专利名称：一种用精液蛋白基因检测昆虫卵孵化率的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用精液蛋白基因检测昆虫卵孵化率的方法。
背景技术：
害虫生物防治在农林业可持续发展中发挥着不可替代的重要作用。天敌昆虫的大量生产更是生物防治中最基础也是最重要的环节。捕食性天敌昆虫躅蝽(Armachinensis)可以控制来自鳞翅目、鞘翅目、半翅目、同翅目、膜翅目等多种农林害虫，尤其是它还可以控制重大外来入侵害虫马铃薯甲虫和美国白蛾，因此躅蝽是一种应用前景很好的天敌昆虫商品。作为商品，大量减少生产成本是人们追求利润最大化的一个途径。在天敌昆虫躅蝽生产中就可以应用不同的食物来生产躅蝽，例如，不同的昆虫猎物、含昆虫成分的人工饲料和不含昆虫成分的人工饲料，进而减少生产成本。但是应用不同的食物生产出来的躅蝽的生物学特性参差不齐，有些释放后能达到很好的控制害虫的作用，有的则在释放后效果不显著。由于不同食物饲喂的躅蝽在表型上很难区分，因此这些天敌昆虫在释放前是很难评估它们的生物学特性的。躅蝽成虫的卵孵化率是评价天敌昆虫生物学特性的一个很重要的指标。有较高卵孵化率的躅蝽种群繁殖快，倍增时间短，可以在短期内迅速控制住害虫。这可以大大减少防治害虫的成本，增加利润率。相反，卵孵化率较低的躅蝽由于卵孵化少、繁殖慢，倍增时间延长，因此控制住害虫的时间会相对滞后，这就大大增加了防治成本，减少了利润。目前，对于不同食物来源或不同商家的商品躅蝽卵孵化率的检测方法仍旧是在产卵期或人为规定的时间内测试其卵孵 化率的多少，这种方法费时费力费钱。因此需要一种快速检测天敌昆虫商品生物学特性-卵孵化率的方法。昆虫体内，精液蛋白(seminal fluid protein CSSFP066)产生于雄虫附腺中，它可以刺激精子的储存、延迟精子的替代和竞争、显著地增加雄虫的适切性。
发明内容
本发明的一个目的是提供用于检测精液蛋白CSSFP066编码基因表达量的物质用途。本发明提供的用于检测精液蛋白CSSFP066编码基因表达量的物质在检测昆虫卵孵化率中的应用；所述精液蛋白CSSFP066的氨基酸序列为序列表中的序列2。上述应用中，所述昆虫为昆虫个体或昆虫种群；所述昆虫种群具体为取食不同物质昆虫种群；所述取食不同物质昆虫种群进一步具体为取食人工饲料的昆虫种群或取食猎物的昆虫种群；所述精液蛋白CSSFP066编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列I或序列表中的序列I自5’末端第1-312位核苷酸。所述昆虫具体为躅蝽。上述人工饲料按照如下方法制备生猪肝60g、大豆粉10g、水100ml、鸡蛋20ml、干酪素2g、鹿糖8g、VCO. 2g、氯化胆碱0. 4g、泛酸韩8mg、叶酸0. lmg、烟酰胺0. 2mg、庆大霉素
3.9mg ;具体饲喂方法见实施例2 ；上述猎物为昨蚕(Antheraea pernyi)蛹；具体饲喂方法见实施例2。上述应用中，所述用于检测精液蛋白CSSFP066编码基因表达量的物质为如下I) -3)中任意一种I)引物对A :所述引物对由引物I和引物2组成；所述引物I的核苷酸序列为序列表中序列3 ;所述引物2的核苷酸序列为序列表中序列4 ；2 )含有所述弓I物对A的RT-PCR试剂；3)含有所述引物对A或所述RT-PCR试剂的试剂盒。上述应用中，所述R T-PCR试剂由水、RT-PCR扩增缓冲液、镁离子、dNTPs、所述的弓I物对A、荧光染料和Taq酶组成；所述引物对A中的各条引物在所述RT-PCR试剂中的终浓度具体为0. 2-1 U M，所述引物对A中的各条引物在所述RT-PCR试剂中的终浓度进一步具体为0. 25iiM ;所述试剂盒还包括内参引物对B，所述内参引物对B由引物3和引物4组成；所述引物3的核苷酸序列为序列表中的序列6 ;所述引物4的核苷酸序列为序列表中的序列7。