专利名称：一种鱼类NK-lysin效应因子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种鱼类NK-1ysin效应因子及其应用。
背景技术：
细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes, CTLs)和自然杀伤细胞(natural killer cell，NKC)是细胞免疫的主要效应细胞。这些细胞在受到刺激时分泌一系列引起祀细胞凋亡和杀伤的效应因子，其中一种即为NK-lysin。NK-1ysin是saposin家族的一员，具有典型的saposin结 构域。在哺乳动物中，NK-1ysin是一种抗菌肽，具有广谱的抑菌活性。因此，NK-1ysin在细菌性疾病的防治中有良好的应用前景。ΝΚ-lysin目前只在五种硬骨鱼中发现，但其功能、应用等尚待研究。
发明内容
本发明目的在于提供一种ΝΚ-lysin效应因子及其应用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:一种鱼类ΝΚ-lysin效应因子，ΝΚ-lysin为序列表SEQ ID N0.1中的氨基酸序列所示。NK-1 ysin效应因子的制备方法，以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物Fl和Rl进行PCR扩±曾，PCR产物纯化后与质粒PIRES2-EGFP用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌，筛选转化子提取质粒，即为含SEQ ID N0.1中氨基酸序列所示的质粒pCNKl ;所述Fl为5， -GATATCATGAACAAATCTCCAATCC-3， ；R1 为 5， -GATATCGTTGTTTGGATAGAAGAGGA-3，。ΝΚ-lysin效应因子的应用，所述ΝΚ-lysin效应因子用于制备抗细菌或病毒的药物。将含SEQ ID N0.1中氨基酸序列所示的质粒pCNKl在PBS中稀释至200ug/ml。本发明具有如下优点:本发明的NK-1ys in表达质粒注射鱼类后能够明显提高鱼类的抗病毒和抗细菌感染能力。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法:1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。2.大肠杆菌用 Hanahan 方法(Sambrook and Russell:Molecular Cloning: ALaboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)。3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。
实施例1本发明的NK-1ysin为序列表SEQ ID N0.1中的氨基酸序列。序列表SEQ ID N0.1 为:MNKSPILLFCILAACSVWSVHGKSQEMNIDDEEPAEVELPVEAKPPGLCWGCKWALNKVKKAMTQKETYEKVKAR LIKICNKIGFLKSRCHKFVITHLDELVEELSTTDDVKTICVNVKACNPKEPSHLLFYPNN(a)序列特征: 长度:135 (有效作用区域47 — 121) 类型:氨基酸序列籲链型:单链 拓扑结构:线性(b)分子类型:蛋白质(C)假设:否(d)反义:否( e )最初来源:半滑舌鳎结构特点:该蛋白预期含有一个Saposin B功能域(氨基酸47 — 121)。实施例2NK-1ysin表达质粒pCNKl的构建:以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物Fl和Rl进行PCR扩增。PCR条件为:94 V 60s预变性模板DNA，然后94 °C 40s, 50 V 60s, 72 V 60s, 5个循环后改为940C 40s, 58°C 60s, 72°C 60s, 30个循环后再在72°C延伸反应7 — IOmin0 PCR产物用天根的相应试剂盒纯化。将表达载体pIRES2-EGFP (购于美国Clontech公司)用限制性内切酶SmaI酶切后回收5kb片段，将其与上述纯化的PCR产物用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌DH5 α，在含卡那霉素(50ug/ml)的LB培养基上培养18 — 24小时，筛选转化子提取质粒，命名为pCNKl。通过DNA测序分析证明了 pCNKl为含有实施例1NK-1ysin序列的表达质粒。所述LB组成成分按重量百分比计:1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化钠，97.5%蒸馏水。所述 Fl 为 5’ -GATATCATGAACAAATCTCCAATCC-3’ ;R1 为 5’ -GATATCGTTGTTTGGATAGAAGAGGA-3，。