专利名称：一种反应-吸附耦合固定化脂肪酶的制备方法
技术领域：
本发明属于固定化酶制备技术领域，特别涉及一种反应-吸附耦合固定化脂肪酶的制备方法。
背景技术：
脂肪酶是一种具有特殊催化功能的高效生物催化剂，它不仅催化生物体内化学反应，而且催化非生物体内的化学发应。但由于脂肪酶是水溶性的，在有机溶剂中易聚集成团，催化效率较低，且稳定性差，也不易回收重复利用，为了解决游离脂肪酶的缺陷，人们发明了酶固定化技术。在本发明之前，固定化酶基本都是在实验室使用，很难满足工业应用需要，这主要是因为现在市售固定化脂肪酶存在以下问题:1.固定化脂肪酶的载体制备和固定化过程分开进行，造成固定化过 程复杂，酶与载体的生物相容性较差；2.采用共价结合法固定化的脂肪酶，其固定化反应比较剧烈，容易造成酶的失活，导致固定化酶的活力降低；3.采用吸附交联法固定化的脂肪酶与载体之间的结合作用弱，容易造成酶脱落，从而使得固定化酶的稳定性差，使用寿命低。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述缺陷，提供一种反应-吸附耦合固定化脂肪酶的制备方法。本发明的技术方案是:一种反应-吸附耦合固定化脂肪酶的制备方法，其主要技术特征在于包括以下步骤:在固定化反应器中加入聚苯胺单体和蒸馏水使得溶液浓度为0.01 0.2mol/L，用酸调节溶液pH为1.0 7.0 ;充分搅拌至溶液充分混合均匀后，在-10°C 45°C条件下恒温静置；再向固定化反应器中加入事先在-10°C 45°C条件下恒温的引发剂和助剂，引发剂与单体浓度的摩尔比为1: 0.3 1: 5，助剂和单体浓度的摩尔比为1:1 1: 10，同时加入游离脂肪酶，单体质量与脂肪酶质量比为1: 0.01 1: 0.1 ;然后搅拌使整个体系混合均匀，放置于-10°C 45°C恒温条件下反应；反应结束后，分别用蒸馏水、无水乙醇过滤洗涤多次至滤液无色，然后将产物真空干燥或冷冻干燥，得到固定化酶。本发明的优点和效果在于:制备载体的同时加入游离酶使得固定化过程简单，条件温和，时间较短，能耗低；固定化酶的蛋白吸附量高，酶活力好，对环境友好；固定化的酶稳定性好，使用寿命长，生物相容性好，能耗低，固定化后酶活力高、稳定性好、使用寿命长，以满足工业化生产需求。本发明方法制备固定化脂肪酶的工艺简单，载体价廉易得，成本较低、低能耗以及高活性，有利于大规模的工业化生产，且操作简单。
具体实施方式
以下将通过具体的实施例进一步阐述本说明，但本发明技术方案不局限于以下所列的具体实施方式
。所述的单体为苯胺及苯胺衍生物，包括苯胺、邻苯二胺、邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯胺、邻氯苯胺、间氯苯胺、邻甲氧基苯胺、邻琉基苯胺的一种或几种。调节单体溶液pH值的酸为无机酸，包括盐酸、硫酸、醋酸、硝酸、磷酸的一各或几种。所述的引发剂有(NH4)2S208、K2Cr207、K103、FeCl3、FeCl4、H202、Ce(S04)2、AlCl3、Mn02、HAuCl4的一种或几种。所述的助剂有F127 (EO7qPOiqqEO7q)、十二烷基苯磺酸钠、丁基萘磺酸钠、二甲基二烯丙基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵。所述脂肪酶微生物来源为假丝酵母、曲霉、青霉、根毛霉、嗜热真菌、毛霉、芽孢杆菌、假单胞菌、色杆菌或伯克氏菌。下面是具体实施例。