专利名称：一种产表面活性剂的烃降解菌的改良方法
技术领域：
本发明涉及一种产表面活性剂的烃降解菌的诱变改良方法，属于环境生物工程和环境微生物技术领域。
背景技术：
石油污染问题引起了人们越来越多的关注。石油污染环境的修复有物理、化学和生物修复等三种方法。微生物修复技术是生物修复中最重要、最核心的组成部分，具有成本低、应用方法简单、污染物氧化完全、无二次污染、可原位处理、不需大型设备等优点，日前引起重视，每年新发表公布的论文成果层出不穷。微生物修复的关键技术是选用高效的石油烃降解菌株。修复工作中应用的烃降解菌株的获得目前多局限于天然分离和筛选，主要在被石油污染的水环境和土壤环境中采样。由于野外环境复杂恶劣，用于烃污染修复的天然分离的菌株往往满足不了要求。因此筛选和改良烃降解菌就显得至关重要。其中方法之一是用基因工程的手段，对天然降解性质粒进行转移来构建新功能菌株，但此种方法需要较高的技术条件，同时工程菌的在环境中的释放和应用受到严格的限制；另一种方法是用物理的、化学的和生物的方法进行诱变，目前多用紫外线和Y射线进行诱变，效果有限。寻找更有效的诱变源，就成为解决问题的关键之一。各种电离和非电离辐射是较常用的诱变源，低能离子束是一种新型、高效的电离辐射诱变源，而紫外线则一种经典的非电离辐射诱变源。低能离子束诱变育种需要较昂贵的专用仪器设备，且维护费用较高，在一定程度上影响了其发展应用。紫外诱变操作简单，成本低廉，效果较好，因此应用广泛。以上两种物理诱变剂各有优缺点，应结合应用。但将二者结合应用的报道很少。
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平板筛选是诱变育种程序中最重要的一环，高效的平板初筛方法，对提高筛选效率、降低筛选劳动强度具有积极意义。但产表面活性剂的烃降解菌如何进行进行筛选，以获得表面活性剂发酵产量与烃降解效率的同步提高，没有权威报道，血平板和油平板制作技术要求高，成功率低，已有文献均报道不详。
发明内容
本发明提供一种产表面活性剂的烃降解菌的改良方法，具体步骤如下:(I)菌种活化:取保藏菌种的甘油管，加入含有50mL肉胨培养基的250mL摇瓶中，30°C振荡培养1-2天，直到培养出现明显的浑浊为止；(2)平板培养:取摇瓶培养物以10倍稀释法稀释成KT1-KT6,取适宜稀释倍数的菌液涂布于肉胨平板；(3)斜面培养:平板培养后检查菌落的一致性，确定为纯培养后，接种于肉胨斜面(采用15mL试管配制)，30°C条件下培养1_2天，至斜面找出菌苔为止；(4)制作菌悬液:取新培养的斜面，加入无菌生理盐水(0.86% )5mL，振荡1_5分钟，使菌苔中的菌体脱落成菌悬液；
(5)涂布菌悬液:在超净工作台中，取上述0.1mL菌悬液，添加于灭菌的90mm培养皿下盖中，用涂布棒涂匀；(6)制作菌膜:在超净工作台中，打开培养皿上盖，开无菌风吹5-10min，至培养皿下盖中无水珠为止，使之形成干燥的菌膜，吹风时间过短菌膜不干，易在下一步的离子束注入过程中不易形成真空环境，影响离子束诱变效果，吹风时间也不宜过长，容易造成自然对照和真空对照菌落过少，不易统计相对存活率；(7)离子束注入:吹干形成菌膜后，合上培养皿，立刻将培养皿置离子束注入机小靶室中，取出上盖，封闭小靶室，抽真空至一定真空度后，按事先设计好的离子种类、能量和剂量进行注入，一般选用15-20keV氮离子，设定自然对照和真空对照，菌膜形成后立刻进行下一步即为自然对照，将培养皿放入小靶室中但放于辐照的培养皿下面不开盖即为真空对照；(8)菌膜洗脱:所 