实施例3NK-1ys in表达质粒pCNKl的应用步骤I)质粒注射将上述实施例2的pCNKl在PBS中稀释至200ug/ml，即为pCNKl稀释液。将20条半滑舌鳎(重约5.1g)随机分为4组，每组5条。将这4组分别命名为A、B、C和D。将A和C组的每条鱼分别注射50 ulpCNKl稀释液，将B和D组(对照组)的每条鱼分别注射50 ulPBS。所述PBS组 成成分按重量百分比计:0.8 % NaCl, 0.02 % KCl, 0.358 %Na2HPO4.12H20, 0.024% NaH2PO4,余量为水。步骤2)细菌和病毒悬液制备在LB培养基中培养鳗弧菌C312至OD6tltl为0.8，然后离心(5000g，4 V，IOmin),收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为I xl07cfu/ml，即为鳗弧菌悬液。将细胞肿大病毒RBIV-Cl (具体制备方法见Zhang M, Xiao Z, HuY, Sun L.Characterization of a megalocytivirus from cultured rock bream, Oplegnathusfasciatus (Temminck&Schlege), in China.Aquae Res.2012; 43:556 - 64)于 PBS 中稀释至5xl05copies/ml,即为病毒悬液。所所述鳗弧菌C312保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为:CGMCC N0.6250，保藏日期2012.6.21，分类命名为鳗弧菌(Vibrioanguillarum)，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号。步骤3)攻毒感染
在上述步骤I)注射后第7天，将A和B组的每条鱼注射50ul上述步骤2)的鳗弧菌悬液，将C和D组的每条鱼注射50ul上述步骤2)的病毒悬液。在感染后24h，取鱼肾脏和脾脏组织。将A和B组鱼的组织在2ml PBS中匀浆，将IOOul匀浆液涂布于LB平板。将平板置于30°C培养48h，计算出现的菌落数。利用DNA提取试剂盒(购于天根生化科技(北京)有限公司”)从C和D组鱼肾脏和脾脏组织中提取DNA，用绝对定量PCR法检测组织中病毒含量(具体方法见上述参考文献)。结果表明A组鱼肾脏和脾脏的细菌数(分别为IxlO5和8xl05)显著(P〈0.01)低于B组鱼肾脏和脾脏的细菌数(分别为4.2xl05和2.7xl06)；C组鱼肾脏和脾脏的病毒数(分别为IxlO8和IxlO9)显著(P〈0.01)低于D组鱼肾脏和脾脏的病毒数(分别为3.4xl08和4.3xl09)。这些结果表明，ΝΚ-lysin能够显著增强鱼类抵抗细菌和病毒的侵染。
权利要求
1.一种鱼类NK-1ysin效应因子，其特征在于:NK_lysin为序列表SEQID N0.1中的氨基酸序列所示。
2.—种权利要求1所述NK-1ysin效应因子的制备方法，其特征在于: 以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物Fl和Rl进行PCR扩±曾，PCR产物纯化后与质粒PIRES2-EGFP用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌，筛选转化子提取质粒，即为含SEQ ID N0.1中氨基酸序列所示的质粒pCNKl ;所述Fl为5， -GATATCATGAACAAATCTCCAATCC-3， ；R1 为 5， -GATATCGTTGTTTGGATAGAAGAGGA-3，。
3.一种权利要求1所述NK-1ys in效应因子的应用，其特征在于:所述NK-1ysin效应因子用于制备抗细菌或病毒的药物。
4.按权利要求3所述NK-1ysin效应因子的应用，其特征在于:将含SEQIDN0.1中氨基酸序列所示的质粒pCNKl在 PBS中稀释至200ug/ml。
全文摘要
本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种半滑舌鳎NK-lysin及其应用。NK-lysin为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示。应用方法以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增，PCR产物连接表达载体后得质粒pCNK1，将其注射鱼类，即能显著增强鱼类的抗病毒和抗细菌能力。
文档编号C12N15/70GK103145822SQ20131004456
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月4日 优先权日2013年2月4日
发明者张敏, 孙黎 申请人:中国科学院海洋研究所