实施例1:在固定化反应器中加入邻苯二胺和蒸馏水使得溶液浓度为0.0lmol/L，滴加稀盐酸调节溶液PH为7.0 ;充分搅拌至溶液充分混合均匀后，(TC条件下恒温静置；再向固定化反应器中加入事先在0°C条件下恒温的引发剂(NH4)2S2O8、助剂十二烷基苯磺酸钠，(NH4)2S2O8与邻苯二胺浓度的摩尔比为1: 0.3，十二烷基苯磺酸钠和邻苯二胺浓度的摩尔比为1: 5，同时加入游离脂肪酶，邻苯二胺质量与脂肪酶用量比为1: 0.01;然后搅拌使整个体系混合均匀，放置于0°C恒温条件下反应；反应时间为12h，反应结束后，分别用蒸馏水、无水乙醇过滤洗涤多次 至滤液无色，然后将产物冷冻干燥12h，所得的固定化酶酶活比游离酶提高了 4.3倍。将使用过的固定化酶经洗涤干燥后可重复利用。实施例2:在固定化反应器中加入苯胺和蒸馏水使得溶液浓度为0.03mol/L，滴加稀醋酸调节溶液PH为7.0 ;充分搅拌至溶液充分混合均匀后，10°C条件下恒温静置；再向固定化反应器中加入事先在10°C条件下恒温的引发剂FeCl4，助剂丁基萘磺酸钠，FeCl4与苯胺浓度的摩尔比为1: 1，丁基萘磺酸钠和苯胺浓度的摩尔比为1: 2，同时加入游离脂肪酶，苯胺质量与脂肪酶用量比为1: 0.04;然后搅拌使整个体系混合均匀，放置于10°C恒温条件下反应；反应时间为14h，反应结束后，分别用蒸馏水、无水乙醇过滤洗涤多次至滤液无色，然后将产物冷冻干燥18h，所得的固定化酶酶活比游离酶提高了 3.6倍。将使用过的固定化酶经洗涤干燥后可重复利用。实施例3:在固定化反应器中加入邻甲苯胺和蒸馏水使得溶液浓度为0.lmol/L，滴加稀盐酸溶液PH为6.0 ;充分搅拌至溶液充分混合均匀后，_5°C条件下恒温静置；再向固定化反应器中加入事先在_5°C条件下恒温的引发剂HAuCl4，助剂F127，HAuCl4与邻甲苯胺浓度的摩尔比为1: 2，F127和邻甲苯胺浓度的摩尔比为1: 3，同时加入游离脂肪酶，邻甲苯胺质量与脂肪酶用量比为1: 0.08;然后搅拌使整个体系混合均匀，放置于-5°C恒温条件下反应；反应时间为15h，反应结束后，分别用蒸馏水、无水乙醇过滤洗涤多次至滤液无色，然后将产物放置于真空干燥箱中在25°C、0MPa条件下干燥24h，所得的固定化酶酶活比游离酶提高了 4.0倍。将使用过的固定化酶经洗涤干燥后可重复利用。实施例4:在固定化反应器中加入邻甲氧基苯胺和蒸馏水使得溶液浓度为0.2mol/L，滴加稀盐酸溶液PH为5.0 ;充分搅拌至溶液充分混合均匀后，4°C条件下恒温静置；再向固定化反应器中加入事先在4°C条件下恒温的引发剂MnO2，助剂二甲基二烯丙基氯化铵，MnO2与邻甲氧基苯胺浓度的摩尔比为1: 3，二甲基二烯丙基氯化铵和邻甲氧基苯胺浓度的摩尔比为1: 4，同时加入游离脂肪酶，邻甲氧基苯胺质量与脂肪酶用量比为1: 0.05;然后搅拌使整个体系混合均匀，放置于4°C恒温条件下反应；反应时间为16h，反应结束后，分别用蒸馏水、无水乙醇过滤洗涤多次至滤液无色，然后将产物冷冻干燥8h，所得的固定化酶酶活比游离酶提高了 3.0倍。将使用过·的固定化酶经洗涤干燥后可重复利用。实施例5:在固定化反应器中加入邻氯苯胺和蒸馏水使得溶液浓度为0.05mol/L,滴加稀硫酸调节溶液PH为7.0 ;充分搅拌至溶液充分混合均匀后，15°C条件下恒温静置；再向固定化反应器中加入事先在15°C条件下恒温的引发剂H2O2，助剂十六烷基三甲基溴化铵，H2O2与邻氯苯胺浓度的摩尔比为1: 0.7，十六烷基三甲基溴化铵和邻氯苯胺浓度的摩尔比为I: 10，同时加入游离脂肪酶，邻氯苯胺质量与脂肪酶用量比为1: 0.02;然后搅拌使整个体系混合均匀，放置于15°C恒温条件下反应；应时间为16h，反应结束后，分别用蒸馏水、无水乙醇过滤洗涤多次至滤液无色，然后将产物放置于真空干燥箱中在35°C、-0.1MPa条件下干燥24h，所得的固定化酶酶活比游离酶提高了 4.1倍。