专利名称：一株高产丙三醇及微量副产物的突变株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株高产丙三醇的突变株及应用，特别是一株高产丙三醇及微量副产物的突变株及应用。
背景技术：
目前我国人均丙三醇耗用量远低于西方发达国家，而且我国丙三醇的消费构成与发达国家相差甚大，国内丙三醇的消费大户是涂料工业，占总消费量的49%，而美国还不到10%，涂料工业用量较高的日本，也不到20%。然而成明显反差的是，美国在药品和食品方面丙三醇用量占54%，而我国还不到10%。从发展角度来讲，我国丙三醇消费的构成是会向发达国家靠拢的，可以预测丙三醇的消费量和应用范围在我国将会增加。发酵生产丙三醇采用的是淀粉质原料，安全性好，绿色环保，因此其在药品和食品上使用的竞争优势是显而易见的。我国好氧发酵生产甘油的生产水平已经较高，但从目前研究情况看，生产水平的提高、成本的降低和质量的改进等诸方面的潜力仍是不小的。发酵法生产丙三醇的难点之一是发酵甘油的提取。高沸点、稠粘、易焦化有机物质蒸馏问题一直是国际上公认的难题，因此从发酵液中提取高沸点的丙三醇非常困难，常规水蒸汽蒸馏丙三醇损失率达50%，这就影响了生物技术生产丙三醇的应用。在发明专利ZL99111308.X中，本发明人研究确立的载体蒸馏技术将甘油蒸馏效率从50%提高到90%。但是，高产丙三醇假丝酵母在菌体生长和发酵过程中生物代谢极其复杂，目前已发现了 8种有机酸组分:乙酸、乳酸、丙酮酸、苹果酸、酮戊二酸、丙酸、戊酸、丁酸。因此，降低丙三醇发酵液中有机物质如有机酸含量将是继续提闻收率的主要关键因素，特别是有利于提闻丙二醇成品的质量、降低提取成本。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一株高产丙三醇及微量副产物的突变株及应用，发明人利用遗传育种技术，以亚硝基胍和紫外线为诱变因子，对产甘油假丝酵母(Candidaglycerinogenes)进行了复合诱变，成功提高了甘油合成关键酶胞衆3_磷酸甘油脱氢酶CtGPD酶活，在30%溶氧条件下CtGPD在36h和72h出现了峰值，分别为较原菌株的50mU/mg和45mU/mg提高到70mU/mg和71mU/mg Pr,分别提高了 40%和58%,进而加速了甘油的合成，并有效减少了菌株生长及发酵过程产生的有机酸量，取得了较好的效果。所述菌株于2012年11月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.6830，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种发酵生产丙三醇的方法。本发明采用的发酵条件:糖浓度为20-35%(w/v)、尿素含量为0.1-0.3%(w/v)、玉米浆含量为
0.1-0.4%(w/v)，调 节pH为3.0-5.0，接种量1_6%(ν/ν)，在30_100m3发酵罐中进行好氧发酵，溶氧保持25%-35%，发酵温度为29-33°C，发酵时间为70_120h。该突变株在上述发酵条件下产丙三醇浓度达11_18%，而发酵过程产杂质如乙酸、乳酸、丙酮酸、酮戊二酸、苹果酸等，分别从9.17g/L、13.74g/L、2.18g/L、3.96g/L和4.82g/L 下降至 3.54g/L、4.42g/L、l.65g/L、0.49g/L 和 1.lOg/L,分别下降为原浓度的 38.6%、32.1%、75.6%、12.3% 和 22.8%。采用本发明提供的菌株，发酵液经去菌体、浓缩和真空度为-0.1MPa -0.09MPa进行水蒸汽真空载体蒸馏后，加入原工艺2/3量的活性炭脱臭和脱色即获得成品一级丙三醇，其丙三醇含量为>95%。
具体实施方式
:实施例1以亚硝基胍和紫外线为诱变因子，对C.glycerinogenes进行了复合诱变，以甘油合成关键酶胞浆3-磷酸甘油脱氢酶CtGPD酶活性、丙三醇转化率及浓度和副产物浓度为筛选依据，从1200个突变株中获得I株高产丙三醇痕量副产物的突变株，2012年11月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心，编号CGMCC N0.6830。实施例2对发酵过程中C.glycerinogene突变株甘油合成关键酶胞衆3_磷酸甘油脱氢酶CtGPD酶活进行跟踪分析，测定方法如下:反应体系由20mmol/L咪唑-HCl buffer(pH7.0)、ImmoI/LDTTUmmoI/L MgC12、0.09mmol/L NADH 和 0.67mmol/L DHAP 组成。反应温度 30°C，以加入DHAP为O时，线性范围为2min。在340nm处测定30s和90s时的吸光度。一个单位酶活定义为在30°C温度下的上述反应体系内一分钟消耗I μ mol NADH所需的酶量。结果为在30%溶氧条件下CtGPD在36h和72h出现了峰值，较原菌株分别提高了 40%和58%。实施例3
