专利名称：高效裂解串联基因，高效裂解质粒及构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种由噬菌体PhiX174突变裂解基因mE和葡萄球菌核酸酶A基因SNA组成的闻效裂解串联基因，含有此闻效裂解串联基因的闻效裂解质粒及构建方法，还涉及所述高效裂解质粒在制备菌蜕中的应用。
背景技术：
细菌菌蜕(Bacterial Ghosts, BGs)是革兰氏阴性菌被噬菌体PhiX174的裂解蛋白E裂解后形成的完整的细菌空壳。裂解蛋白E是由91个氨基酸组成的疏水跨膜蛋白，其本身不具有任何酶的活性，但可通过寡聚化介导跨膜孔道的形成。孔道形成后，在细胞内高渗透压的作用下革兰氏阴性菌的大部分胞质内容物由孔道排出，从而形成不含核酸、核糖体及其它组分的细菌空壳。这种非变性的基因灭活方式使菌蜕完好地保留了细菌的各种表面抗原成分和免疫粘附分子。因此，菌蜕不仅可以直接作为疫苗使用，而且还可作为递呈异源抗原的重组疫苗及作为核酸疫苗甚至药物的递送载体。细菌菌蜕的形成是通过对裂解基因E的严格表达调控实现的，应用最广泛的是入pL/pR-cI857温控表达系统。基因E的温控表达介导的细菌裂解已经成功地应用于很多革兰氏阴性菌，例如:大肠杆菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、幽门螺旋杆菌、胸膜肺炎放射杆菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯氏菌、巴氏杆菌、鳗弧菌、嗜水气单胞菌、爱德华菌等。因此，推测只要将基因E裂解框引入到合适的载体中，E蛋白介导的裂解可能会在每种革兰氏阴性菌中发生。然而，E蛋白介导的裂解过程依赖于宿主细菌的生长状态，要求宿主细菌处于对数生长中期，OD600值在0.2 0.6之间，这致使菌蜕的产量偏低，限制了菌蜕的大规模生产。即使宿主细菌处于对数生长中期，E蛋白介导的裂解过程并不能使所有细菌失活。有研究应用流式细胞术监控大肠杆菌菌蜕的形成，在菌蜕制剂中未裂解的可繁殖细胞最低比率也达到1%，还存在约4%裂解 不完全的失活细胞。在这些未裂解和裂解不完全的失活细胞中存在着大量的细菌遗传物质，使菌蜕存在着病原决定簇基因或抗生素基因侧向传播的风险。菌蜕要作为疫苗或分子递送载体使用，必须克服裂解效率低、产量低及菌蜕中存在的不安全因素等难题。因此，本领域需要更为安全、高效的裂解质粒，并应用该质粒制备安全的菌蜕制剂。
发明内容
针对上述背景技术中提到的裂解效率低、产量低及菌蜕中存在的不安全因素等问题，本发明提供了一种由噬菌体PhiX174突变裂解基因mE和葡萄球菌核酸酶A基因SNA组成的闻效裂解串联基因，含有此闻效裂解串联基因的闻效裂解质粒及构建方法。本发明还提供了所述高效裂解质粒在制备菌蜕中的应用。本发明是通过以下方式实现的:
一种由噬菌体PhiX174突变裂解基因mE和葡萄球菌核酸酶A基因SNA组成的高效裂解串联基因，基因序列如序列表中序列3所不。
含有上述所述的闻效裂解串联基因的闻效裂解质粒。所述的高效裂解质粒，将所述的高效裂解串联基因酶切后插入PBV220载体中。所述的高效裂解质粒的构建方法，包括以下步骤:
(1)以噬菌体PhiX174RFI DNA为模板、以序列表中的序列4和序列5为引物进行PCR扩增，获得突变裂解基因E ;
(2)以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板、序列表中序列6和序列7为引物进行PCR扩增，获得葡萄球菌核酸酶A基因；
(3)将步骤(I)中得到的突变裂解基因E和步骤(2)中得到的葡萄球菌核酸酶A基因作为下一步PCR反应的模板，用序列表中的序列4和序列7进行扩增，得到串联基因；