将使用过的固定化酶经洗涤干燥后可重复利用。实施例6:在固定化反应器中加入邻苯二胺和蒸馏水使得溶液浓度为0.05mol/L,滴加稀盐酸溶液PH为6.0 ;充分搅拌至溶液充分混合均匀后，5°C条件下恒温静置；再向固定化反应器中加入事先在5°C条件下恒温的引发剂K2Cr2O7、助剂十二烷基苯磺酸钠，K2Cr2O7与邻苯二胺浓度的摩尔比为1: 2，十二烷基苯磺酸钠和邻苯二胺浓度的摩尔比为1: 5，同时加入游离脂肪酶，邻苯二胺质量与脂肪酶用量比为1: 0.05;然后搅拌使整个体系混合均匀，放置于5°C恒温条件下反应；反应时间为20h，反应结束后，分别用蒸馏水、无水乙醇过滤洗涤多次至滤液无色，然后将产物冷冻干燥12h，所得的固定化酶酶活比游离酶提高了 3.2倍。将使用过的固定化酶经洗涤干燥后可重复利用。实施例7:在固定化反应器中加入邻甲苯胺和蒸馏水使得溶液浓度为0.14mol/L，滴加稀醋酸调节溶液pH为7.0 ;充分搅拌至溶液充分混合均匀后，-10°C条件下恒温静置；再向固定化反应器中加入事先在-10°C条件下恒温的引发剂(NH4)2S2O8、助剂F127，(NH4)2S2O8与邻甲苯胺浓度的摩尔比为1: 0.6，F127和邻甲苯胺浓度的摩尔比为1: 1，同时加入游离脂肪酶，邻甲苯胺质量与脂肪酶用量比为1: 0.06;然后搅拌使整个体系混合均匀，放置于-10°C恒温条件下反应；反应时间为18h，反应结束后，分别用蒸馏水、无水乙醇过滤洗涤多次至滤液无色，然后将产物放置于真空干燥箱中在45°C、_0.05MPa条件下干燥10h，所得的固定化酶酶活比游离酶提高了 3.0倍。将使用过的固定化酶经洗涤干燥后可重复利用。实施例8:
在固定化反应器中加入间氯苯胺和蒸馏水使得溶液浓度为0.18mol/L，滴加稀硝酸溶液调节PH为5.0 ;充分搅拌至溶液充分混合均匀后，20°C条件下恒温静置；再向固定化反应器中加入事先在20°C条件下恒温的引发剂FeCl3，助剂十六烷基三甲基溴化铵，FeCl3与间氯苯胺浓度的摩尔比为1: 5，十六烷基三甲基溴化铵和间氯苯胺浓度的摩尔比为I: 8，同时加入游离脂肪酶，间氯苯胺质量与脂肪酶用量比为1: 0.07;然后搅拌使整个体系混合均匀，放置于20°C恒温条件下反应；反应时间为19h，反应结束后，分别用蒸馏水、无水乙醇过滤洗涤多次至滤液无色，然后将产物冷冻干燥13h，所得的固定化酶酶活比游离酶提高了 3.8倍。将使用过的固定化酶经洗涤干燥后可重复利用。实施例9:在固定化反应器中加入对甲苯胺和蒸馏水使得溶液浓度为0.12mol/L，滴加稀硫酸溶液调节pH为4.0 ;充分搅拌至溶液充分混合均匀后，(TC条件下恒温静置；再向固定化反应器中加入事先在0°C条件下恒温的引发剂KIO3，助剂丁基萘磺酸钠，KIO3与对甲苯胺浓度的摩尔比为1: 2，丁基萘磺酸钠和对甲苯胺浓度的摩尔比为1: 7，同时加入游离脂肪酶，对甲苯胺质量与脂肪酶用量比为1: 0.1;然后搅拌使整个体系混合均匀，放置于(TC恒温条件下反应；反应时间为18h，反应结束后，分别用蒸馏水、无水乙醇过滤洗涤多次至滤液无色，然后将产物冷冻干燥24h，所得的固定化酶酶活比游离酶提高了 4.1倍。将使用过的固定化酶经洗涤干燥后可重复利用。
