专利名称：一种基于连接酶反应的多特异位点dna甲基化电化学检测方法
技术领域：
本发明涉及一种DNA甲基化测定分析方法，具体涉及一种基于连接酶反应的多特异位点DNA甲基化电化学检测方法。
背景技术：
DNA甲基化是一种广泛存在于高等生物的重要基因表观遗传修饰方式，也是外遗传体系的一种重要表达调控机制。DNA甲基化主要发生在5’-CpG-3’的C，生成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。大量研究表明，DNA甲基化是在不改变基因碱基序列的情况下，通过改变CpG岛的甲基化程度，在转录水平上实现调控基因表达，消除潜在危险DNA序列，调节发育过程和各种生理反应等功能。相反，DNA低甲基化和CpG岛高甲基化等异常的基因组甲基化，不仅会导致DNA复制延迟、染色体压缩、转录抑制等，而且会影响疾病的易感性、发生发展、预后和转归等。近年发现，基因组DNA异常甲基化与多种疾病尤其是年龄相关的慢性疾病的发生密切相关。由于DNA甲基化在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，建立准确度高、操作简单的DNA甲基化检测方法，对疾病的早期诊治和社区干预等具有十分重要的理论意义和实用价值。
DNA甲基化的检测研究可分为三个层次:(1)基因组整体甲基化水平检测，(2)特异位点甲基化水平检测，(3)新甲基化位点的寻找。常规的DNA甲基化的检测方法主要依赖甲基化敏感性内切酶在各自识别位点对5-mC和C不同的敏感性进行区分，或重亚硫酸盐对甲基化和非甲基化胞嘧啶的化学活性不同使DNA包含的甲基化信息转变为序列的差异信息。方法主要包括甲基化结合蛋白柱层层析，MSssI甲基转移酶分析和氯乙醛反应法，甲基化特异性PCR (MSP),甲基化敏感性单链构象分析，重亚硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法(COBRA),甲基化敏感性斑点分析，甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳，甲基化敏感单核苷酸引物延伸法(MS-SNuPE)，PCR荧光变性曲线分析，变性高效液相色谱法(DHPLC)，甲基化荧光检测(MethyLight)，甲基化特异性多连接依赖性探针扩增(MS-MLPA)，DNA甲基化微阵列芯片技术等。虽然甲基化检测方法得到很大发展，但各种方法存在着明显的限制性。重亚硫酸盐法要求大量的克隆测序，过程繁琐、昂贵，同时处理不完全时容易导致假阳性；甲基化敏感性单核苷酸引物衍生技术则存在着实验步骤略复杂，若要检测多个位点时，需要设计多个引物和存在放射性污染及重亚硫酸盐处理不完全的问题；甲基化敏感性链解曲线分析技术等则存在着灵敏度太低的缺点；依赖基因测序或多步的PCR扩增使分析步骤复杂，检测需时长，测定成本高；使用限制性内切酶只能获得特殊酶切位点的甲基化水平，不能确定样品DNA中其它位点的甲基化情况。因此，需要寻找更加简单、快速的方法。电化学方法具有快速，灵敏，不受溶液浊度影响，且仪器简单、操作方便，使用成本低，无需复杂的前处理过程，易于微型化和实现现场检测等特点，在DNA甲基化检测方面具有独特优势。近年来，DNA甲基化的电化学检测方法取得了一定的突破，但从文献报道来看，DNA甲基化的电化学检测主要集中在DNA整体甲基化水平的检测，对特异位点的甲基化水平检测和新位点寻找的电化学方法鲜有报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于连接酶反应的多特异位点DNA甲基化电化学检测方法。本发明所采取的技术方案是:
一种多特异性位点DNA甲基化检测方法，包括如下步骤:
(1)根据目标DNA序列上的每个特异性甲基化位点的侧翼序列设计一组核酸探针，每组核酸探针由一条分离探针和一条信号探针组成，分离探针用固相载体修饰，信号探针用量子点修饰，检测不同甲基化位点所使用的信号探针上修饰的量子点不同；
(2)目标DNA样品用重亚硫酸盐处理，使未被甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶；
