专利名称：弗氏链霉菌发酵生产泰乐菌素的培养基及发酵方法
技术领域：
本发明属于发酵技术领域，特别是涉及一种弗氏链霉菌发酵生产泰乐菌素的培养基及发酵方法。
背景技术：
泰乐菌素又称泰乐霉素，是由放线菌属弗氏链霉菌经发酵提取而得到的一种大环内酯类抗生素，有泰乐菌素碱、磷酸盐和酒石酸盐三种形态。泰乐菌素是一种禽、畜专用的高效、无残留抗菌促生剂。对鸡败血症、猪流行性肺炎等疾病有独特的疗效，且对禽、畜的生长具有明显的促进作用。泰乐菌素作为动物专用抗生素，避免了人畜共用抗生素易产生交叉耐药性的问题，用于防治猪、禽支原体病。国内泰乐菌素生产方法主要是发酵法，采用弗氏链霉作为菌种，以鱼粉和豆油为原料的传统方法生产，作为传统发酵工艺的培养基典型配方为:鱼粉I 1.5%，豆饼粉0.5 I %，玉米粉I 1.2%，玉米蛋粉0.5 I %，碳酸钙0.2 0.3%，甜菜碱盐酸盐0.05 0.1%，磷酸氢二铵0.04 0.06%，氯化钾0.09 0.11%，氯化钠0.09 0.11%。发酵结束后，泰乐菌素发酵单位在10000 12000u/ml ;发酵周期控制在180 200h ;泰乐菌素A组分控制在80 85%。由于采用豆油、鱼粉为主要原料，发酵单位低；生产周期长；生产成本较高，其中豆油成本占总成本的60%左右，鱼粉成本占总成本的15%左右。
发明内容
本发明目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种有效提高发酵单位，缩短发酵周期，同时最大限度的降低原辅料入豆油、鱼粉用量，降低生产成本，且原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现泰乐菌素稳定、高效地生产的弗氏链霉菌发酵生产泰乐菌素的培养基。 本发明的另一目的是提供利用上述培养基生产泰乐菌素的发酵方法。为实现上述目的所采取的技术方案为:—种弗氏链霉菌发酵生产泰乐菌素的培养基，包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其特征在于上述一级种子培养基中含有花生饼粉和玉米油，二级种子培养基和发酵培养基中均含有混合鱼粉、花生饼粉和玉米油。上述一级种子培养基的组成为:玉米油15 20ml/L、玉米蛋白粉10 20g/L、花生饼粉15 20g/L、玉米浆2 3g/L、磷酸氢二铵0.3 0.4g/L、碳酸钙I 2g/L。上述二级种子培养基的组成为:玉米油15 20ml/L、玉米蛋白粉10 20g/L、花生饼粉15 20g/L、磷酸氢二铵0.3 0.4g/L、碳酸钙I 2g/L、混合鱼粉10 15g/L、玉米楽;2 3g/L。上述发酵培养基的组成为:玉米油25 30ml/L、玉米蛋白粉20 22g/L、花生饼粉10 12g/L、混合鱼粉6 8g/L、磷酸氢二铵0.1 0.2g/L、碳酸I丐2.5 3g/L、盐酸甜菜碱0.6 0.8g/L、氯化钴0.005 0.007g/L、氯化钾0.9 lg/L、氯化钠0.9 lg/L、硫酸镁 0.8 0.9g/L。一种利用上述培养基的发酵方法，其工艺步骤包括:I) 一级种子培养:首先将一级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压(压力
0.01 0.02MPa)，然后在火焰保护下，将已经培养好的弗氏链霉菌母瓶发酵液接入一级种子罐中进行培养，接种量控制在培养基体积的5-10% ;培养条件为:a 罐压 0.02 0.04MPa ；b 罐温 28 32。(:；c 空气流量:0 12h:50 60m3/h ；12h 移种:120 130m3/h ；d 揽祥转速 100 120r/min ；e pH 值 6 8 ;f 一级种子液停止培养，菌体浓度15 25% ;g镜检无杂菌；
h培养时间20 30h ；2) 二级种子培养:先将二级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压(压力
0.01 0.02MPa)，然后将一级种 子液全部移入二级种子罐进行培养；培养条件为:a 罐压 0.02 0.04MPa ；b 罐温 28 33°C ;c 空气流量 1000 IlOOm3A ;d 揽祥转速 150 160r/min ；e pH 6 8 ;f 二级种子液停止培养，菌体浓度30 40 % ;g镜检无杂菌；h培养时间30 40h ；3)发酵培养:先将发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压(压力0.01
