专利名称：鮸鱼热休克蛋白hsp90基因的荧光定量pcr检测方法
技术领域：
本发明涉及鱼类热应激蛋白功能基因的检测方法，具体地说，涉及鯢鱼热休克蛋白HSP90基因的荧光定量PCR检测方法。
背景技术：
热休克蛋白(Heat shock proteins, HSPs)又称热应激蛋白，是所有细胞能在应激情况下由热休克基因所编码合成的高度保守的一类蛋白，它们能使细胞对抗更为严重的应激损伤，对维持机体的稳定发挥着重要作用，已成为当今世界生命科学研究领域的热点。热休克蛋白按同源性及分子量大小包括5个主要家族:HSP110、HSP90、HSP70、HSP60和小分子量热休克蛋白。其中HSP90是近年来被深入并广泛研究的一种蛋白。它作为蛋白成熟过程中的分子伴侣，可保证蛋白正确构象、纠正突变蛋白的错误折叠，维持留体激素类受体、激酶、中心体等的结构，参与细胞周期调节、机体免疫调节和信号传导，从而提高生物体对环境胁迫或伤害的耐受性，更能适应周围不利的环境。目前海水养殖业的发展面临的病害问题日趋严重，养殖生态环境的破坏，鱼类疾病频繁 暴发，给鱼类养殖业造成了巨大经济损失。虽然抗生素的使用可以一定程度减少细菌病的暴发，但过多使用会增加病原菌的抗药性，药物残留亦会造成环境污染。因此提高鱼体自身免疫能力是病害防治的趋势。热休克蛋白的产生，体现了生物对环境的自我主动适应能力。因此，利用分子生物学技术提高HSP90基因的表达，增强鱼类自身对环境应激的防护和对不同环境的适应能力。深入开展鱼类热休克蛋白研究，可进一步揭示其在生理过程中的作用，以及与其他因素在时空上综合保护细胞和机体的机理，其研究成果将在实践中对鯢鱼养殖业的发展起巨大的促进作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种鯢鱼热休克蛋白HSP90基因的荧光定量PCR检测方法。为了实现本发明目的，本发明首先提供用于检测鯢鱼热休克蛋白HSP90基因的荧光定量PCR引物对，其包括:正向引物HSP90-RT-F: 5 ’ -ATGACCAAAGCCGACCTG-3 ’ 和反向引物HSP90-RT-R: 5 ’ -GTGAAAGAACCTCCAGCA-3 ’。本发明还提供用于检测鯢鱼热休克蛋白HSP90基因的试剂盒。优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种或多种。更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。本发明进一步提供一种鯢鱼热休克蛋白HSP90基因的荧光定量PCR检测方法，其是利用所述引物HSP90-RT-F和HSP90-RT-R，或含有该引物对的试剂盒对鯢鱼热休克蛋白HSP90基因进行荧光定量PCR检测。包括以下步骤:I)提取样品组织中的总RNA，反转录成cDNA ；2)以步骤I)中的cDNA为模板，HSP90-RT-F和HSP90-RT-R为引物，进行PCR扩增反应;3)分析PCR产物。PCR反应体系以25 ill计为:
模板 cDNAIOOng
IOmM dNTPs2ul
I O(JN^1-HSlx)O-RT-FI^il
10|iPvr41.HSP90-RT-RI^il
2U4d/&/DNA 聚合酶UU
IOxPCR反应缓冲液2.5叫
CidH2O补足至25叫。PCR反应条件为:94°C 5分钟；94°C 30秒，60°C 30秒，72°C I分钟，共30个循环；72 0C 5分钟。本发明采用实时荧光定量PCR技术检测热休克蛋白HSP90基因在鯢鱼的脑、眼球、鳍条、鳃、心脏、小肠、肾脏、肝脏、 肌肉、脾脏中的转录本水平，结果表明:在上述十个组织中均能检测到热休克蛋白HSP90基因mRNA转录本的存在，其中在肝中的丰度最高，其次为鳍和脑，而在其他组织中仅检测到较少量的mRNA转录本存在。优选地，本发明提供一种检测鯢鱼热休克蛋白HSP90基因的方法，其中热休克蛋白HSP90基因在不同组织中的表达分布进行实时定量检测，反应条件为:在ABI7300实时荧光定量PCR系统上进行反应，荧光定量反应程序模板设置为ddCt (RelativeQuantitation) Plate，反应循环参数设置为:95°C 20s ；95°C 5s, 60°C 30s，共 40 个循环，利