(3)将分离探针和信号探针加入步骤(2)处理后的目标DNA溶液中进行杂交；
(4)收集固相载体，清洗后加入DNA连接酶反应液进行连接反应，反应结束后进行解链反应，解链结束后，趁热将固相载体与反应液分离；
(5)收集固相载体，清洗后利用溶出伏安法测定固相载体上连接的量子点的电化学信
号;
(6)根据电化学信号的归属和强度确定甲基化的位点和甲基化程度。所述分离探针的长度为35 45 bp,信号探针的长度为10 15 bp,以保证杂交的选择性。所述固相载体为磁性微球、聚四氟乙烯微球、金片、或表面修饰有羧基或氨基的微米材料。分离探针的制备方法如下:固相载体分别用100 mM咪唑缓冲溶液和EDC/NHS溶液处理后，加入核酸分子，35 45°C下振荡反应I 3小时,分尚，分别用2XSSC缓冲溶液(0.5% SDS)和65°C高纯水清洗，得到分离探针。信号探针的制备方法如下:量子点水溶液与核酸分子混合，在N2保护下搅拌16 24 小时，逐滴加入 PBS (pH 7.4,0.24 M NaCl, 0.1% NaN3)后在 PBS (pH 7.4,0.2 M NaCl)中透析36 48小时，离心收集制备的信号探针。步骤(3)所述杂交的条件为:35 45°C下杂交I 3小时。步骤(4)所述连接酶反应液的组成为:30 mM Tris-HCl,4 mM MgCl2,10 mM(NH4)2SO4j0.005% BSA, 0.2 mM NAD 和 0.5 U/L Ecoli DNA 连接酶。连接反应的条件为:35 40°C下反应I 2小时。解链的条件为:85 95°C下解链5 15分钟。步骤(5)测定溶出伏安曲线的条件为:玻碳电极在300 500 ii g/L铋溶液中，一
0.9 一 1.1 V沉积10分钟。本发明方法的原理如 下:
如图1所示，根据目标DNA链上的甲基化位点A的侧翼序列设计一组核酸探针(Pl和P2)甲基化位点B的侧翼序列设计一组核酸探针(P3和P4)，Pl和P4分别标记CdS和PbS量子点作为信号探针(PbS-Pl，CdS-P4)，探针P2和P3 —起固定在固相载体(磁珠)上作为分离载体(MB-P2P3)。
如图2所示，含目标DNA链的待测样品溶液首先经重亚硫酸盐处理，目标DNA链中没有发生甲基化的C脱氨基转化为U，而5-mC保持不变。该待测溶液与MB-P2P3杂交并磁性分离，目标DNA链被选择性杂交到固相载体(MB)表面，与溶液中共存的DNA片段分离。进一步将该MB与PbS-Pl和CdS-P4杂交，量子点PbS和CdS被连接到MB表面。加入疋col1.DNA连接酶，该DNA连接酶在间隙位置(图1中箭头所指位置)发生作用，识别错配位点。当目标链上位点发生甲基化时，对应的相邻两条探针链与目标链完全互补，连接酶将该两条探针链连接成一条新的核酸链。反之，当位点没有发生甲基化时，对应的相邻两条探针链与目标链形成单碱基错配，连接酶不能发生作用。所得磁珠于缓冲溶液中加热解链，磁性分离，甲基化位点上的标记量子点通过DNA链与磁珠相连,而非甲基化位点上的标记量子点则被解链分离。向解链后的磁珠中加入I M硝酸，利用溶出伏安法测定磁珠上连接的量子点的电化学信号。根据电信号的归属和强度确定甲基化的位点和甲基化程度。本发明的有益效果是:
该方法利用特异性免疫反应和标记抗体的酶在二氧化钛溶胶凝胶膜上表现的直接电化学响应，发展了新颖的无试剂免疫分析方法并制备了免疫传感器。利用二氧化钛溶胶凝胶气相沉积法固定抗原分子，并利用竞争免疫分析方法，通过直接测定反应到免疫传感器表面上标记抗体的酶的直接电化学响应信号的降低直接得到待测抗原的浓度。该方法较现有的免疫分析方法，具有以下优点:
(1)溶出伏安法具有富集和溶出过程，灵敏度高，是一种很好的检测痕量金属离子浓度的电化学方法；
(2)秘膜电极代替传统的萊电极,秘金属本身毒性较小，环境友好，而且具有与萊电极相媲美的电化学性能，如电势窗口大，灵敏度高，检测限低等；
(3)无需进行繁琐的基因测序步骤，简化了分析体系，降低测定成本；
(4)无需PCR扩增步骤，简化了分析的操作步骤，缩短了分析时间，适用于临床上在线快速检测；`
(5)无需使用限制性内切酶，对特异位点的甲基化研究具有普适性，缩短了分析时间，避免了限制性内切酶的缺点；