0.02MPa)，然后将二级种子液全部移入发酵罐进行培养；培养条件为:a发酵培养基灭菌后脂肪控制在2 3% ;b发酵开始 130h:培养温度28 32°C、搅拌转速200 220r/min ；c 130h 结束前:温度 35 38°C、转速 250 260r/min ；d 60h 组分转化前:菌体浓度40 50% ;组分转化期间:菌体浓度30 40% ;e 罐压 0.05 0.06MPa ；f发酵过程中pH6.0 7.5 ;g空气流量:0h 组分转化前:1800 1900m3/h ;组分转化期间:1500 1600m3/h ；h发酵过程中进行菌检，要求无其它杂菌；I培养时间比0 I8Oh ;J发酵培养停止条件为:发酵效价每6 8h取样检测，前、后检测的发酵单位相差在300u/ml以内；泰乐菌素A组份> 86% ;泰乐菌素C组份< 1% ;菌体浓度30 50% ;发酵单位在13200u/mL以上；pH值6.0 7.0 ;脂肪在0.1 0.4%。在上述发酵过程中需要根据条件随时进行补料，S卩补油、补水、补酸或碱，具体方式为:a补油控制:补油选择玉米油，发酵前35h不用进行补油，当发酵时间在35 IOOh时，采用流加法进行补油；每隔4 6h检测发酵液脂肪含量，发酵液脂肪含量< 1%，进行补油；发酵液脂肪含量控制在I 1.5%停止补油；当发酵时间在IOOh至泰乐菌素发酵液组份转化开始期间，采用流加法进行补油；每隔4 6h检测发酵液脂肪含量，发酵液脂肪含量< 0.5%,进行补油；发酵液脂肪含量控制在0.5 1%停止补油；当发酵时间在泰乐菌素发酵液组份转化期间至发酵结束，采用流加法进行补油；每隔4 6h检测发酵液脂肪含量，发酵液脂肪含量< 0.1%，进行补油；发酵液脂肪含量控制在0.1 0.5%停止补油。b补水:发酵过程中，按照工艺要求必须定时补入一定量的水，其目的是控制菌体浓度，有利于次级代谢产物的生成。发酵前30h不用进行补水；当发酵时间在35 80h时,采用流加法进行补水；每隔4 6h检测菌体浓度,发酵液菌体浓度< 40%，进行补水，发酵液菌体浓度控制在40 50%停止补水；当发酵时间在80h至发酵结束，采用流加法进行补水，每隔4 6h检测发酵液菌体浓度含量，发酵液菌体浓度< 30%，进行补水，发酵液菌体浓度控制在40 50%停止补水。c补酸或碱:用酸或碱控制发酵25h至组份开始转化前的pH 6 7.5，组份转化期间 发酵结束PH 6 7 ;发酵前25h，pH不进行控制；发酵时间在25h至发酵液组份开始转化前，每隔4 6h检测发酵液pH，当pH < 6，补入20%的氢氧化钠溶液；当pH > 7.5，补入20 30%的硫酸铵溶液，发酵液pH控制在6 7.5 ;发酵时间在发酵液组份开始转化至发酵结束，每隔4 6h检测发酵液pH，当pH
<6，补入20%的氢氧化钠溶液；当pH > 7，补入20 30%的硫酸铵溶液，发酵液pH控制在6 7。本发明是基于下面阐述的鱼粉、豆油的来源，影响泰乐菌素发酵效价、组分和发酵周期的因素而设计的:I)全世界的鱼粉生产国主要有秘鲁、智利、日本、丹麦、美国、挪威等，其中秘鲁与智利的出口量约占总贸易量的70%。中国鱼粉产量不高，主要生产地在山东省、浙江省，其次为河北、天津、福建、广西等省市。我公司年产泰乐菌素1500吨以上，鱼粉使用量高，其占总泰乐菌素生产成本的15%左右。2)近年来，世界豆油产量和消费量均呈现上升态势，2010年豆油消费量居世界植物油脂消费的首位。中国也是重要的豆油进口国，豆油进口量均占世界豆油进口总量的10%以上。目前，国内市场豆 油价格较高，我公司生产泰乐菌素I吨消耗豆油4000 5000L，占总成本的60%左右。3)国内泰乐菌素生产方法主要是发酵法，采用弗氏链霉作为菌种，以鱼粉和豆油为原料的传统法。发酵结束后，泰乐菌素发酵单位在10000 12000u/ml ;发酵周期控制在180 200h ;泰乐菌素A组分控制在80 85 %。故而本发明通过采用玉米油替代豆油；混合鱼粉和花生饼粉代替鱼粉，优化其培养基配方，从而解决了原辅料的成本问题，并且最大限度的降低原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现泰乐菌素稳定、高效的生产。同时利用该培养基可提高发酵单位、缩短发酵周期、提高泰乐菌素A组分。实验表明:本发明以混合鱼粉(调整鱼粉+肉骨粉或羽毛粉)、花生饼粉和玉米油为主要原料生产泰乐菌素，发酵结束后，泰乐菌素发酵单位在13200 14000u/ml ;发酵周期控制在160 180h ;泰乐菌素A组分控制在87.5 90%。其中玉米油成本占总成本的20%左右，混合鱼粉和花生饼粉成本占总成本的10%左右。本发明节约了原辅料用量，降低综合成本。