用2_AACT法计算相对表达量。优选地，本发明的一种检测鯢鱼热休克蛋白HSP90基因的方法，其中热休克蛋白HSP90基因在不同组织中的表达实时定量检测，20iiL反应体系包括:9iiL SYBR GreenReal-time PCR Master Mixtures、10 y mol/L正向引物HSP90-RT-F和反向引物HSP90-RT-R各I ii L、IOOng的cDNA模板溶液I ii L及超纯水8 y L。与现有技术相比，本发明具有如下优点:鯢鱼热休克蛋白HSP90基因的荧光定量PCR检测方法能够有效、快速、准确地检测到热休克蛋白HSP90基因在鯢鱼各种组织内的表达以及该基因的表达水平。这种高效检测方法的建立对于研究鯢鱼应对外来应激反应的机制具有重要的意义，此外，本发明提供的特异性引物对还可以用于HSP90基因的分子多态性研究。
图1为本发明利用特异性引物HSP90-RT-F和HSP90-RT-R对鯢鱼及同科内近缘不同物种的PCR扩增产物电泳检测结果；其中M =DNA分子量标准(DL2000)，从上到下条带依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和IOObp ;1_6:为不同海域采集的鯢鱼样品；7:皇姑鱼；8:大黄鱼；9:棘头梅童鱼；10:白姑鱼；11:小黄鱼；12:黑觸梅童鱼；13:美国红鱼；14:皮氏叫姑鱼。图2为本发明利用特异性引物HSP90-RT-F和HSP90-RT-R对鯢鱼不同浓度的cDNA模板进行PCR扩增的电泳检测结果；其中M =DNA分子量标准(DL2000)，从上到下条带依次为 2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp 和 IOObp ;1_10 依次为 10 101° 倍浓度梯度稀释的cDNA模板扩增图。图3为本发明荧光定量PCR检测热休克蛋白HSP90基因在鯢鱼各组织中的分布及表达水平。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(New York:Gold Spring HarborLaboratory Press, 1989),或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例鯢鱼热休克蛋白HSP90基因的荧光定量PCR检测方法1.1主要材料、试剂和仪器设备
手术刀，眼科剪，镊子，解剖盘，充氧泵，水箱，1.5ml离心管，微量移液器、微量移液器枪头，一次性培养皿，陶瓷研钵。脱氧核糖核苷酸dNTP，Taq DNA聚合酶，Trizol-A+总RNA提取试剂盒，RealMasterMix (SYBRGreen)试剂，Quant cDNA第一链合成试剂盒以及DH5 a感受态细胞，小型离心机(Qspin ，BAYGENE)，涡旋振荡器(QL-866型，QILINEBEIER)，核酸蛋白仪(SmartSpace Plus, Bio-Rad),超净工作台(SW-CJ-1G型，名牌之星)，恒温培养箱(普斯特)，-80°C超低温冰箱(Thermo scientific)，荧光定量PCR系统(ABI 7300型)，pH计(Mettler Toledo320PH Meter)、高压蒸气灭菌锅(SANYO)、高速冷冻离心机(Centrifuge5417R, eppendorf)、电泳仪(DYY-6C型,北京六一)、水浴锅(上海精宏)、凝胶成像系统(Bio-RadGD2000)、PCR 仪(ABI Veriti96well Thermal Cycler)、自动测序仪(ABI3730 型)。