实施例10:在固定化反应器中加入邻琉苯胺和蒸馏水使得溶液浓度为0.09mol/L,滴加稀盐酸溶液调节PH为1.0 ;充分搅拌至溶液充分混合均匀后，45°C条件下恒温静置；再向固定化反应器中加入事先在45°C条件下恒温的引发剂Ce(SO4)2，助剂十二烷基苯磺酸钠，Ce(SO4)2与邻琉苯胺浓度的摩尔比为1: 4，十二烷基苯磺酸钠和邻琉苯胺浓度的摩尔比为1: 6，同时加入游离脂肪酶，邻琉苯胺质量与脂肪酶用量比为1: 0.03 ;然后搅拌使整个体系混合均匀，放置于45°C恒温条件下反应；应时间为24h，反应结束后，分别用蒸馏水、无水乙醇过滤洗涤多次至滤液无色，然后将产物放置于真空干燥箱中在40°C、-0.03MPa条件下干燥12h，所得的固定化酶酶活比游离酶提高了 4.3倍。将使用过的固定化酶经洗涤干燥后可重复利用。实施例11:在固定化反应器中加入间甲苯胺和蒸馏水使得溶液浓度为0.llmol/L，滴加稀磷酸溶液调节PH为6.0 ;充分搅拌至溶液充分混合均匀后，15°C条件下恒温静置；再向固定化反应器中加入事先在15°C条件下恒温的引发剂AlCl3、助剂十二烷基苯磺酸钠，AlCl3与间甲苯胺浓度的摩尔比为1: 3，十二烷基苯磺酸钠和间甲苯胺浓度的摩尔比为1: 6，同时加入游离脂肪酶，间甲苯胺质量与脂肪酶用量比为1: 0.07 ;然后搅拌使整个体系混合均匀，放置于15°C恒温条件下反应；反应时间为21h，反应结束后，分别用蒸馏水、无水乙醇过滤洗涤多次至滤液无色，然后将产物冷冻干燥16h，所得的固定化酶酶活比游离酶提高了
4.7倍。将使用过的固定化酶经洗涤干燥后可重复利用。实施例12:在固定化反应器中加入邻氯苯胺和蒸馏水使得溶液浓度为0.15mol/L，滴加稀硝酸溶液调节PH为4.0 ;充分搅拌至溶液充分混合均匀后，(TC条件下恒温静置；再向固定化反应器中加入事先在0°c条件下恒温的引发剂(NH4)2S2O8、助剂十六烷基三甲基溴化铵，(NH4)2S2O8与邻氯苯胺浓度的摩尔比为1: 4，十六烷基三甲基溴化铵和邻氯苯胺浓度的摩尔比为1: 8，同时加入游离脂肪酶，邻氯苯胺质量与脂肪酶用量比为1: 0.08;然后搅拌使整个体系混合均匀，放置于0°C恒温条件下反应；反应时间为23h，反应结束后，分别用蒸馏水、无水乙醇过滤洗涤多次至滤液无色，然后将产物放置于真空干燥箱中在10°C、_0.02MPa条件下干燥18h，所得的固定化酶酶活比游离酶提高了 4.2倍。将使用过的固定化酶经洗涤干燥后可 重复利用。
权利要求
1.一种反应-吸附耦合固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤:在固定化反应器中加入聚苯胺单体和蒸馏水使得溶液浓度为0.0l 0.2mol/L，用酸调节溶液pH为1.0 7.0 ;充分搅拌至溶液充分混合均匀后，在-10°C 45°C条件下恒温静置；再向固定化反应器中加入事先在-10°C 45°C条件下恒温的引发剂和助剂，引发剂与单体浓度的摩尔比为1: 0.3 1: 5，助剂和单体浓度的摩尔比为1:1 1: 10，同时加入游离脂肪酶，单体质量与脂肪酶质量比为1:0.01 1: 0.1;然后搅拌使整个体系混合均匀，放置于-10°C 45°C恒温条件下反应；反应结束后，分别用蒸馏水、无水乙醇过滤洗涤多次至滤液无色，然后将产物真空干燥或冷冻干燥，得到固定化酶。