具体实施例方式下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。下述实施例的菌种选用弗氏链霉菌:生产使用的菌种来源为母瓶发酵液。母瓶发酵液质量:pH7 8 ;菌体浓度15 20% ;镜检无杂菌；发酵单位13000 14000u/ml。实施例1一级种子培养基配制过程:在Im3—级种子罐中加入玉米油15L、玉米蛋白粉10kg、花生饼粉15kg、玉米浆2L、磷酸氢二铵0.3kg、碳酸钙1kg。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件:压力0.10 0.14MPa ;温度120 122°C;灭菌时间32min，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0.0lMPa,等待接种。二级种子培养基制备过程:在10m3 二级种子罐中加入玉米油150L、玉米蛋白粉100kg、花生饼粉150kg、磷酸氢二铵3kg、碳酸|丐10kg、混合鱼粉100kg、玉米衆20L。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件:压力0.10 0.14MPa ;温度120 123°C ;灭菌时间31min，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0.0lMPa，等待移种。发酵培养基制备过程:在IOOm3发酵罐中加入玉米油2500L、玉米蛋白粉2000kg、花生饼粉1000kg、混合鱼粉600kg、碳酸韩250kg、盐酸甜菜碱60kg、氯化钴0.5kg、氯化钾90kg、氯化钠90kg、硫酸镁80kg、磷酸氢二铵10kg。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件:压力0.10 0.14MPa ;温度122 123°C;时间38min。冷却，并用无菌空气保压，压力控制在0.01-0.02MPa，等待移种。一级种子培养过程控制:将符合接种条件(镜检无杂菌，菌体浓度15.4%,pH7.6、摇瓶效价13632u/ml)的弗氏链霉菌母瓶发酵液在火焰保护下，由接种口接入以及种子培养罐，接种量控制在种子培养基体积的6.2%，罐压控制在0.02MPa ;罐温28 29°C ;空气流量:0 12h:50.2m3/h ；12h 移种:120.4m3/h ;搅拌转速100r/min。一级种子培养结束，PH7.4 ;菌体浓度18.9% ;镜检无杂菌；培养时间28.5h ；二级种子培养过程控制:符合移种条件的一级种子液由移种管道全部移入二级种子罐。罐压控制在0.02MPa;罐温28 29°C;空气流量1001113/11;搅拌转速1501'/min。二级种子培养结束，PH7.6 ;菌体浓度34.3% ;镜检无杂菌；培养时间39.2h。发酵培养基过程控制:发酵培养基灭菌后其脂肪含量为2.5%，将符合移种条件的二级种子液由移种管道全部移入发酵罐。罐压控制在0.05MPa ;发酵开始 130h:培养温度28°C、搅拌转速200r/min ;130h 发酵结束前:温度35°C、转速250r/min ;0h 组分转化前:空气流量1800m3/h ;组分转化期间:空气流量1500m3/h ;发酵过程中进行菌检，无其它杂菌。60h 组分转化前:菌体浓度40 50% ;组分转化期间:菌体浓度30 40% ;发酵结束，培养时间178.2h ；pH7.1 ;脂肪0.12% ;发酵过程中补玉米油2432L ;补水22.7m3。泰乐菌素A组分86.9%;泰乐菌素C组分0.8%;总组分(泰乐菌素A+泰乐菌素B+泰乐菌素C+泰乐菌素D)97.2% ;发酵效价13423u/ml。上述发酵过程中补油、补水及酸碱度的调整控制方式如下:a补油控制:补油选择玉米油，发酵前35h不用进行补油，当发酵时间在35 IOOh时，采用流加法进行补油；每隔4 6h检测发酵液脂肪含量，发酵液脂肪含量< 1%，进行补油；发酵液脂肪含量控制在I 1.5%停止补油；当发酵时间在IOOh至泰乐菌素发酵液组份转化开始期间，采用流加法进行补油；每隔4 6h检测发酵液脂肪含量，发酵液脂肪含量< 0.5%,进行补油；发酵液脂肪含量控制在0.5 1%停止补油；当发酵时间在泰乐菌素发酵液组份转化期间至发酵结束，采用流加法进行补油；每隔4 6h检测发酵液脂肪含量，发酵液脂肪含量< 0.1%，进行补油；发酵液脂肪含量控制在0.1 0.5%停止补油。b补水:发酵过程中，按照工艺要求必须定时补入一定量的水，其目的是控制菌体浓度，有利于次级代谢产物的生成。发酵前30h不用进行补水；当发酵时间在35 80h时，采用流加法进行补水；每隔4 6h检测菌体浓度，发酵液菌体浓度< 40%，进行补水，发酵液菌体浓度控制在40 50%停止补水；当发酵时间在80h至发酵结束，采用流加法进行补水，每隔4 6h检测发酵液菌体浓度含量，发酵液菌体浓度< 30%，进行补水，发酵液菌体浓度控制在40 50%停止补水。c补酸或碱:用酸或碱控制发酵25h至组份开始转化前的pH 6 7.5，组份转化期间 发酵结束PH 6 7 ;发酵前25h，pH不进行控制；发酵时间在25h至发酵液组份开始转化前，每隔4 6h检测发酵液pH，当pH < 6，补入20%的氢氧化钠溶液；当pH > 7.5，补入20 30%的硫酸铵溶液，发酵液pH控制在