(6)根据电化学信号的峰电位和峰电流，实现多特异甲基化位点的同时测定，
(7)该方法表现出很好的精确性，重复性和稳定性，可发展成为试剂盒并向市场推广。
图1为核酸探针与目标DNA的互补配对关系 图2为基于连接酶反应的多特异位点DNA甲基化电化学检测方法原理 图3为实施例1核酸探针与目标DNA的互补配对关系 图4为杂交温度和杂交时间对甲基化电化学测定的影响(A.杂交温度，B.杂交时间)；图5为解链温度和解链时间对甲基化电化学测定的影响(A.解链温度，B.解链时间)；图6为沉积电位、沉积时间、溶液中铋离子浓度和电极预处理时间对甲基化电化学测定的影响(A.沉积电位，B.沉积时间，C.溶液中铋离子浓度，D.电极预处理时间)；
图7为实施例1目标DNA链不同甲基化位点的标准曲线。
具体实施例方式下面以p53肿瘤抑制基因片段的甲基化检测为例，对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。一、制备核酸探针
1、目标基因片段的处理
用重亚硫酸盐处理P53肿瘤抑制基因片段，步骤如下:
根据重亚硫酸盐转化试剂盒说明，适量重亚硫酸盐混合物用800 UL去核糖核酸酶的水在60 °C溶解完全。在200 uL PCR管中加入15 u L DNA样品溶液(I ng - 2 u g),5UL去核糖核酸酶的水，85 UL重亚硫酸盐混合物溶液，35 uL DNA保护缓冲溶液。盖上PCR管盖子，充分混合重亚硫酸盐反应液，室温下保存。在PCR仪中95°C变性5 min,60 V温育25 min，继续在95 °C变性5 min,60 °C温育85 min，再在95 °C变性5 min，在60 V温育175 min，在20 °C保存过夜。处理前的基因片段为:
5’ -CC CAC CAT GAG CGC TGC TCA GAT AGC GAT GGT CTG GCC CCT CCT CAG CAT CTTATCCGA GTG GAA ACA-3’ (SEQ ID NO:1)。处理后的基因片段为:
5’ -UU UAU UAT GAG CGU TCU TUA GAT AGU GAT GGT UTG GUU UUT UUT UAG UAT UTTATU CGA GTG GAA AUA-3’ (SEQ ID NO:2)。2、设计核酸探针
根据目标基因经重亚硫酸盐修饰后的碱基序列(SEQ ID N0:2)，以甲基化位点为分界线设计相应核酸探针(见图3)。核酸探针I (Pl)与第一甲基化位点5’端序列(5’ -UU UAU UAT GAG C-3’)互补；核酸探针2 (P2)与第一甲基化位点3’端到目标基因序列中点的序列(5’-GU TCU TUA GATAGU GAT GGT UTG-3’)互补；核酸探针3 (P3)与目标基因序列中点到第二甲基化位点的序列(5，-GUU UUT UUT UAG UAT UTT ATU C-3’)互补；核酸探针4 (P4)是第二甲基化位点3’端到目标基因3’端序列(5’ -GA GTG GAA AUA-3’)互补。其中，P2和P3在设计时，除了与待测DNA序列互补外，P2的5’端和P3的3’端有6-8 bp序列互补，形成树杈结构的颈部，中间有6-8 bp惰性序列形成三角区减少杂交的张力。同时，考虑DNA连接酶反应，Pl和P4的5’端磷酸基修饰，P2和P3的3’端羟基修饰。四条核酸探针序列如下:
Pl 5，-P-GCTCATGGTGGG-C6-SH-3，(SEQ ID NO: 3)
P2 5’ -NH2-C6-ACA CAC CAT GCA TGA CAA CAA CAA CAA CAC GCT ATC TGA GCAGC-0H-3’ (SEQ ID NO:4)
P3 5’-P-GAT MG ATG CTG AGG ACA ACA CAC ACA ACA CAT GCA TGA CAC AC-C6-NH2_3’(SEQ ID N0:5)
P4 5’ -SH-C6-TGTTTCCACTCG-0H-3’ (SEQ ID NO:6) 3、量子点标记信号探针Pl和P4