2.根据权利要求1所述的一种反应-吸附耦合固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于所述的单体为苯胺及苯胺衍生物，包括苯胺、邻苯二胺、邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯胺、邻氯苯胺、间氯苯胺、邻甲氧基苯胺、邻琉基苯胺的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的一种反应-吸附耦合固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于调节单体溶液pH值的酸为无机酸，包括盐酸、硫酸、醋酸、硝酸、磷酸的一各或几种。
4.根据权利要求1所述的一种反应-吸附耦合固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于所述的引发剂有(NH4)2S2O8' K2Cr2O7, K103、FeCl3' FeCl4' H2O2' Ce (SO4) 2、AlCl3' MnO2, HAuCl4的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的一种反应-吸附耦合固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于所述的助剂有F127、 十二烷基苯磺酸钠、丁基萘磺酸钠、二甲基二烯丙基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵。
6.根据权利要求1所述的一种反应-吸附耦合固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于真空干燥温度为10°c 45°C，真空度为O -0.1MPa0
7.根据权利要求1所述的一种反应-吸附耦合固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于所述脂肪酶微生物来源为假丝酵母、曲霉、青霉、根毛霉、嗜热真菌、毛霉、芽孢杆菌、假单胞囷、色杆囷或伯克氏囷。
8.根据权利要求1所述的一种反应-吸附耦合固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于单体质量与脂肪酶放置于-10°C 45°C恒温条件下反应的反应时间为12 24h。
9.根据权利要求1所述的一种反应-吸附耦合固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于将产物真空干燥或冷冻干燥8 24h，得到固定化酶。
全文摘要
本发明涉及一种反应-吸附耦合固定化脂肪酶的制备方法。本发明的技术方案是在制备聚苯胺载体同时加入脂肪酶进行吸附的反应-吸附耦合固定化脂肪酶方法，本发明为以苯胺及苯胺衍生物为单体，加入引发剂和助剂，同时加入需固定化的游离脂肪酶，放置于恒温条件下反应，过滤洗涤得到以聚苯胺为载体的固定化脂肪酶。本发明克服了传统的固定化方法存在的固定化过程复杂，酶与载体的生物相容性较差，反应比较剧烈，容易造成酶的失活，导致固定化酶的活力降低，容易造成酶脱落，稳定性差，使用寿命低等缺陷。本发明具有固定化过程简单，条件温和，效率高，固定化酶的蛋白吸附量高，酶活力好，固定化的酶稳定性好，使用寿命长。
文档编号C12N11/08GK103088011SQ20131005067
公开日2013年5月8日 申请日期2013年2月6日 优先权日2013年2月6日
发明者熊健, 候丽云, 黄亚娟, 张华 申请人:扬州大学