外包（中国上海生工生物工程技术服务有限公司）进行了小鼠密码子优化 (SEQIDNO:22)和合成。密码子优化不仅消除了G片段的稀有密码子，还移除了N端的66 个氨基酸的跨膜域（Ghildyal等人，JournalofGeneralVirology86:1879-1884(2005))。 将密码子优化的基因在EcoRI和XhoI限制性位点亚克隆进真核表达载体proVAX，并指定 为proVAX/G。通过限制性消化和测序确认了其正确性。将纯化的质粒用Lipofectamine根 据制造商的说明（Irwitrogen，CA,USA)转染进了NIH/3T3细胞。在48h后收获转染子，根 据前人所述的方案（Jin等人，Vaccine22:2925-2935(2004))提取了总细胞RNA。用以下 特异性引物组通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR)检测了所关注的基因的表达：正向引物， 5, -ATGCATAAGGTGACTCCT-3,（SEQIDN0:7);反向引物，5, -TTACTGCCGTGGGGTGTT-3'（SEQ IDNO:8)。
[0187] 使用了编码RSVF融合蛋白的第412-524位氨基酸的优化形式的基因（全长RSV F融合蛋白核苷酸序列对应于GenBank:AY911262. 1(SEQIDNO:6)的第5660-7384位；RSV F融合蛋白氨基酸序列（GenBankAAX23994.I;SEQIDN0:1);RSVF融合蛋白核苷酸序列 (SEQIDNO:26))。对优化氨基酸RSVF氨基酸序列的核苷酸序列（SEQIDNO:23)针对原 核（即，大肠杆菌）表达进行了密码子优化（SEQIDNO:24)。
[0188] 对于质粒构建和原核表达，将编码RSVG糖蛋白（SEQIDNO:21)第67-298位氨基 酸的原核密码子优化基因通过类似的程序亚克隆进原核表达载体，并指定为pET28a(+)/G。 将编码RSVF(SEQIDNO:24)第412-524位氨基酸的原核密码子优化基因通过类似的程序 亚克隆进原核表达载体，并指定为pET28a(+)/F。通过限制性消化和测序确认了其正确性。 将大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞用pET28a(+)/G通过标准方法（Molecularcloning:A laboratorymanual,第 2 版，J.Sambrook、E.F.Fritsch和T.Maniatis编辑，ColdSpring HarborLaboratoryPress，1989)进行转化，并用 0. 5mmol/L的IPTG在 37°C下诱导了蛋 白表达。4h后，收集细胞、洗涤并重悬在PBS中。在超声处理后从细胞中分离了可溶性部 分和包含包涵体的不溶性部分。根据制造商手册使之穿过BiologicDuoFIowTM色谱系统 (Bio-Rad，CA,USA)上的Ni-NTASuperfloW柱（QIAGENGmbH，Hilden，Germany)而对重组 蛋白进行了纯化。通过12%SDS-PAGE对纯化的蛋白进行分析。
[0189] 对于western印迹分析，使蛋白样品在12%SDS-PAGE凝胶上接受电泳，然后使用 Bio-Rad转膜仪（Bio-Rad，CA,USA)转移到纤维素膜上。在与2%BSA混合的PBST中过夜 封闭后，将膜用山羊抗RSV抗血清（Meridian，Me，USA)以I: 2000的稀释度在4°C下孵育 2h。将膜用150mMPBST洗涤三次，然后用封闭缓冲液（与2%BSA混合的PBST)中的牛抗 山羊IgG-HRP偶联物（SantaCruz，CA，USA)以1 : 1000的稀释度在室温下孵育lh。通过 ECL法根据制造商的说明（GEHealthcareEurope,Uppsala,Sweden)检测了免疫复合物。
[0190] 对于RSV母液制备，从ATCC(目录号VR-26)获得RSV Long菌株，然后在含有5% CO2的潮湿氛围中在37°C下在HEp-2细胞中传播。将病毒以4 : 1的感染复数（m. 0.i.)加 入DMEM中的细胞。Ih后，将含有2%FCS的DMEM加入摇瓶，并监测3-4天的细胞感染。通 过在3,OOOXg和4°C下离心以除去细胞碎片而收获RSV，等分，然后储藏在-80°C下直至使 用。
[0191]如Kim等人，AmericanJournalofEpidemiology89 :422-434 (1969)所述制备了 福尔马林灭活RSV(FI-RSV)。简而言之，将1份福尔马林（约37% -40% )用4, 000份澄 清的病毒裂解物在37°C下孵育3天，然后通过在50,OOOXg下离心Ih而沉淀。将病毒按 1 : 25在最小必需培养基（MEM)中稀释，然后用氢氧化铝（4mg/ml)沉淀，以原始体积的 1/100重悬在无血清MEM中，然后储藏在4°C下。