(4)将串联基因应用I和I限制性内切酶进行双酶切，酶切产物与经I和Sall双酶切的pBV220载体连接，得到高效裂解质粒。将步骤(4)得到的高效裂解质粒转化大肠杆菌DH5CI感受态细胞，30°C过夜培养16 h，挑取单菌落于氨苄青霉素抗性的LB培养基中30°C过夜振荡培养，提取质粒，保留鉴定为阳性的质粒。所述的高效裂解质粒在制备菌蜕中的应用。所述的菌蜕优选为肠杆菌科的菌蜕。所述的应用，包括以下步骤:
(1)将含有高效裂解质粒的大肠杆菌DH5α在30°C培养至OD6tltl值达到1.0-1.2 ；
(2)培养温度升高至42°C诱导高效裂解串联基因的表达；
(3)在升温诱导90min时添加终浓度为IOmM的CaCl2和I mM的MgCl2，来激活SNA的活性；
(4)升温诱导4h时，收集步骤(3)获得的菌蜕，洗涤后保存。有益效果:本发明构建的安全高效的裂解质粒pBV-mELS能够在大肠杆菌菌液0D_值达到1.0以上时进行诱导，裂解效率可到达99.99995%，不仅突破了裂解基因E介导的裂解过程依赖宿主细菌生长状态(OD6c 为0.4 0.6)的局限性，大大提高了菌蜕的产量，还能够有效清除菌蜕中残存的遗产物质，降低了危害性遗传元件(抗生素抗性基因和病原决定族基因)的侧向传播。
附图1本发明构建的安全高效的裂解质粒pBV-mELS的物理图谱；
附图2大肠杆菌DH5a (pBV-mELS)的裂解动力学曲线；
附图3大肠杆菌DH5a (pBV-mELS)在裂解过程中菌体和上清中遗传物质的定量分析； 附图4大肠杆菌DH5a (pBV-mELS)在裂解过程中菌体和上清中遗传物质的电泳分析， 其中A为菌体中基因组DNA，B为菌体中质粒DNA，C为培养物上清中DNA ；
附图5大肠杆菌DH5a (pBV-mELS)菌蜕的扫描电镜照片；
附图6大肠杆菌DH5 a (pBV-mE)的裂解动力学曲线；
附图7大肠杆菌DH5 a (pBV-mE)在裂解过程中菌体和上清中遗传物质的定量分析； 附图8大肠杆菌DH5 a (pBV-mE)在裂解过程中菌体和上清中遗传物质的电泳分析， 其中自左至右依次为菌体中基 因组DNA、菌体中质粒DNA、培养物上清中DNA。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步阐释本发明，本发明构建的安全高效的裂解质粒PBV-mELS的结构特征和优势将随着描述而更为清晰。下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。实施例1、安全高效的裂解质粒pBV-mELS的构建 1.1噬菌体PhiX174突变裂解基因E的PCR扩增
根据GenBank中PhiX174 (GenBank N0.J02482.1)裂解基因E的编码序列设计引物，通过将点突变引入引物，扩增突变裂解基因E (mE)。在引物mE-F的5’端引入I限制性酶切位点，在引物mE-R的5’端引入15个氨基酸(Gly4Ser) 3序列作为Linker,预计扩增片段长度为327 bp ο引物由上海生工生物工程公司合成，序列如下:
mE-F:5’ - GCGAATTCTGGTACGCTGGACTTTGTG -3’，(见序列表中序列 4)mE-R:5’_ GCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACC CTCCTTCCGCAC-3’，(见序列表中序列5)
以PhiX174 RFI DNA为模板通过PCR扩增突变裂解基因E。PCR反应体系为50 yL中，含 IOXDreamTaq Buffer (Mg2+ Plus) 5 μ L, dNTP Mixture 200 μ M, PhiX174 RFI DNA 2ng,mE_F 和 mE_R 各 0.8 μ Μ, Fermentas DreamTaq 1.25 U。PCR 反应程序为 94°C预变性 5min ；94°C 40s, 60°C 90 s，每个循环降低 0.5°C，72°C 40s，20 个循环；94°C 40s, 55°C 60s，72°C 40 s, 30个循环，72°C延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收约320bp的片段，即为突变裂解基因E (见序列表中序列I)的PCR产物。1.2葡萄球菌核酸酶 A基因的PCR扩增