有的培养皿盖上上盖，取出培养皿，用1.5mL生理盐水用移液枪和涂布棒配合使用分两次洗脱菌膜，转移至1.5mL无菌离心管中；(9)平板培养:上述菌悬液摇匀后，梯度稀释到IO6倍后视实际情况取适宜倍数涂布于肉胨平板上，肉胨培养基成份为(/L):蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，纯净水或自来水1L，调pH至7.0左右，配制平板时要加1.5%的琼脂粉，30°C倒置培养2天后统计菌落数，将各剂量处理均与真空对照相比，求得相对存活率，将真空对照与自然对照的相同稀释倍数的菌落数相比，即得真空对照的存活率；(10)血平板筛选:将各处理肉胨平板上的菌落随机挑取至90mm血平板上，每个平板点种6-7个菌落，30°C培养2天后测定各菌落的溶血圈直径，统计突变率，突变效率分为正突变率(溶血圈直径比出发菌株增加> 10% )和负突变率(溶血圈直径比出发菌株降低> 10% )，以存活率20-30%、正突变率较高而负突变率较低的剂量较为适宜，作为后续辐照的剂量，配制血平板的方法如下:肉胨培养基中加入1.5%的琼脂粉灭菌后取出冷却至50°C左右时，加入5-7%的脱纤维无菌羊血，迅速分配至培养皿中，每个培养皿中加入约15mL培养基，冷却后即得血平板，血平板不耐贮存，一般随用随配；根据以上存活率和突变率确定最优离子注入参数；(11)油平板评价和筛选:挑取溶血圈最大的菌落30个，肉胨培养基培养8-10小时后，用牙签钝头蘸取少量菌液，点种至油平板，每个油平板点种4-5个菌落，30°C倒置培养3天后测定各菌株噬油斑直径油平板配制方法如下:将原油溶于石油醚(浓度10%)中，滤纸剪成直径85mm，置90mm培养皿中，加2mL10%石油溶液，待石油醚挥发后，121°C蒸汽高压灭菌20min，取出60°C烘干备用，矿质盐培养基(MSM)中加入1.5%的琼脂粉，灭菌后倾倒平板，平板尚未凝固时将滤纸紧贴在平板上后即成油平板，MSM按以下方法配制:MgS04，
0.2g，KH2P04，1.0g ； (NH4)2SO4,1.0g ；CaCl2,0.02g ；K2HP04,1.0g ；FeCl3,0.05g ;蒸馏水 lL，pH值最后调整为7.0-7.2，选出噬油斑最大的突变株10株左右；(12)摇瓶复筛:初筛的菌株分别接肉胨培养基后，同时接产表活培养基和烃降解培养基，每个菌株设置3个独立重复，进行摇瓶复筛，具体操作步骤如下:产表面活性剂培养基成份为(g/L):NaN032.5，Κ2ΗΡ044.0, ΚΗ2Ρ044.0, CaCl2.2Η200.1，MgSO40.2，NaCll.0,KC11.0，酵母粉1.0，甘油30，pH值最后调整为6.5，加入3_5%的碳源(如废弃植物油)，灭菌后，加入I %的种子液，300C、ISOrpm转速条件下培养3d后测定发酵液稀释100倍后表面张力和发酵液排油圈大小，测定表面张力采用界/表面张力仪，排油圈测定大小的方法是:在90mm培养皿小盖中，加入15mL去离子水，滴加200mL0#柴油，形成油膜后，再在油膜中心用微量取样器加入IOuL的发酵液10倍去离子水稀释液，如果排油圈直径超过培养皿小盖的直径，则将发酵液稀释10倍后再加入；烃降解 培养基为上述(11)中的MSM加1%的原油，按5%的量接种后30°C、120rpm转速条件下摇床培养7d，观察原油乳化和降解情况，测定残余烃的量和发酵液离心后的上清液的表面张力，并分别记录，测定残余烃的量采用重量法，具体方法是:漏斗中加入脱脂棉过滤得滤液，测定表面张力采用表面张力仪进行，脱脂棉上与粘在摇瓶壁上的残余原油采用石油醚(30-60°C沸程)清洗回收到尖底烧瓶中，加热(60°C )条件下采用旋转蒸发仪蒸干石油醚，根据尖底烧瓶前后的质量差求得残余原油的质量，与称重之前的原油质量对t匕，并结合空白对照的质量变化，求得微生物对摇瓶中原油的降解率；根据产表面活性剂培养基的表面张力、排油圈、烃降解培养基滤油的表面张力、石油烃降解率进行综合评定，初步筛选出最优的菌株I株；如有必要，则重复上述步骤，进行多轮离子束诱变筛选；(13)制作菌悬液:取上述突变株接种肉胨培养基摇瓶，30°C培养8小时后，12000rpm离心5分钟后，去上清，菌体再用生理盐水重新悬浮；(14)紫外诱变:将菌悬液分配至无菌60mm培养皿中，每个培养皿放5mL,按预定的参数进行紫外辐照，根据菌株对紫外线的敏感程度决定辐照时间，可以进行预备实验，即在固定紫外灯功率和辐照距离后，进行一系列时间的紫外线辐照后，在肉胨平板上涂布计数，计算存活率，取存活率在10%左右的辐照时间为优化后的辐照时间，紫外灯功率为15-20瓦，辐照距离为30厘米；(15)血平板筛选:基本同上述第(10)步，将各处理肉胨平板上的菌落随机挑取至90mm血平板上，每个平板点种6-7个菌落，30°C培养2天后测定各菌落的溶血圈直径；(16)油平板筛选:取溶血圈较大的菌落30个左右，肉胨培养基培养8-10小时后，用牙签钝头蘸取少量菌液，点种至油平板，每个油平板点种4-5个菌落，30°C培养3天后测定曬油斑大小，筛选出最优的菌株10株左右，(17)摇瓶复筛:同上述第(12)步，筛选出最优的菌株3-5株；(18)稳定性评价:取筛选出的优良突变株连续培养5代以上，每代均摇瓶培养，测定相关指标，传代方法是:斜面培养、保存一第一代种子摇瓶培养一同时进行两种培养基的摇瓶发酵一斜面培养保存一第二代种子摇瓶培养……最终获得稳定性较好、综合性状优良的突变株1-2个，作为最终的优良突变菌株。由于采用上述技术方案，本发明所具有的优点和积极效果是:步骤较为简便、可靠，操作性强，成功率高，易于推广应用，诱变改良效果好。
具体实施例方式本发明提供了一种产表面活性剂的烃降解菌的综合诱变改良方法。取出发菌株做成菌膜后，进行离子束注入，通过预备实验获得最佳参数，进行一至多轮离子束诱变处理，通过血平板与油平板复合筛选，初步筛选出优良菌株，作为紫外线诱变的出发菌株，同样通过血平板与油平板复合筛选，并结合产表面活性剂培养基和烃降解培养基摇瓶筛选，进行综合评价，获得突变菌株10株左右，再连续传代培养5代以上，考察各代表现，最终获得稳定的突变株1-2株。
具体实施例对铜绿假单胞菌Z41进行低能离子束和紫外线诱变，以期获得较高表面活性剂产量和较高降解效率的突变株。先用20keV能量的氮离子以0-120X2.5X 1013ions/cm2的剂量进行注入，发现有明显的马鞍型存活曲线存在。通过存活率和血平板突变率的考查，认为60X2.5X1013ions/cm2 是较优的剂量，在拐点的存活率达19 %，通过血平板和油平板筛选以及摇瓶评价，获得突变株L18。对L18进行以20W紫外灯进行诱变，处理时间分别为5s，15s，30s, 40s和60s，之后通过复合筛选获得优良突变株V23，原油周降解率达52.1 %，比出发菌株提高29.6 %，发酵液中鼠李糖脂产量达19.6g/L，比出发菌株提高28.9 %。
权利要求
1.一种产表面活性剂的烃降解菌的诱变改良方法，其特征是: 具体步骤如下: (1)菌种活化:取保藏菌种的甘油管，加入含有50mL肉胨培养基的250mL摇瓶中，30°C振荡培养1-2天，直到培养出现明显的浑浊为止； (2)平板培养:取摇瓶培养物以10倍稀释法稀释成KT1-KT6,取适宜稀释倍数的菌液涂布于肉胨平板； (3)斜面培养:平板培养后检查菌落的一致性，确定为纯培养后，接种于肉胨斜面(采用15mL试管配制)，30°C条件下培养1_2天，至斜面找出菌苔为止； (4)制作菌悬液:取新培养的斜面，加入无菌生理盐水(0.86% )5mL，振荡1_5