专利名称：高水平人二倍体细胞培养水痘-带状疱疹疫苗病毒方法
技术领域：
本发明涉及一种高水平人二倍体细胞培养水痘-带状疱疹疫苗病毒方法。
背景技术：
现有水痘-带状疱疹病毒疫苗生产产量低，不能适用于规模化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以得到较高的减毒水痘-带状疱疹病毒疫苗产量，便于带状疱疹疫苗的大量制备，适用于规模化生产的高水平人二倍体细胞培养水痘-带状疱疹疫苗病毒方法。本发明的技术解决方案是:
一种高水平人二倍体细胞培养水痘-带状疱疹疫苗病毒方法，其特征是:包括下列步
骤:
(I)建立主体细胞库(MCB)，按照美国FDA标准(21CFR211和21CFR600)。取ATCC(CCL171)细胞株(来自美国权威的细胞保存机构ATCC，细胞株由美国FDA专门指定，交由美国ATCC管理)，起始为第17代，经过20天左右共3-5次传代培养，收获大约20亿多个细胞，每支冷冻管大约I千万细胞，93-96%成活率，约200支在液氮保存。(2)工作细胞库(W·CB)细胞培养，经过12-15天共3_5次传代培养，传代在GLP实验室中进行，按照准备临床实验材料(CTM)要求(21CFR58)进行和实验数据记录，液氮和深冻(-80°C )保存(即部分用液氮保存、部分深冻保存)。(3)为保证疫苗病毒的高滴度，同时进行二倍体细胞群体倍增水平(PDL)同步监测，疫苗生产选用二倍体细胞群体倍增水平(PDL) 2.5以上的细胞株，正常二倍体细胞I3DL值为2.0左右。约20%细胞株符合达到倍增水平(PDL) 2.5以上要求(图1)。上述步骤中的传代培养采用下列二倍体细胞培养液:采用MEM细胞培养基，加有相当于二倍体细胞培养液体积8-15%的小牛血清，每升二倍体细胞培养液中含有1-5 mM的L-谷氨酰胺，每毫升二倍体细胞培养液中含100-200单位青霉素、50-100微克链霉素及20-40纳克两性霉素，二倍体细胞培养液中含有12种非必需氨基酸。12种非必需氨基酸采用GIBCO BRL生产的100倍浓缩液，且在每升二倍体细胞培养液中的加入量为10ml。本发明可以得到较高的减毒水痘-带状疱疹病毒疫苗产量，该方法便于带状疱疹疫苗的大量制备，适用于规模化生产。本方法也可以用作其它活体疫苗，如:甲肝疫苗、狂犬病疫苗、麻疹、天花等工业化生产。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。图1是工作细胞库二倍体细胞群体倍增水平测定示意图；其中X轴:工作细胞(WCB)编号(1-50)，Y轴:细胞群体倍增水平(DPL)；
图2是二倍体细胞群体倍增水平不同的工作细胞所收获的疫苗病毒的滴度比较示意图；其中X轴:工作细胞名(LD1-2，MD1-2，HD1-2)，Y轴:疫苗病毒的滴度(噬菌斑/毫升)，黑斜线为疫苗病毒的滴度的增长趋势直线。
具体实施例方式一种高水平PDL人二倍体细胞培养水痘-带状疱疹疫苗病毒方法，包括下列步骤:
(I)建立主体细胞库(MCB)，按照美国FDA标准(21CFR211和21CFR600):取ATCC(CCL171)细胞株(来自美国权威的细胞保存机构ATCC，细胞株由美国FDA专门指定，交由美国ATCC管理)，起始为第17代，经过20天左右共3-5次传代培养，收获大约20亿多个细胞，每支冷冻管大约I千万细胞，93-96%成活率，约200支在液氮保存。(2)工作细胞库(WCB)细胞培养，经过12-15天共3_5次传代培养，传代在GLP实验室中进行，按照准备临床实验材料(CTM)要求(21CFR58)进行和实验数据记录，液氮和深冻(-80°C )保存(即部分用液氮保存、部分深冻保存)。(3)为保证疫苗病毒的高滴度，同时进行二倍体细胞群体倍增水平(PDL)同步监测，疫苗生产选用二倍体细胞群体倍增水平(PDL) 2.5以上的细胞株，正常二倍体细胞I3DL值为2.0左右。约20%细胞株符合达到倍增水平(PDL) 2.5以上要求(图1)。上述步骤中的传代培养采用下列二倍体细胞培养液:采用MEM细胞培养基，加有相当于二倍体细胞培养液体积8-15%的小牛血清，每升二倍体细胞培养液中含有1-5 mM的L-谷氨酰胺，每毫升二倍体细胞培养液中含100-200单位青霉素、50-100微克链霉素及20-40纳克两性霉素，二倍体细胞培养液中含有12种非必需氨基酸。
12种非必需氨基酸采用GIBCO BRL生产的100倍浓缩液，且在每升二倍体细胞培养液中的加入量为10ml。12种非必需氨基酸的用量(体积)相等或不等。二倍体细胞群体倍增水平不同的工作细胞LD1，LD2 (PDL值为1.7-2.0)，MD1，MD2(PDL值为2.1-2.4)，HDl，HD2 (PDL值为2.5-2.7)用来培养VZV疫苗病毒，收获的疫苗病毒的滴度高低与PDL值成正比(图2)。
权利要求
1.一种高水平人二倍体细胞培养水痘-带状疱疹疫苗病毒方法，其特征是:包括下列步骤: (1)建立主体细胞库:按照美国FDA标准，取ATCC(CCL171)细胞株，起始为第17代，经过20天左右共3-5次传代培养，收获的细胞用冷冻管在液氮保存； (2)工作细胞库细胞培养:将步骤(I)得到的细胞再经过12-15天共3-5次传代培养，按照准备临床实验材料要求进行和实验数据记录，液氮和深冻保存； (3)为保证疫苗病毒的高滴度，同时进行二倍体细胞群体倍增水平同步监测，选用二倍体细胞群体倍增水平2.5以上的细胞株生产疫苗； 上述步骤中的传代培养采用下列二倍体细胞培养液:采用MEM细胞培养基，加有相当于二倍体细胞培养液体积8-15%的小牛血清，每升二倍体细胞培养液中含有1-5 mM的L-谷氨酰胺，每毫升二倍体细胞培养液中含100-200单位青霉素、50-100微克链霉素及20-40纳克两性霉素，二倍体细胞培养液中含有12种非必需氨基酸。
2.根据权利要求1所述的高水平人二倍体细胞培养水痘-带状疱疹疫苗病毒方法，其特征是:12种非必需氨基酸采用GIBCO BRL生产的100倍浓缩液，且在每升二倍体细胞培养液中的加入量为10ml。
全文摘要
本发明公开了一种高水平人二倍体细胞培养水痘-带状疱疹疫苗病毒方法，包括建立主体细胞库按照美国FDA标准，取ATCC(CCL171)细胞株，起始为第17代，经过20天左右共3-5次传代培养，收获的细胞用冷冻管在液氮保存；工作细胞库细胞培养；进行二倍体细胞群体倍增水平同步监测，选用二倍体细胞群体倍增水平2.5以上的细胞株生产疫苗；本发明可以得到较高的减毒水痘-带状疱疹病毒疫苗产量，该方法便于带状疱疹疫苗的大量制备，适用于规模化生产。本方法也可以用作其它活体疫苗，如甲肝疫苗、狂犬病疫苗、麻疹、天花等工业化生产。
文档编号C12R1/93GK103074304SQ201310031329
公开日2013年5月1日 申请日期2013年1月28日 优先权日2013年1月28日
发明者莫呈钧 申请人:江苏健安生物科技有限公司