本发明的另一个目的是提供一种检测昆虫卵孵化率的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤用所述的引物对A或所述的RT-PCR试剂或所述的试剂盒对待测的昆虫A和B进行RT-PCR扩增；若所述昆虫A的精液蛋白CSSFP066基因的表达量高于所述昆虫B，则所述昆虫A卵孵化率高于所述昆虫B。上述方法中，所述昆虫为昆虫个体或昆虫种群；所述RT-PCR扩增的模板为昆虫的cDNA ；所述昆虫具体为躅蝽。在本发明的实施例中，所述昆虫A为取食猎物的昆虫种群；所述昆虫B为取食人工饲料的昆虫种群。本发明的实验证明，本发明所提供的检测方法可以通过检测精液蛋白CSSFP066基因表达量来检测不同种群的昆虫卵孵化率，特别是不同营养源的躅蝽的卵孵化率。实验证明，用本发明的检测方法检测昆虫的卵孵化率仅需2-3天。而用传统的生物学方法需要30-60天左右。本发明的检测方法涉及的材料来源广，易购买，操作简单，省时，省力，适合于在昆虫商品检验检测中推广应用。
图1为躅蝽beta-actin内参扩增曲线图2为躅蝽beta-actin内参融解曲线图3为躅蝽精液蛋白CSSFP066基因扩增曲线图4为躅蝽精液蛋白CSSFP066基因融解曲线
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、检测昆虫卵孵化率的精液蛋白CSSFP066及其编码基因的发现和专用引物的设计研究发现，精液蛋白基因是一种检测昆虫卵孵化率的很好的分子标记，因此本发明通过检测躅蝽的精液蛋白(seminal fluid protein CSSFP066)编码基因的表达来检测躅蝽的卵孵化率。躅蝽的精液蛋白CSSFP066编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列I或序列表中的序列I自5’末端第1-312位核苷酸，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。根据躅蝽的精液蛋白CSSFP066编码基因设计用于扩增该编码基因的引物如下上游引物TCACCAGTCCTTGCTTCGAC(序列 3 );下游引物TGCACTCGTAGGGAnTTGTC(序列 4)。实施例2、精液蛋白CSSFP066或编码基因或专用引物在检测躅蝽卵孵化率中的应用下述实验中米用的螞畴(Armachinensis,记载在 Taxonomic and bionomicnotes onArma chinensis (Fallou) (Hemiptera:Pentatomidae:Asopinae, Zootaxa,3382:41-52, 2012，公众可从中国农业科学院植物保护研究所获得)根据取食物质的不同分为两组，每组50只 取食人工饲料组躅蝽饲喂人工饲料的躅蝽(27 ±1° C，16:8(L:D)，75±5%RH)每天每头成虫饲喂160 Ul人工饲料，一直到躅蝽自然死亡；取食猎物组躅蝽饲喂猎物的躅蝽(27±1° C，16:8(L:D)，75±5%RH)每对成虫饲喂一头猎物，每隔7-15天根据猎物被取食情况更换一次猎物，一直到躅蝽自然死亡；人工饲料为生猪肝60g、大豆粉IOgjjC 100ml、鸡蛋20ml、干酪素2g、鹿糖8g、VCO. 2g、氯化胆碱0. 4g、泛酸I丐8mg、叶酸0. lmg、烟酰胺0. 2mg、庆大霉素3. 9mg ；猎物为昨蚕(Antheraea pernyi )蛹(可商购)。一、躅蝽cDNA的获得1、躅蝽RNA抽提步骤如下将各组躅蝽样品移入加入适量液氮的研钵中，快速、用力研磨成匀浆，移至1. 5ml
离心管中。加1000 u ITri zol到1. 5ml离心管中，静置5分钟。加200 U I氯仿，旋涡振荡10秒，静置5分钟，放入离心机中，12，000g4°C离心15分钟。将上清液转移至新的1. 5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，振荡混匀，_20°C放置I小时，室温静置10分钟。放入离心机中，12，000g，4°C离心10分钟。弃上清液，将异丙醇除尽，加入Iml75%的无水乙醇，12，000g，4°C离心5分钟。