Pl用量子点PbS修饰，步骤为:1 mg/ml的量子点(PbS)水溶液与8 OD/ml核酸探针Pl混合，在N2保护下搅拌24小时。逐滴加入PBS(pH 7.4,0.24 M NaCl,0.1% NaN3)后在PBS(pH 7.4,0.2 M NaCl)中透析48小时。离心收集制备的PbS-Pl，加入PBS (pH 7.4,0.24 MNaCl,0.1% NaN3)后置于4°C下待用。P4用量子点CdS修饰，制备步骤相同。4、核酸探针P2和P3共同修饰磁性微球
10 UL磁性微球溶液用100 mM咪唑缓冲溶液(pH 7.0)清洗两次，加入100微升EDC/NHS溶液反应30分钟后，加入50 UL 10 uM P3和P4溶液，50°C下振荡反应3小时。磁分离后，用2 X SSC缓冲溶液(0.5% SDS)清洗3次，65°C高纯水清洗两次，溶解于PBS (pH
7.4,0.24 M NaCl,0.1% NaN3)溶液中，置于 4°C下待用。所述EDC/NHS溶液是由I g/L EDC和I g/L NHS按1:1 (v/v)混合得到。二、测定条件优化
1、杂交温度和杂交时间
在DNA杂交过程中，杂交温度低于DNA的熔链温度(Tm) 1(T15 ° C时，互补链可形成稳定的双链，错配对减少；若杂交温度低于Tm 30 ° C，互补链之间配对减少，错配对增多，氢键结合减弱。一般最适温度理论计算公式为T = Tm - 25 ° C。在DNA杂交过程中，杂交温度影响杂交效果。杂交时间过短导致互补链中错配情况增加，探针链不能很好 的捕捉目标链，使信号出现假阳性；而杂交时间过长则影响实验的效率及检测方法的实时性。在本实施例中，以完全甲基化的p53肿瘤抑制基因片段为研究对象，分别改变杂交温度和杂交时间，选择最大电流响应时的相应值作为最佳杂交条件。如图4A所示。在杂交温度分别为10，25，38和55 ° C条件下分别测定完全甲基化的目标P53基因片段。当杂交温度为10 ° C时，由于温度过低，互补碱基配对减少，错配对增多，氢键的结合力弱，因此检测信号较小，不适宜DNA的杂交。随杂交温度提高，检测信号明显增大，38° C达到最大值。继续升高杂交温度到55 ° C，会导致融链，杂交效率降低，信号下降。因此，选择38 ° C作为实验最终杂交温度。图4B优化了在38° C下的杂交时间。当杂交时间为I小时，检测信号较小。延长杂交时间从2到6小时，检测信号增大并基本达到稳定，表明2 h后杂交情况趋于稳定。因此选择2 h为优化后的杂交时间。2、解链温度和解链时间
解链时间影响解链效果。解链时间过短，解链不完全，导致假阳性结果；解链时间过长，使DNA和磁性微球长期处于高温环境中，导致DNA链断裂成单个碱基，或者磁性微球变性磁性降低，损失一部分信号。图5A以完全非甲基化的目标p53基因片段为对象，研究了解链温度对测定的影响。由图可知70 ° C时检测到的峰信号最大，可以认为是70 ° C时温度不够导致解链不完全，会使检测出现假阳性结果，。当解链温度从70° C升高到90 ° C，测定信号迅速降低。温度高于90 ° C后，测定信号趋于稳定值，因此选择90 ° C为解链温度。图5B为在90° C解链温度下不同解链时间对测定的影响。随解链时间从5 min延长到25 min，测定信号迅速下降，并趋于稳定值，认为解链完全。因此，选择20 min为优化后的解链时间。
3、溶出伏安法条件选择
图6A为以完全甲基化的目标p53基因片段为对象，研究不同沉积电位对测定的影响。当沉积电位从-0.85 V向负方向改变时，测定信号迅速增加，并在沉积电位负于-1.0 V后趋于极限值。因此，选择优化的电沉积电位为-1.0 V。图6B为在-1.0 V沉积电位下不同沉积时间对测定信号的影响情况。随沉积时间从50 s延长到450 S，峰电流与沉积时间呈线性关系。450 s以后，Pb离子的信号略有下降，而Cd离子的信号继续增加，到600 s达到稳定值。因此，选择600 s为最佳的沉积时间。图6C研究了溶液中铋离子浓度对溶出伏安响应的影响。当铋离子浓度为0 200吒L—1时，Cd峰电流显著增加，200 600 I^g L—1时出现平台期，大于600 I^g L—1时，峰电流呈下降的趋势。而对于Pb的峰电流，当铋离子浓度为0 200 I^g L—1时，峰电流显著增加，200 600 I^g L—1时增加趋势稍缓，大于600 I^g L—1时，峰电流呈下降的趋势。