6 7.5 ;发酵时间在发酵液组份开始转化至发酵结束，每隔4 6h检测发酵液pH，当pH
<6，补入20 %的氢氧化钠溶液； 当pH > 7，补入20 30 %的硫酸铵溶液，发酵液pH控制在6 7。实施例2一级种子培养基配制过程:在Im3—级种子罐中加入玉米油18L、玉米蛋白粉15kg、花生饼粉18kg、玉米衆2.5L、磷酸氢二铵0.35kg、碳酸韩1.5kg。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件:压力0.10 0.14MPa ;温度120 122°C ;灭菌时间31min，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0.015MPa，等待接种。二级种子培养基制备过程:在IOm3 二级种子罐中加入玉米油180L、玉米蛋白粉150kg、花生饼粉180kg、磷酸氢二铵3.5kg、碳酸钙15kg、混合鱼粉130kg、玉米浆25L。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件:压力0.10 0.14MPa ;温度120 122°C;灭菌时间32min，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0.015MPa，等待移种。发酵培养基制备过程:在IOOm3发酵罐中加入玉米油2800L、玉米蛋白粉2100kg、花生饼粉1100kg、混合鱼粉710kg、碳酸钙28lkg、盐酸甜菜碱72kg、氯化钴0.62kg、氯化钾95.8kg、氯化钠96.2kg、磷酸氢二铵15kg、硫酸镁84.7kg。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件:压力0.10 0.14MPa ;温度122 123°C ;时间38min。冷却，并用无菌空气保压，压力控制在0.015MPa，等待移种。一级种子培养过程控制:将符合接种条件(镜检无杂菌，菌体浓度18.4%,pH7.5、摇瓶效价13507u/ml)的弗氏链霉菌母瓶发酵液在火焰保护下，由接种口接入以及种子培养罐，接种量控制在种子培养基体积的6.0%，罐压控制在0.03MPa ;罐温29 30°C ;空气流量:0 12h:55.4m3/h ；12h 移种:126.lm3/h ;搅拌转速110r/min。一级种子培养结束，PH7.3 ;菌体浓度23.2% ;镜检无杂菌；培养时间26.1h ；二级种子培养过程控制:符合移种条件的一级种子液由移种管道全部移入二级种子罐。罐压控制在0.015MPa;罐温29 30°C;空气流量1050m3/h;搅拌转速155r/min。二级种子培养结束，PH7.4 ;菌体浓度38.7% ;镜检无杂菌；培养时间36.4h。发酵培养基过程控制:发酵培养基灭菌后其脂肪含量为2.2%，将符合移种条件的二级种子液由移种管道全部移入发酵罐。罐压控制在0.055MPa ;发酵开始 130h:培养温度31°C、搅拌转速210r/min ;130h 发酵结束前:温度36°C、转速255r/min ;0h 组分转化前:空气流量1850m3/h ;组分转化期间:空气流量1550mVh ;发酵过程中进行菌检，无其它杂菌。60h 组分转化前:菌体浓度43 47%;组分转化期间:菌体浓度34 36%;发酵结束，培养时间168.7h ；p H6.9 ;脂肪0.23% ;发酵过程中补玉米油2302L ;补水26.8m3。泰乐菌素A组分89.3% ;总组分(泰乐菌素A+泰乐菌素B+泰乐菌素C+泰乐菌素D) 98.7%；泰乐菌素C组分0.1% ;发酵效价13972u/ml。上述补油、补水及酸碱度的控制方式同时实施例1。实施例3一级种子培养基配制过程:在Im3—级种子罐中加入玉米油20L、玉米蛋白粉20kg、花生饼粉20kg、玉米浆3L、磷酸氢二铵0.4kg、碳酸钙2kg。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件:压力0.10 0.14MPa ;温度120 122°C;灭菌时间30min，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0.02MPa,等待接种。