根据Genbank上的金黄色葡萄球菌核酸酶A(SNA)基因(GenBank N0.NC_003923)的序列设计引物，引物横跨SNA成熟蛋白的编码区，预计扩增片段长度为506 bp。在引物SNA-F的5，端引入15个氨基酸(Gly4Ser)3序列作为Linker,在引物SNA-R的5，端引入5^7 I限制性酶切位点。引物由上海生工生物工程公司合成，序列如下:
SNA-F:5，_ AGGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGC AACTTCAACT-3’(见序列表中序列6)
SNA-R:5’ - GCGTCGACTTATTGACCTGAATCAGCGT -3’(见序列表中序列 7)
应用酚/氯仿抽提法提取金黄色葡萄球菌的基因组DNA，作为PCR模板，以SNA-F和SNA-R为引物，扩增不包含信号肽序列的SNA基因。PCR反应体系为50yL中，含IOXDreamTaq BufferCMg2+ Plus)5 μ L, dNTP Mixture 200 μ M，基因组DNA 3 μ L, SNA-F和 SNA-R 各 0.8 μ M, Fermentas DreamTaq 1.25 U。PCR 反应程序为 94°C预变性 5 min ；94°C 40s, 60°C 90 s，每个循环降低 0.5°C，72°C 40 s，20 个循环；94°C 40s, 55°C 60 s’72°C 40 s，30个循环，72°C延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收约500bp的片段，即为葡萄球菌核酸酶A基因(以下表述中也称为SNA基因)(见序列表中序列2)的PCR产物。1.3突变裂解基因E和SNA基因的串联扩增
以突变裂解基因E和SNA基因的胶回收PCR产物作为下一步PCR反应的模板，引物mE_F和SNA-R来扩增突变裂解基因E和SNA的串联基因(mE-L_SNA)。PCR反应体系为50 μ L中，含 IOXDreamTaq Buffer (Mg2+ Plus) 5 μ L, dNTP Mixture 200 μΜ,胶回收的突变裂解基因 E 和 SNA 基因各 I U L，引物 mE-F 和 SNA-R 各 0.8 u M, Fermentas DreamTaq 1.25U。PCR反应程序为94°C预变性5 min ；94°C 45s, 60°C 90 s，每个循环降低0.5°C，72°C 508，20个循环；941: 45s, 55°C 60 s，72°C 50 s，30 个循环，72°C延伸 10 min。PCR产物经 1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收约783 bp的片段，即为高效裂解串联基因mE-L-SNA基因(见序列表中序列3)的PCR产物。1.4安全高效的裂解质粒的构建
用&oR I和Sal I限制性内切酶双酶切mE-L-SNA基因的PCR产物和质粒pBV220，切胶回收mE-L-SNA基因片段和线性化pBV220，然后将二者在16°C过夜连接，转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，30°C过夜培养16 h。挑取单菌落于含100 u g/mL氨苄青霉素的LB培养基中30°C过夜振荡培养，提取质粒，进行I和I双酶切鉴定。鉴定为阳性的质粒pBV-mELS进行测序鉴定。安全高效的裂解质粒pBV-mELS的物理图谱见图1。实施例2、安全的大肠杆菌DH5 a菌蜕的制备