检测时需同时检测溶液中的Cd和Pb离子浓度，综合二者，选择400 I^g L—1作为最终溶液中铋离子的浓度。图6D为电极测定后清洗时间的优化。由于方波伏安法是一种比较快速的扫描方法，因此从负电位扫到正电位时，电极上仍然有残留的待测金属和金属铋，影响下一次的测定。因此，需要在电极上 加一个正电压清洗一段时间，使电极上的金属离子完全的溶出，尽量的还原电极表面。图6D为在+0.3 V电压下不同清洗时间重复测定五次得到的Cd和Pb离子的响应。当清洗时间为15 s时，多次测定重复性差。随着清洗时间的增长，测定的重复性提高，实验选择优化的清洗时间为75 S。三、不同甲基化位点的标准曲线获得
取10 L P2和P3核酸探针修饰的磁性微球与一系列标准浓度的甲基化目标链在38°C下杂交2小时，再分别加入10 uL PbS-Pl和CdS-P4溶液，室温下杂交I小时。收集磁性微球，用超纯水清洗2次，加入20 UL酶反应液(30 mM Tris-HCl,4 mM MgCl2,10 mM(NH4)2SO4j0.005% BSA, 0.2 mM NAD 和 0.5 U/L Ecoli DNA 连接酶)，38 °C下反应 I 小时。将反应液在90°C下解链10分钟，收集磁性微球，趁热将反应液抽出后，依次用I XPBS溶液(0.2% Tween 20)和超纯水清洗磁性微球，加入100 uL I M HNO3溶液，玻碳电极在400U g/L铋溶液中，一 1.1 V沉积10分钟，得到溶出伏安曲线。重复测定三次后，取平均值。图7A为只有甲基化位点A被甲基化的目标链浓度对Pb离子的响应校准曲线，溶液中随目标链浓度的增加，Pb离子的响应峰电流逐渐增加，响应峰电流值与目标链浓度的呈现良好的线性关系，线性方程是:/pa (PA) = -0.0505c (nmol I71) - 1.096 (n=3, R=0.9663)，线性范围和检出限依次是 10 nmol L-1 80 nmol I71 和 230 pmol I71 (S/N =3)。图7B是只有甲基化位点B被甲基化的目标链浓度对Cd离子的响应校准曲线。随溶液中目标链浓度的增加，Cd离子的响应峰电流增加，并呈现良好的线性关系。线性方程Upa (u A) = -0.0471c (nmol I71) - 0.7533 (n=3, R = 0.9637)，线性范围和检出限依次是 10 nmol L-1 80 nmol L-1 和 300 pmol L-1 (S/N = 3)。图7C为两个位点同时甲基化的目标链浓度与Pb和Cd离子的伏安响应关系，表现出与图7A和图7B相同的线性关系，说明可同时检测两个位点的甲基化情况。
四、P53肿瘤抑制基因片段特异位点甲基化的测定
(I)p53肿瘤抑制基因片段样品用重亚硫酸盐处理:
取试剂盒封装的重亚硫酸盐混合物用800 UL去核糖核酸酶的水在60 V溶解完全。在200 uL PCR管中加入15 uL DNA样品溶液(I ng - 2 u g),5 u L去核糖核酸酶的水，85 UL重亚硫酸盐混合物溶液，35 UL DNA保护缓冲溶液。盖上PCR盖子，充分混合重亚硫酸盐反应液，室温下保存。在PCR仪中95 V变性5 min, 60 °C温育25 min，继续在95°C变性5 min, 60 °C温育85 min，再在95 °C变性5 min，在60 °C温育175 min，在20 °〇保存过夜。(2)取10 UL P2和P3核酸探针修饰的磁性微球与p53肿瘤抑制基因片段样品在38°C下杂交2小时，再分别加入10 ii L PbS-Pl和CdS-P4溶液，室温下杂交I小时。(2)收集磁性微球，用超纯水清洗2次，加入20 ii L酶反应液(30 mM Tris-HCl，4mM MgCl2,10 mM (NH4)2SO4j0.005% BSA, 0.2 mM NAD 和 0.5 U/L Ecoli DNA 连接酶)，38 °C下反应I小时。将反应液在90°C下解链10分钟。(3)收集磁性微球，趁热将反应液抽出后，依次用IXPBS溶液(0.2% Tween 20)和超纯水清洗磁性微球，加入10 0 UL I M HNO3溶液，玻碳电极在400 U g/L铋溶液中，一 1.1V沉积10分钟，得到溶出伏安曲线。(4)利用标准曲线法，计算p53肿瘤抑制基因片段样品中特异位点甲基化的浓度。