二级种子培养基制备过程:在IOm3 二级种子罐中加入玉米油200L、玉米蛋白粉200kg、花生饼粉200kg、磷酸氢二铵4kg、碳酸韩20kg、混合鱼粉150kg、玉米衆30L。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件:压力0.10 0.14MPa ;温度120 122°C ;灭菌时间31min，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0.02MPa，等待移种。发酵培养基制备过程:在IOOm3发酵罐中加入玉米油3000L、玉米蛋白粉2200kg、花生饼粉1200kg、混合鱼粉800kg、碳酸钙300kg、盐酸甜菜碱80kg、氯化钴0.7kg、氯化钾100kg、氯化钠100kg、磷酸氢二铵20kg、硫酸镁90kg。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件:压力0.10 0.14MPa ;温度122 123°C;时间36min。冷却，并用无菌空气保压，压力控制在0.02MPa，等待移种。一级种子培养过程控制:将符合接种条件(镜检无杂菌，菌体浓度17.3%,pH7.6、摇瓶效价13587u/ml)的弗氏链霉菌母瓶发酵液在火焰保护下，由接种口接入以及种子培养罐，接种量控制在种子培养基体积的6.3%，罐压控制在0.04MPa ;罐温30 31°C;空气流量:0 12h:60m3/h ；12h 移种:130m3/h ;搅拌转速120r/min。一级种子培养结束，pH7.0 ；菌体浓度18.4% ;镜检无杂菌；培养时间27.8h ；二级种子培养过程控制:符合移种条件的一级种子液由移种管道全部移入二级种子罐。罐压控制在0.02MPa ;罐温31 33°C ;空气流量IlOOmVh ;搅拌转速160r/min。二级种子培养结束，PH7.4 ;菌体浓度32.3% ;镜检无杂菌；培养时间39.lh。发酵培养基过程控制:发酵培养基灭菌后其脂肪含量为2.8%，将符合移种条件的二级种子液由移种管道全部移入发酵罐。罐压控制在0.06MPa ;发酵开始 130h:培养温度32°C、搅拌转速220r/min ;130h 发酵结束前:温度38°C、转速260r/min ;0h 组分转化前:空气流量1900m3/h ;组分转化期间:空气流量1600m3/h ;发酵过程中进行菌检，无其它杂菌。60h 组分转化前:菌体浓度41 45% ;组分转化期间:菌体浓度32 35% ;发酵结束，培养时间177.6h ；pH6.2 ;脂肪0.37% ;发酵过程中补玉米油2342L ;补水28.2m3。泰乐菌素A组分86.8%;泰乐菌素C组分0.7%;总组分(泰乐菌素A+泰乐菌素B+泰乐菌素C+泰乐菌素D)96.3% ;发酵效价13387u/ml。上述补油、补水及酸碱度的控制方式同时实施例1。实施例4一级种子培养基配制过程:在Im3—级种子罐中加入玉米油17.8L、玉米蛋白粉16.1kg、花生饼 粉17.5kg、玉米衆2.4L、磷酸氢二铵0.34kg、碳酸I丐1.6kg。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件:压力0.10 0.14MPa ;温度120 122。。;灭菌时间30min，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0.0 IMPa，等待接种。二级种子培养基制备过程:在IOm3 二级种子罐中加入玉米油182L、玉米蛋白粉151kg、花生饼粉181kg、磷酸氢二铵3.4kg、碳酸韩14kg、混合鱼粉136kg、玉米衆25L。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件:压力0.10 0.14MPa ;温度120 122°C;灭菌时间32min，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0.0lMPa，等待移种。发酵培养基制备过程:在IOOm3发酵罐中加入玉米油2690L、玉米蛋白粉2120kg、花生饼粉1125kg、混合鱼粉725kg、碳酸钙273kg、盐酸甜菜碱73kg、氯化钴0.61kg、氯化钾92.8kg、氯化钠91.2kg、磷酸氢二铵15.3kg、硫酸镁84.2kg。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件:压力0.10 0.14MPa ;温度122 123°C ;时间36min。