2.1高效裂解串联基因mE-L-SNA的诱导表达
将经过高效裂解质粒转化的大肠杆菌DH5 a (pBV-mELS)单克隆接种于5 mL含100U g/mL氨苄青霉素的LB培养基，30°C振荡培养过夜，然后按1%的量转接于50 mL含100U g/mL氨苄青霉素的LB培养基中，30°C振荡培养至OD6tltl值达到1.0-1.2时，将细菌培养物快速转换到42°C以诱导串联基因mE-L-SNA的表达。为了使SNA的活性达到最大，在升温诱导90 min时添加终浓度为10 mM的CaCl2和I mM的MgCl2。诱导前后间隔一定时间取样，测定菌液的OD6tltl值和活菌数，以此来监控细菌的生长和裂解。诱导结束后形成的菌蜕用PBS洗涤后，冻干保存备用。大肠杆菌DH5a (pBV_mELS)的裂解动力学曲线见图2。诱导开始后，菌液的OD600值快速降低，菌液的活菌数也快速减少，至诱导4 h时，均降至最低，裂解效率达到99.99995%。2.2裂解过程中遗传物质的定量分析和电泳分析
大肠杆菌DH5a (pBV-mELS)诱导裂解过程中，在不同时间点取样2 mL，离心(10000rpm，4°C，10 min)收集菌体，分别用来提取细菌的基因组DNA和质粒DNA，收集每个样品的上清液500 UL用来提取DNA。应用NanoDrop 2000分光光度计测量DNA的浓度。基因组DNA应用0.7%的琼脂糖凝胶进行电泳，质粒DNA和菌液上清中的DNA应用1%的琼脂糖凝胶进行电泳。DNA的定量分析结果显示在诱导裂解过程中，菌体内的基因组DNA的含量在诱导后2 h内快速下降，随后呈持续降低的趋势，菌体内的质粒DNA含量在加入CaCl2和MgCl2之后也呈现降低的趋势，而培养物上清中的DNA含量快速增加，至诱导2 h时达到最大，随后逐渐降低(见图3)。DNA的电泳结果显示至诱导4 h时菌体和上清中均检不出高分子量的DNA片段和质粒DNA，表明菌体内的基因组DNA和质粒DNA均被SNA降解，然后排出细胞外(见图4)。2.3大肠杆菌DH5a (pBV-mELS) 菌蜕的扫描电镜观察
取大肠杆菌DH5 a (pBV-mELS)菌蜕PBS洗涤3次，用2.5%戊二醛4°C固定2 h，PBS冲洗后再用1%锇酸4°C后固定1.5 h，双蒸水冲洗后，乙醇逐级脱水，醋酸异戊酯置换，干燥后镀钼，扫描电镜下观察并拍照(见图5)。照片显示，大肠杆菌DH5ci (pBV-mELS)菌蜕除裂解孔道外，菌蜕的细胞形态和表面结构未见明显改变，裂解孔道的直径大约为200-400 nm。本发明得到的高效裂解质粒pBV-mELS也适用于肠杆菌科的其他菌类菌蜕的制备。实施例3、质粒pBV-mELS和pBV_mE的裂解活性比较 3.1裂解质粒pBV-mE的构建
应用引物 mE-F 和 mE-R ’( 5 ’ - CTGTCGACTCACTCCTTCCGCACGTA -3 ’)( 5 ’ 端引入 I限制性酶切位点)，以PhiX174 RFI DNA为模板通过PCR扩增突变裂解基因E，将其应用I和5 / I限制性内切酶双酶切后插入质粒PBV220，然后转化大肠杆菌DH5a感受态细胞。通过酶切鉴定的阳性克隆，然后进行测序鉴定。序列正确的质粒即为pBV-mE质粒。
3.2质粒pBV-mELS和pBV-mE的裂解动力学比较
大肠杆菌DH5a (pBV-mE)的诱导裂解的方法与大肠杆菌DH5 a (pBV_mELS)基本相同，唯一不同之处是大肠杆菌DH5 a (pBV-mE)在诱导裂解过程中不需要添加CaCl2和1%(:12。诱导裂解过程中，两者培养物的OD6tltl值的变化规律相似，但其活菌数的变化规律显著不同。诱导裂解4 h时，大肠杆菌DH5a (pBV-mELS)培养物的活菌数要比大肠杆菌DH5 a (pBV-mE)低约2个数量级，见图2和图6。3.3遗传物质含量的比较