分钟，使菌苔中的菌体脱落成菌悬液； (5)涂布菌悬液:在超净工作台中，取上述0.1mL菌悬液，添加于灭菌的90mm培养皿下盖中，用涂布棒涂匀； (6)制作菌膜:在超净工作台中，打开培养皿上盖，开无菌风吹5-10min，至培养皿下盖中无水珠为止，使之形成干燥的菌膜，吹风时间过短菌膜不干，易在下一步的离子束注入过程中不易形成真空环境，影响离子束诱变效果，吹风时间也不宜过长，容易造成自然对照和真空对照菌落过少，不易统计相对存活率； (7)离子束注入:吹干形成菌膜后，合上培养皿，立刻将培养皿置离子束注入机小靶室中，取出上盖，封闭小靶室，抽真空至一定真空度后，按事先设计好的离子种类、能量和剂量进行注入，一般选用15-20keV氮离子，设定自然对照和真空对照，菌膜形成后立刻进行下一步即为自然对照，将培养皿放入小靶室中但放于辐照的培养皿下面不开盖即为真空对昭.(8)菌膜洗脱:所有的培 养皿盖上上盖，取出培养皿，用1.5mL生理盐水用移液枪和涂布棒配合使用分两次洗脱菌膜，转移至1.5mL无菌离心管中； (9)平板培养:上述菌悬液摇匀后，梯度稀释到106倍后视实际情况取适宜倍数涂布于肉胨平板上，肉胨培养基成份为(/L):蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，纯净水或自来水1L，调pH至7.0左右，配制平板时要加1.5%的琼脂粉，30°C倒置培养2天后统计菌落数，将各剂量处理均与真空对照相比，求得相对存活率，将真空对照与自然对照的相同稀释倍数的菌落数相比，即得真空对照的存活率； (10)血平板筛选:将各处理肉胨平板上的菌落随机挑取至90mm血平板上，每个平板点种6-7个菌落，30°C培养2天后测定各菌落的溶血圈直径，统计突变率，突变效率分为正突变率(溶血圈直径比出发菌株增加> 10% )和负突变率(溶血圈直径比出发菌株降低> 10% )，以存活率20-30%、正突变率较高而负突变率较低的剂量较为适宜，作为后续辐照的剂量，配制血平板的方法如下:肉胨培养基中加入1.5%的琼脂粉灭菌后取出冷却至50°C左右时，加入5-7%的脱纤维无菌羊血，迅速分配至培养皿中，每个培养皿中加入约15mL培养基，冷却后即得血平板，血平板不耐贮存，一般随用随配；根据以上存活率和突变率确定最优离子注入参数； (11)油平板评价和筛选:挑取溶血圈最大的菌落30个，肉胨培养基培养8-10小时后，用牙签钝头蘸取少量菌液，点种至油平板，每个油平板点种4-5个菌落，30°C倒置培养3天后测定各菌株噬油斑直径油平板配制方法如下:将原油溶于石油醚(浓度10% )中，滤纸剪成直径85mm，置90mm培养皿中，加2mL10%石油溶液，待石油醚挥发后，121°C蒸汽高压灭菌20min，取出60°C烘干备用，矿质盐培养基(MSM)中加入1.5 %的琼脂粉，灭菌后倾倒平板，平板尚未凝固时将滤纸紧贴在平板上后即成油平板，MSM按以下方法配制:MgSQ，0.2g，KH2P04，1.0g ； (NH4)2SO4,1.0g ；CaCl2,0.02g ；K2HPO4,1.0g ；FeCl3,0.05g ;蒸馏水 1L，pH 值最后调整为7.0-7.2，选出噬油斑最大的突变株10株左右； (12)摇瓶复筛:初筛的菌株分别接肉胨培养基后，同时接产表活培养基和烃降解培养基，每个菌株设置3个独立重复，进行摇瓶复筛，具体操作步骤如下:产表面活性剂培养基成份为(g/L):NaN032.5，Κ2ΗΡ044.0，ΚΗ2Ρ044.0，CaCl2.2Η200.LMgSO40.2，NaCll.0, KC11.0,酵母粉1.0，甘油30，pH值最后调整为6.5，加入3-5%的碳源(如废弃植物油)，灭菌后，力口入1%的种子液，30°C、180rpm转速条件下培养3d后测定发酵液稀释100倍后表面张力和发酵液排油圈大小，测定表面张力采用界/表面张力仪，排油圈测定大小的方法是:在90mm培养皿小盖中，加入15mL去离子水，滴加200mL0#柴油，形成油膜后，再在油膜中心用微量取样器加入IOuL的发酵液10倍去离子水稀释液，如果排油圈直径超过培养皿小盖的直径，则将发酵液稀释10倍后再加入； 