权利要求
1.一种多特异性位点DNA甲基化检测方法，包括如下步骤: (1)根据目标DNA序列上的每个特异性甲基化位点的侧翼序列设计一组核酸探针，每组核酸探针由一条分离探针和一条信号探针组成，分离探针用固相载体修饰，信号探针用量子点修饰，检测不同甲基化位点所使用的信号探针上修饰的量子点不同； (2)目标DNA样品用重亚硫酸盐处理，使未被甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶； (3)将分离探针和信号探针加入步骤(2)处理后的目标DNA溶液中进行杂交； (4)收集固相载体，清洗后加入DNA连接酶反应液进行连接反应，反应结束后进行解链反应，解链结束后，趁热将固相载体与反应液分离； (5)收集固相载体，清洗后利用溶出伏安法测定固相载体上连接的量子点的电化学信号; (6)根据电化学信号的归属和强度确定甲基化的位点和甲基化程度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分离探针的长度为35 45bp,信号探针的长度为10 15 bp。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相载体为磁性微球、聚四氟乙烯微球、金片、或表面修饰有羧基或氨基的微米材料。
4.根据权利要求1 3任一项所述的方法，其特征在于，所述分离探针的制备方法如下:固相载体分别用100 mM咪唑缓冲溶液和EDC/NHS溶液处理后，加入核酸分子，35 45°C下振荡反应I 3小时，分离，分别用2X SSC缓冲溶液(0.5% SDS)和65°C高纯水清洗，得到分离探针。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述信号探针的制备方法如下:量子点水溶液与核酸分子混合，在N2保护下搅拌16 24小时，逐滴加入PBS (pH 7.4，0.24 MNaCl, 0.1% NaN3)后在PBS (pH 7.4,0.2 M NaCl)中透析36 48小时，离心收集制备的信号探针。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述杂交的条件为:35 45°C下杂交I 3小时。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述连接酶反应液的组成为:30mM Tris-HCl,4 mM MgCl2,10 mM (NH4)2SO4j0.005% BSA,0.2 mM NAD和0.5 U/L Ecoli DNA连接酶。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述连接反应的条件为:35 40°C下反应I 2小时。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述解链的条件为:85 95°C下解链5 15分钟。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)测定溶出伏安曲线的条件为:玻碳电极在300 500 u g/L铋溶液中，一 0.9 一 1.1 V沉积10分钟。
全文摘要
本发明公开了一种基于连接酶反应的多特异位点DNA甲基化电化学检测方法。该方法利用特异性免疫反应和标记抗体的酶在二氧化钛溶胶凝胶膜上表现的直接电化学响应，发展了新颖的无试剂免疫分析方法并制备了免疫传感器。利用二氧化钛溶胶凝胶气相沉积法固定抗原分子，并利用竞争免疫分析方法，通过直接测定反应到免疫传感器表面上标记抗体的酶的直接电化学响应信号的降低直接得到待测抗原的浓度。本方法无需进行繁琐的基因测序步骤，简化了分析体系，降低测定成本，具有很好的精确性，重复性和稳定性，可发展成为试剂盒并向市场推广。
文档编号C12Q1/68GK103114139SQ20131003100
公开日2013年5月22日 申请日期2013年1月25日 优先权日2013年1月25日
发明者戴宗, 邹小勇, 蔡婷 申请人:中山大学