冷却，并用无菌空气保压，压力控制在0.0lMPa，等待移种。一级种子培养过程控制:将符合接种条件(镜检无杂菌，菌体浓度20.3%,pH7.7、摇瓶效价13476u/ml)的弗氏链霉菌母瓶发酵液在火焰保护下，由接种口接入以及种子培养罐，接种量控制在种子培养基体积的6.3%，罐压控制在0.03MPa ;罐温29 30°C ;空气流量:0 12h:54.8m3/h ；12h 移种:125.4m3/h ;搅拌转速110r/min。一级种子培养结束，PH7.2 ;菌体浓度23.7% ;镜检无杂菌；培养时间25.5h ；二级种子培养过程控制:符合移种条件的一级种子液由移种管道全部移入二级种子罐。罐压控制在0.025MPa;罐温29 30°C;空气流量1052m3/h;搅拌转速155r/min。二级种子培养结束，PH7.5 ;菌体浓度38.3% ;镜检无杂菌；培养时间35.6h。发酵培养基过程控制:发酵培养基灭菌后其脂肪含量为2.3%，将符合移种条件的二级种子液由移种管道全部移入发酵罐。罐压控制在0.05MPa ;发酵开始 130h:培养温度29°C、搅拌转速210r/min ;130h 发酵结束前:温度36°C、转速255r/min ;0h 组分转化前:空气流量1836m3/h ;组分转化期间:空气流量1528m3/h ;发酵过程中进行菌检，无其它杂菌。60h 组分转化前:菌体浓度45 47% ;组分转化期间:菌体浓度35 37% ;发酵结束，培养时间167.6h ；pH6.8 ;脂肪0.22% ;发酵过程中补玉米油2289L ;补水25.4m3。发酵泰乐菌素A组分88.9%;泰乐菌素C组份0.3%;总组分(泰乐菌素A+泰乐菌素B+泰乐菌素C+泰乐菌素D)98.2% ;发酵效价13814u/ml。上述补油、补水及酸碱度的控制方式同时实施例1。实施例5一级种子培养基配制过程:在Im3 —级种子罐中加入玉米油17.2L、玉米蛋白粉16.2kg、花生饼粉17.3kg、玉米浆2.1L、磷酸氢二铵0.32kg、碳酸钙1.5kg。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件:压力0.10 0.14MPa ;温度120 122。。;灭菌时间30min，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0.0 IMPa，等待接种。二级种子培养基制备过程:在IOm3 二级种子罐中加入玉米油183L、玉米蛋白粉152kg、花生饼粉183kg、磷酸氢二铵3.5kg、碳酸钙15kg、混合鱼粉138kg、玉米浆24L。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件:压力0.10 0.14MPa ;温度120 122°C;灭菌时间30min，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0.0lMPa，等待移种。发酵培养基制备过程:在IOOm3发酵罐中加入玉米油3000L、玉米蛋白粉2200kg、花生饼粉1200kg、混合鱼粉800kg、碳酸钙300kg、盐酸甜菜碱80kg、氯化钴0.7kg、氯化钾100kg、氯化钠100kg、磷酸氢二铵19.7kg，硫酸镁90kg。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件:压力0.10 0.14MPa ;温度122 123。。;时间36min。冷却，并用无菌空气保压，压力控制在0.02MPa，等待移种。一级种子培养过程控制:将符合接种条件(镜检无杂菌，菌体浓度20.5%,pH7.5、摇瓶效价13523u/ml)的弗氏链霉菌母瓶发酵液在火焰保护下，由接种口接入以及种子培养罐，接种量控制在种子培养基体积的6.2%，罐压控制在0.03MPa ;罐温29 30°C ;空气流量:0 12h:55.2m3/h ；12h 移种:125.lm3/h ;搅拌转速lllr/min。一级种子培养结束，PH7.3 ;菌体浓度23.3% ;镜检无杂菌；培养时间26.9h ；