大肠杆菌DH5a (pBV-mE)在裂解过程中，菌体内的基因组DNA含量在诱导2 h内呈降低趋势，然后维持在一定的水平；菌体内的质粒DNA含量在裂解过程中一直维持在一定的水平(图7)。电泳结果显示，诱导4 h时菌体中仍然可检出高分子量的DNA片段和质粒DNA(图8)。由此可见,应用裂解质粒pBV-mE制备的菌脱制剂存在着遗传物质侧向传播的风险。<110>山东省农业科学院畜牧兽医研究所
〈120〉高效裂解串联基因，高效裂解质粒及构建方法和应用
权利要求
1.一种闻效裂解串联基因，其特征是基因序列如序列表中序列3所7]^。
2.根据权利要求1所述的高效裂解串联基因，其特征是由噬菌体PhiX174突变裂解基因mE和葡萄球菌核酸酶A基因SNA串联组成的。
3.含有上述权利要求1或2所述的高效裂解串联基因的高效裂解质粒。
4.根据权利要求3所述的高效裂解质粒，其特征是将权利要求1或2所述的高效裂解串联基因酶切插入PBV220载体中。
5.一种权利要求3或4所述的高效裂解质粒的构建方法，其特征是包括以下步骤: (1)以噬菌体PhiX174RFI DNA为模板、以序列表中的序列4和序列5为引物进行PCR扩增，获得突变裂解基因E ； (2)以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板、序列表中序列6和序列7为引物进行PCR扩增，获得葡萄球菌核酸酶A基因； (3)将步骤(I)中得到的突变裂解基因E和步骤(2)中得到的葡萄球菌核酸酶A基因作为下一步PCR反应的模板，用序列表中的序列4和序列7进行扩增，得到串联基因； (4)将串联基因应用I和I限制性内切酶进行双酶切，酶切产物与经I和Sal\双酶切的pBV220载体连接，得到高效裂解质粒。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征是将步骤(4)得到的高效裂解质粒转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，30°C过夜培养16 h，挑取单菌落于氨苄青霉素抗性的LB培养基中30°C过夜振荡培养，提取质粒，保留鉴定为阳性的质粒。
7.—种权利要 求3或4所述的高效裂解质粒在制备菌蜕中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述菌蜕为肠杆菌科的菌蜕。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征是包括以下步骤: (1)将含有所述高效裂解质粒的大肠杆菌DH5a在30°C培养至OD6tltl值达到1.0-1.2 ； (2)培养温度升高至42°C诱导高效裂解串联基因的表达； (3)在升温诱导90min时添加终浓度为IOmM的CaCl2和ImM的MgCl2，来激活SNA的活性； (4)升温诱导4h时，收集步骤(3)获得的菌蜕，洗涤后保存。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种由噬菌体PhiX174突变裂解基因mE和葡萄球菌核酸酶A基因SNA组成的高效裂解串联基因，基因序列如序列表中序列3所示。含有上述高效裂解串联基因的高效裂解质粒。高效裂解质粒在制备菌蜕中的应用。本发明构建的安全高效的裂解质粒pBV-mELS能够在大肠杆菌菌液OD600值达到1.0以上时进行诱导，裂解效率可到达99.99995%，不仅突破了裂解基因E介导的裂解过程依赖宿主细菌生长状态(OD600为0.4～0.6)的局限性，大大提高了菌蜕的产量，还能够有效清除菌蜕中残存的遗产物质，降低了危害性遗传元件(抗生素抗性基因和病原决定簇基因)的侧向传播。
文档编号C12N15/66GK103146732SQ20131003071
公开日2013年6月12日 申请日期2013年1月28日 优先权日2013年1月28日
发明者王金宝, 张玉玉, 吴家强, 王可, 杜以军, 李俊, 于江, 彭军 申请人:山东省农业科学院畜牧兽医研究所