弃上清液，待沉淀干燥后加入DEPC处理水，_80°C保存，得到RNA。2、反转录米用SuperscripttOReverse Transcriptasekit 试剂盒(Invitrogenl8080044)进行反转录a)取一灭菌的无RNA酶的印pendorf管，每个样本加入如下表I所示的组分得到mixl ；表I为反转录加入组分I
权利要求
1.用于检测精液蛋白CSSFP066编码基因表达量的物质在检测昆虫卵孵化率中的应用； 所述精液蛋白CSSFP066的氨基酸序列为序列表中的序列2。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述昆虫为昆虫个体或昆虫种群； 所述精液蛋白CSSFP066编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列I或序列表中的序列I自5’末端第1-312位核苷酸； 所述昆虫具体为躅蝽。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述用于检测精液蛋白CSSFP066编码基因表达量的物质为如下I) -3)中任意一种 1)引物对A:所述引物对由引物I和引物2组成；所述引物I的核苷酸序列为序列表中序列3 ;所述引物2的核苷酸序列为序列表中序列4 ； 2)含有所述引物对A的RT-PCR试剂； 3)含有所述引物对A或所述RT-PCR试剂的试剂盒。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于 所述RT-PCR试剂由水、RT-PCR扩增缓冲液、镁离子、dNTPs、所述的引物对A、荧光染料和Taq酶组成； 所述弓I物对A中的各条弓I物在所述RT-PCR试剂中的终浓度具体为0. 2-1 ii M,所述弓I物对A中的各条引物在所述RT-PCR试剂中的终浓度进一步具体为0. 25uM ； 所述试剂盒还包括内参引物对B，所述内参引物对B由引物3和引物4组成；所述引物3的核苷酸序列为序列表中的序列6 ;所述引物4的核苷酸序列为序列表中的序列7。
5.一种检测昆虫卵孵化率的方法，包括如下步骤用权利要求3或4应用中所述的引物对A或所述的RT-PCR试剂或所述的试剂盒对待测的昆虫A和B进行RT-PCR扩增； 若所述昆虫A的精液蛋白CSSFP066基因的表达量高于所述昆虫B，则所述昆虫A的卵孵化率高于所述昆虫B。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述昆虫为昆虫个体或昆虫种群； 所述RT-PCR扩增的模板为昆虫的cDNA ； 所述昆虫具体为躅蝽。
全文摘要
本发明公开了一种用精液蛋白基因检测昆虫卵孵化率的方法。本发明提供了用于检测取食不同物质的昆虫种群的精液蛋白CSSFP066编码基因表达量的物质在检测取食不同物质的昆虫种群卵孵化率中的应用；所述精液蛋白CSSFP066的氨基酸序列为序列表中的序列2。本发明的实验证明，本发明所提供的检测方法可以用于检测昆虫卵孵化率，特别是不同营养源的蠋蝽的卵孵化率，用本发明的检测方法检测昆虫的卵孵化率仅需2-3天。而用传统的生物学方法需要30-60天左右。本发明的检测方法涉及的材料来源广，易购买，操作简单，省时，省力，适合于在昆虫商品检验检测中推广应用。
文档编号C12Q1/68GK103060465SQ20131003140
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月28日 优先权日2013年1月28日
发明者邹德玉, 陈红印, 张礼生, 王树英, 陈长风, 王孟卿, 刘晨曦 申请人:中国农业科学院植物保护研究所