二级种子培养过程控制:符合移种条件的一级种子液由移种管道全部移入二级种子罐。罐压控制在0.02MPa ;罐温29 30°C ;空气流量1052mVh ;搅拌转速156r/min。二级种子培养结束，PH7.5 ;菌体浓度37.2% ;镜检无杂菌；培养时间36.2h。发酵培养基过程控制:发酵培养基灭菌后其脂肪含量为2.7%，将符合移种条件的二级种子液由移种管道全部移入发酵罐。罐压控制在0.05MPa ;发酵开始 130h:培养温度31°C、搅拌转速210r/min ;130h 发酵结束前:温度38°C、转速254r/min ;0h 组分转化前:空气流量1894m3/h ;组分转化期间:空气流量1595m3/h ;发酵过程中进行菌检，无其它杂菌。60h 组分转化前:菌体浓度40 43% ;组分转化期间:菌体浓度32 34% ;发酵结束，培养时间176.4h ；pH6.6 ;脂肪0.35% ;发酵过程中补玉米油2314L ;补水26.7m3。发酵泰乐菌素A组分87.2%;泰乐菌素C组份0.9%;总组分(泰乐菌素A+泰乐菌素B+泰乐菌素C+泰乐菌素D) 96.4% ;发酵效价13389u/ml。实施上述补油、补水及酸碱度的控制方式同时实施例1。实施例6 对比实例:以鱼粉、豆油为原料，按照泰乐菌素发酵工艺，用弗氏链霉菌发酵生产泰乐菌素。一级种子培养基配制过程:在Im3 —级种子罐中加入豆油20L、玉米蛋白粉14.8kg、玉米浆3L、磷酸氢二铵0.3kg、碳酸钙1.1kgo完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件:压力0.10 0.14MPa ;温度120 122°C;灭菌时间31min，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0.0lMPa，等待接种。二级种子培养基制备过程:在IOm3 二级种子罐中加入豆油160L、玉米蛋白粉120kg、磷酸氢二铵3kg、碳酸钙10kg、鱼粉180kg、玉米浆21L。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件:压力0.10 0.14MPa ;温度120 123°C;灭菌时间31min，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0.0lMPa,等待移种。发酵培养基制备过程:在IOOm3发酵罐中加入鱼粉1000kg、豆饼粉543kg、玉米粉1002kg、玉米蛋白粉512kg、碳酸韩25kg、盐酸甜菜碱10kg、磷酸氢二铵5kg、氯化钾96kg、氯化钠95kg、豆油2400L、氯化钴0.67kg、硫酸镁88kg。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件:压力0.10 0.14MPa ;温度122 123°C;时间37min。冷却，并用无菌空气保压，压力控制在0.01-0.02MPa，等待移种。—级种子培养过程控制:将符合接种条件(镜检无杂菌，菌体浓度16.8%,pH7.5、摇瓶效价13569u/ml)的弗氏链霉菌母瓶发酵液在火焰保护下，由接种口接入以及种子培养罐，接种量控制在种子培养基体积的6.0%，罐压控制在0.02MPa ;罐温28 29 °C ;空气流量:0 12h:51.2m3/h ；12h 移种:123.4m3/h ;搅拌转速102r/min。一级种子培养结束，PH7.5 ;菌体浓度17.4% ; 镜检无杂菌；培养时间27.1h ；二级种子培养过程控制:符合移种条件的一级种子液由移种管道全部移入二级种子罐。罐压控制在0.02MPa;罐温28 29°C;空气流量^^!^/^^搅拌转速^乜/!^!!。二级种子培养结束，PH7.8 ;菌体浓度32.4% ;镜检无杂菌；培养时间37.4h。发酵培养基过程控制:发酵培养基灭菌后其脂肪含量为2.8%，将符合移种条件的二级种子液由移种管道全部移入发酵罐。罐压控制在0.05MPa ;发酵开始 130h:培养温度28°C、搅拌转速202r/min ；130h 发酵结束前:温度35°C、转速255r/min ；0h 组分转化前:空气流量1867m3/h ;组分转化期间:空气流量1554m3/h ;发酵过程中进行菌检，无其它杂菌。60h 组分转化前:菌体浓度40 43% ;组分转化期间:菌体浓度30 33% ;发酵结束，培养时间177.5h ；pH7.3 ;脂肪0.35% ;发酵过程中补豆油2453L ;补水27.3m3。泰乐菌素A组分83.2%;泰乐菌素C组份3.4%;总组分(泰乐菌素A+泰乐菌素B+泰乐菌素C+泰乐菌素D)95.8% ;发酵效价11741u/ml。上述补油、补水及酸碱度的控制方式同时实施例1。
权利要求
1.一种弗氏链霉菌发酵生产泰乐菌素的培养基，包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其特征在于上述一级种子培养基中含有花生饼粉和玉米油，二级种子培养基和发酵培养基中均含有混合鱼粉、花生饼粉和玉米油。
2.按照权利要求1所述的弗氏链霉菌发酵生产泰乐菌素培养基，其特征在于上述一级种子培养基的组成为:玉米油15 20ml/L、玉米蛋白粉10 20g/L、花生饼粉15 20g/L、玉米衆2 3g/L、磷酸氢二铵0.3 0.4g/L、碳酸I丐I 2g/L。