本实施例中使用的常规药品氯仿(分析纯)，异丙醇(分析纯)，氯霉素，氯化钠(分析纯)购自国药集团，异丙基硫代-D-半乳糖苷(IPTG)，5-溴-4-氯-3-吲哚-P -D-半乳糖苷(X-gal)，胰蛋白胨，酵母提取物，琼脂糖，溴化乙锭，焦碳酸二乙酯(DEPC)等购自Takara公司，液氮为浙江省舟山亿洋气体有限公司产品，脱氧核糖核苷酸dNTP，Taq DNA聚合酶，Trizol-A+ 总 RNA 提取试剂盒，RealMasterMix (SYBRGreen)试剂，Quant cDNA 第一链合成试剂盒以及DH5a感受态细胞购自TIANGEN公司，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。本发明实施例所用主要仪器包括:小型离心机(Qspin ，BAYGENE)，涡旋振荡器(QL-866 型，QILINEBEIER)，核酸蛋白仪(SmartSpace Plus, Bio-Rad)，超净工作台(SW—CJ一IG型，名牌之星)，恒温培养箱(普斯特)，-80 °C超低温冰箱(Thermo scientific),荧光定量PCR系统(ABI7300型)pH计(Mettler Toledo320PH Meter)，高压蒸气灭菌锅(SANYO),高速冷冻离心机(Centrifuge5417R, eppendorf),电泳仪(DYY-6C 型，北京六一)，水浴锅(上海精宏)，凝胶成像系统(Bio-Rad⑶2000)，PCR仪(ABI Veriti96well ThermalCycler)，自动测序仪(ABI3730型)。
1.2鯢鱼RNA的提取及cDNA合成以及各近缘物种基因组DNA的提取本实施例中涉及的样本为采自6个不同海域的鯢鱼个体、皇姑鱼、大黄鱼、棘头梅童鱼、白姑鱼、小黄鱼、黑鳃梅童鱼、美国红鱼、皮氏叫姑鱼等(表I)。表I用于PCR检测的样本来源
权利要求
1.用于检测鯢鱼热休克蛋白HSP90基因的荧光定量PCR引物对，其特征在于，其包括: 正向引物 HSP90-RT-F:5’ -ATGACCAAAGCCGACCTG-3’ 和 反向引物 HSP90-RT-R:5’ -GTGAAAGAACCTCCAGCA-3’。
2.含有权利要求1所述引物对的用于检测鯢鱼热休克蛋白HSP90基因的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种或多种。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
5.鯢鱼热休克蛋白HSP90基因的荧光定量PCR检测方法，其是利用权利要求1所述引物对或权利要求2-4任一项所述试剂盒对鯢鱼热休克蛋白HSP90基因进行荧光定量PCR检测。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)提取样品组织中的总RNA，反转录成cDNA； 2)以步骤I)中的cDNA为模板，HSP90-RT-F和HSP90-RT-R为引物，进行PCR扩增反应； 3)分析PCR产物。
7.根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于，PCR反应体系以25计为:
8.根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于，PCR反应条件为:94°C5分钟；940C 30秒，60°C 30秒，72°C I分钟，共30个循环；72°C 5分钟。
全文摘要
本发明提供一种鮸鱼热休克蛋白HSP90基因的荧光定量PCR检测方法，扩增使用的特异性引物的核苷酸序列如Seq ID No.1和2所示。利用荧光定量PCR技术分析热休克蛋白HSP90基因在不同器官/组织中的表达谱。对进一步研究鱼类应激蛋白的功能及其特征具有重要的意义，对鮸鱼养殖业的健康发展起到推动作用。
文档编号C12N15/11GK103103274SQ20131003095
公开日2013年5月15日 申请日期2013年1月24日 优先权日2013年1月4日
发明者徐田军, 王日昕, 魏涛, 孙悦娜 申请人:浙江海洋学院