利用HPLC技术分析发酵液中副产物，方法为:首先将发酵液离心除去酵母细胞，上清液用0.22 μ m混合纤维素酯微孔膜过滤即可用于HPLC检测。HPLC测定检测条件:Bio-Rad Aminex HPX-87H 色谱柱；柱温:60°C ;流动相:5mmol/L 硫酸；流速:0.6mL/min ;进样量:20 μ L ;检测器=Dionex示差检测器和210nm紫外检测器，所有样品先经0.22 μ m纤维素微孔滤膜过滤处理。0.1%的标准有机酸溶液采用超纯水配制，022 μ m微孔滤膜过滤后备用。标准品皆为优级和纯色谱级。结果为:发酵过程产杂质如乙酸、乳酸、丙酮酸、酮戊二酸、苹果酸等，分别从 9.17g/L、13.74g/L、2.18g/L、3.96g/L 和 4.82g/L 下降至 3.54g/L、
4.42g/L、l.65g/L、0.49g/L 和 1.10g/L，分别下降为原浓度的 38.6%,32.1%、75.6%、12.3%和22.8%。实施例4取玉米淀粉12000公斤，制成粉状乳浆，每克淀粉加入8-12单位的食品级α -淀粉酶，在85-95°C下液化10-25min，再加入120-150单位/克淀粉的α -1, 4葡萄糖苷酶于55-65°C糖化15-25h，过滤后制得糖浓度为20%_30%的糖液35_40m3。向糖液中加入100-150公斤有机氮源，调节pH为4-5。添加10%(V/V)分级培养的产甘油假丝酵母CGMCC N0.6830种子培养液，在50m3的发酵罐中进行好氧发酵，通风量为0.05-0.1:100，温度30_33°C，发酵80-120h。发酵液浓丙三醇度达11-18%发酵液离心除去菌体，离心液真空浓缩获得粗丙三醇，其丙三醇含量为75%-85%。将此粗丙三醇加入奥土载体，搅拌均匀。将该混合物吸入载体蒸馏器，在真空度为-0.1MPa -0.09MPa进行水蒸汽真空载体蒸馏。得到粗丙三醇，最后经脱臭和脱色(原工艺2/3量的活性炭处理)获得成品一级丙三醇，其丙三醇含量>95%。实施例5取玉米淀粉9000公斤，制成粉状乳浆，每克淀粉加入8-12单位的食品级α -淀粉酶，在85-95°C下液化10-25min，再加入120-150单位/克淀粉的α -1, 4葡萄糖苷酶于55-65°C糖化15-25h，过滤后制得糖浓度为25%_30%的糖液28_30m3。向糖液中加入80-120公斤有机氮源，调节pH为4-5。添加10%(V/V)分级培养的Candida glycerinogenes CGMCCN0.6830种子培养液，在40m3的发酵罐中进行好氧发酵，通风量为0.05-0.1:100，温度30-33°C，发酵80-120h。发酵液浓丙三醇度达11_18%发酵液离心除去菌体，离心液真空浓缩获得粗丙三醇，其丙三醇含量为75%-85%。将此粗丙三醇加入奥土载体，搅拌均匀。将该混合物吸入载体蒸馏器，在真空度为-0.1MPa -0.09MPa进行水蒸汽真空载体蒸馏。得到粗丙三醇，最后经脱臭和脱色(原工艺2/3量的活性炭处理)获得成品一级丙三醇，其丙三醇含量>95%。·
权利要求
1.一株高产丙三醇及微量副产物的突变株，于2012年11月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.6830。
2.权利要求1所述的突变株，其特征是通过诱变获得的产甘油假丝酵母(Candidaglycerinogenes)的变种。
3.应用权利I或2所述突变株发酵生产丙三醇的方法，其培养特征在于使用糖浓度20-35%(w/v)、尿素含量0.1-0.3%(w/v)、玉米浆含量0.1-0.4%(w/v)配制的发酵培养基，调节PH为3.0-5.0，接种量1-6%(v/v)，在30-100m3发酵罐中进行好氧发酵，溶氧保持25%-35%，发酵温度为29-33°C，发酵时间为70_120h。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述溶氧控制为30%。
5.如权利要求3所述 的方法，其特征在于所述pH为4.0-5.0。
全文摘要
本发明公开了一株高产丙三醇及微量副产物的突变株及其应用，于2012年11月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6830。将含20-30%的糖液，加入营养物质，采用优良的生产菌株在相应的发酵罐中进行好氧发酵，除菌体后，进行真空浓缩，以载体蒸馏法提取丙三醇，经精制后可获得浓度为95-98%的不同系列与浓度的丙三醇产品。本发明的一株高产丙三醇副产物痕量的突变株是在保持原生产菌株高产特性基础上，大大降低发酵过程中主要副产物——多种有机酸的产量，使发酵液产物更单一，有力提高产品的收率、简化提取过程。
文档编号C12P7/18GK103160443SQ201310034579
公开日2013年6月19日 申请日期2013年1月29日 优先权日2013年1月29日
发明者诸葛斌, 方慧英, 诸葛健, 宗红 申请人:江南大学