3.按照权利要求1所述的弗氏链霉菌发酵生产泰乐菌素的培养基，其特征在于上述二级种子培养基的组成为:玉米油15 20ml/L、玉米蛋白粉10 20g/L、花生饼粉15 20g/L、磷酸氢二铵0.3 0.4g/L、碳酸I丐I 2g/L、混合鱼粉10 15g/L、玉米衆2 3g/L。
4.按照权利要求1所述的弗氏链霉菌发酵生产泰乐菌素的培养基，其特征在于上述发酵培养基的组成为:玉米油25 30ml/L、玉米蛋白粉20 22g/L、花生饼粉10 12g/L、混合鱼粉6 8g/L、磷酸氢二铵0.1 0.2g/L、碳酸I丐2.5 3g/L、盐酸甜菜碱0.6 0.8g/L、氯化钴0.005 0.007g/L、氯化钾0.9 lg/L、氯化钠0.9 kg/L、硫酸镁0.8 0.9g/L0
5.一种利用权利要求1至4任意一项培养基的发酵方法，其工艺步骤包括: 1)一级种子培养:首先将一级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的弗氏链霉菌母瓶发酵液接入一级种子罐进行培养，接种量控制在一级种子培养基体积的5 10% ； 2)二级种子培养:先将二级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将一级种子液全部移入二级种子罐进行培养； 3)发酵培养:先将发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将二级种子液全部移入发酵罐进行培养。
6.按照权利要求5所述的发酵方法，其特征在于所述一级种子培养条件为:罐压0.02 0.04MPa ;罐温28 32 °C ;空气流量:0 12h，50 60m3/h ；12h 移种:120 130m3A ;搅拌转速100 120r/min ；pH6 8 ;培养时间20 30h。
7.按照权利要求5所述的发酵方法，其特征在于所述二级种子培养条件为:罐压0.02 0.04MPa ;罐温 28 33°C ;空气流量 1000 1100m3/h ;搅拌转速 150 160r/min ；pH值6 8 ;培养时间:30 40h。
8.按照权利要求5所述的发酵方法，其特征在于所述发酵培养条件为: a脂肪控制:发酵培养基灭菌后脂肪控制在2 3% ; b发酵开始 组分转化前:培养温度28 32°C、搅拌转速200 220r/min ； c组分转化开始 发酵结束:温度35 38°C、转速250 260r/min ； d发酵周期:培养时间160 180h ； e压力控制:罐压0.05 0.06MPa ； f pH控制:发酵过程中pH6.0 7.5 ; g无菌检查:发酵过程中进行菌检，要求无其它杂菌； h空气流量:0h 组份开始转化前:1800 1900m3/h ;组份转化开始 发酵结束:1500 1600m3/h o
9.按照权利要求5所述的发酵方法，其特征在于发酵过程中的移种条件为:a 一级种子液移种标准:一级种子培养结束，其菌体浓度15 25% ;pH值6 8 ;无其它杂菌污染； b 二级种子液移种标准:二级种子培养结束，其菌体浓度30 40% ;pH值6 8 ;周期30 40h ;无其它杂菌污染。
10.按照权利要求5所述的发酵方法，其特征在于发酵培养停止条件为: a发酵效价每6 8h取样检测,前、后检测的发酵单位相差在300u/ml以内； b泰乐菌素A组份> 86% ;泰乐菌素C组份< 1% ； c菌体浓度30 50% ； d发酵单位在13200u/mL以上； e pH 值 6.0 7.0 ; f脂肪在0.1 0.4%。
11.按照权利要求5所述的发酵方法，其特征是:在发酵过程中采用流加法进行补油、补水和补酸或碱。
全文摘要
本发明涉及一种弗氏链霉菌发酵生产泰乐菌素的培养基、发酵方法及利用其生产泰乐菌素的方法，其特征在于上述一级种子培养基含有花生饼粉、玉米油，二级种子培养基和发酵培养基中均含有混合鱼粉、花生饼粉和玉米油。本发明通过采用玉米油替代豆油；混合鱼粉和花生饼粉代替鱼粉，优化其培养基配方，从而解决了原辅料的成本问题，并且最大限度的降低原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现泰乐菌素稳定、高效的生产。同时利用该培养基可提高发酵单位、缩短发酵周期、提高泰乐菌素A组分。
文档编号C12P19/62GK103074402SQ20131004396
公开日2013年5月1日 申请日期2013年2月5日 优先权日2013年2月5日
发明者任勇, 冷晓红, 王友善, 奇乃, 董媛, 李小萍 申请人:宁夏泰瑞制药股份有限公司