[0192] 对于小鼠的免疫和攻毒，使用EndoFreePlasmidGiga试剂盒（QIAGEN，Hilden, Germany)根据制造商的建议分离了用于免疫的质粒DNA。将质粒和重组蛋白均溶于PBS。对 于疫苗接种，将小鼠随机分组，每组9只动物，如表1所列。将小鼠经肌内用FI-RSV、质粒、 质粒+蛋白或盐水溶液之一在第〇、14和28天免疫。在免疫前以及免疫后以2周的间隔对 小鼠采集血样。在最后一次免疫后第14天将小鼠经鼻内用RSV(50μ1中IO6TCID5tl)攻毒。 在攻毒后每天对小鼠称重。将数据表示为攻毒第〇天时基础体重的百分率。5天后将小鼠 处死，测定肺泡灌洗液中的肺病毒滴度和白细胞浸润。
[0193] 表1.免疫组
[0194]
【权利要求】
1. 一种抗呼吸道合胞病毒（RSV)感染的疫苗，其包含RSV抗原肽和编码所述RSV抗原 肽的核酸，其中所述疫苗刺激iTreg细胞（CD4+、CD25-、FoxP3+、IL-10+)。
2. 根据权利要求1所述的疫苗，其中所述RSV抗原肽选自F糖蛋白、G糖蛋白、SEQ ID NO :4 (优化的氨基酸RSV G氨基酸序列）、SEQ ID NO :25 (优化的氨基酸RSV F氨基酸序 列）及其功能片段。
3. 根据权利要求1所述的疫苗，其中所述核酸为DNA并且所述DNA编码选自以下的所 述RSV抗原肽：F糖蛋白、G糖蛋白、SEQ ID NO :4 (优化的氨基酸RSV G氨基酸序列）、SEQ ID NO :25 (优化的氨基酸RSV F氨基酸序列）及其功能片段。
4. 根据权利要求3所述的疫苗，其中所述DNA存在于环形质粒的线性表达盒中。
5. 根据权利要求4所述的疫苗，其中所述质粒选自pVAX、pcDNA3. 0和proVAX。
6. 根据权利要求4所述的疫苗，其中所述质粒还包含选自以下的启动子：CMV、SV40早 期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳氏肉瘤病毒启 动子和多角体启动子。
7. 根据权利要求1所述的疫苗，其中所述核酸和抗原肽处于选自5 : 1和1 : 5、1 : 1 和2 : 1的质量比。
8. 根据权利要求1所述的疫苗，其中所述疫苗能够电穿孔到有需要的受试者中。
9. 一种疫苗接种试剂盒，其包括疫苗施用装置和根据权利要求1所述的疫苗。
10. 根据权利要求9所述的试剂盒，其中所述疫苗施用装置选自疫苗枪、针和电穿孔装 置。
11. 根据权利要求10所述的试剂盒，其中所述电穿孔装置为微创电穿孔装置。
12. -种用于预防或治疗患者中的呼吸道合胞病毒感染的方法，所述方法包括向有需 要的受试者施用根据权利要求1所述的疫苗。
13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述受试者还受到保护免于发生呼吸道合胞病 毒攻毒后的气道高反应性（AHR)。
14. 根据权利要求12所述的方法，其中所述RSV抗原肽选自F糖蛋白、G糖蛋白、SEQ ID NO :4 (优化的氨基酸RSV G氨基酸序列）、SEQ ID NO :25 (优化的氨基酸RSV F氨基酸 序列）及其功能片段。
15. 根据权利要求12所述的方法，其中所述疫苗通过电穿孔而施用。
16. -种诱导抗呼吸道合胞病毒感染的中和抗体并抑制炎性T细胞的方法，所述方法 包括向有需要的受试者施用根据权利要求1所述的疫苗。
17. 根据权利要求17所述的方法，其中抑制炎性T细胞包括诱导iTreg细胞，并抑制自 身反应性⑶4+和⑶8+T细胞。
18. 根据权利要求16所述的方法，其中所述RSV抗原肽选自F糖蛋白、G糖蛋白、SEQ ID N0:4(优化的氨基酸RSV G氨基酸序列）、SEQ ID N0:25(优化的氨，基酸RSV F氨基酸 序列）及其功能片段。
19. 一种治疗或预防接受呼吸道合胞病毒（RSV)免疫的受试者中的疫苗诱发疾病的方 法，所述方法包括向有需要的受试者施用根据权利要求1所述的疫苗。
20. 根据权利要求19所述的方法，其中将所述受试者在遭遇自然RSV感染前用福尔马 林灭活RSV(FI-RSV)或RSV抗原免疫。
21. 根据权利要求19所述的方法，其中所述RSV抗原肽选自F糖蛋白、G糖蛋白、SEQ IDN0:4(优化的氨基酸RSVG氨基酸序列）、SEQIDN0 :25(优化的氨，基酸RSVF氨基酸 序列）及其功能片段。
22. 根据权利要求19所述的方法，其中所述疫苗经由电穿孔而施用。
23. 根据权利要求19所述的方法，其中所述电穿孔途径选自皮内和肌内。
24. 根据权利要求19所述的方法，其中所述疫苗通过微创电穿孔装置进行电穿孔。
【文档编号】C12N15/45GK104302325SQ201280069412
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2012年8月6日 优先权日:2012年2月10日
【发明者】王宾, 陈璇, 俞庆龄 申请人:北京艾棣维欣生物技术有限公司