烃降解培养基为上述(11)中的MSM加I %的原油，按5%的量接种后30°C、120rpm转速条件下摇床培养7d，观察原油乳化和降解情况，测定残余烃的量和发酵液离心后的上清液的表面张力，并分别记录，测定残余烃的量采用重量法，具体方法是:漏斗中加入脱脂棉过滤得滤液，测定表面张力采用表面张力仪进行，脱脂棉上与粘在摇瓶壁上的残余原油采用石油醚(30-60°C沸程)清洗回收到尖底烧瓶中，加热(60°C )条件下采用旋转蒸发仪蒸干石油醚，根据尖底烧瓶前后的质量差求得残余原油的质量，与称重之前的原油质量对比，并结合空白对照的质量变化，求得微生物对摇瓶中原油的降解率； 根据产表面活性剂培养基的表面张力、排油圈、烃降解培养基滤油的表面张力、石油烃降解率进行综合评定，初步筛选出最优的菌株I株； 如有必要，则重复上述步骤，进行多轮离子束诱变筛选； (13)制作菌悬液:取上述突变株接种肉胨培养基摇瓶，30°C培养8小时后，12000rpm离心5分钟后，去上清，菌体再用生理盐水重新悬浮； (14)紫外诱变:将菌悬液分配至无菌60mm培养皿中，每个培养皿放5mL，按预定的参数进行紫外辐照，根据菌株对紫外线的敏感程度决定辐照时间，可以进行预备实验，即在固定紫外灯功率和辐照距离后，进行一系列时间的紫外线辐照后，在肉胨平板上涂布计数，计算存活率，取存活率在10%左右的辐照时间为优化后的辐照时间，紫外灯功率为15-20瓦，辐照距离为30厘米；(15)血平板筛选:基本同上述第(10)步，将各处理肉胨平板上的菌落随机挑取至90mm血平板上，每个平板点种6-7个菌落，30°C培养2天后测定各菌落的溶血圈直径； (16)油平板筛选:取溶血圈较大的菌落30个左右，肉胨培养基培养8-10小时后，用牙签钝头蘸取少量菌液，点种至油平板，每个油平板点种4-5个菌落，30°C培养3天后测定噬油斑大小，筛选出最优的菌株10株左右， (17)摇瓶复筛:同上述第(12)步，筛选出最优的菌株3-5株； (18)稳定性评价:取筛选出的优良突变株连续培养5代以上，每代均摇瓶培养，测定相关指标，传代方法是:斜面培养、保存一第一代种子摇瓶培养一同时进行两种培养基的摇瓶发酵一斜面培养保存一第二代种子摇瓶培养……最终获得稳定性较好、综合性状优良的突变株1-2个，作为 最终的优良突变菌株，或作为下一轮诱变改良的出发菌株。
全文摘要
本发明涉及一种产表面活性剂的烃降解菌的诱变改良方法，属于环境生物工程和环境微生物技术领域。取出发菌株做成菌膜后，进行离子束注入，通过预备实验获得最佳参数，进行一至多轮离子束诱变处理，通过血平板与油平板复合筛选，初步筛选出优良菌株，作为紫外线诱变的出发菌株，同样通过血平板与油平板复合筛选，并结合产表面活性剂培养基和烃降解培养基摇瓶筛选，进行综合评价，获得突变菌株10株左右，再连续传代培养5代以上，考察各代表现，最终获得稳定的突变株1-2株。由于采用上述技术方案，本发明所具有的优点和积极效果是步骤较为简便、可靠，操作性强，成功率高，易于推广应用，诱变改良效果好。
文档编号C12N13/00GK103146677SQ20131004355
公开日2013年6月12日 申请日期2013年1月27日 优先权日2013年1月27日
发明者张祥胜, 范红香, 许德军 申请人:盐城师范学院