专利名称：用乌头酸酶表达弱化和/或酶活性降低的细菌发酵生产l-赖氨酸的方法
技术领域：
本发明属于氨基酸发酵领域，具体而言，本发明涉及发酵生产L-赖氨酸的方法及其衍生的方法和应用，和可以用在这些方法和应用中的多核苷酸、载体和细菌。
背景技术：
通过产L-赖氨酸的细菌(如，埃希氏菌属的大肠杆菌和棒杆菌属的杆状细菌)发酵来生产L-赖氨酸已经得到了产业化应用。这些细菌，可以是从自然界分离的细菌，也可以是通过诱变或基因工程改造获得的细菌，或者两者兼而有之。当前的文献报道中，通过基因工程改造的注意力主要集中在pnt、dap及ppc等基因上，未见为了 L-赖氨酸生产而关注乌头酸酶(如，乌头酸酶A)及其编码基因。乌头酸酶是三羧酸循环中的一个酶，该酶催化两步化学反应，分别为柠檬酸转化为乌头酸以及乌头酸转化为异柠檬酸。目前已知在埃希氏菌中，acnA基因(其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示)编码乌头酸酶A，但是可能是由于其代谢距离最终的L-赖氨酸产物太远，中间代谢分支太多且复杂，而在L-赖氨酸发酵中一直未引起人们的重视。本发明人经过长期研究和实践，尤其凭借了一些运气，偶然发现acnA基因的改造能够有助于提高L-赖氨酸的产量；然而，现有技术要么通过增加拷贝和/或定点突变导入表达量和/或酶活性提高的有益的酶基因，要么通过敲除不利的基因以使之酶活性和/或表达量消失，但是与之不同的是，本发明人发现，acnA基因不能简单地提高或敲除，尤其是敲除后使得细菌生长困难，难以实际应用，因此开发了新的针对acnA基因调控的方法，以此来提高L-赖氨酸的产量，而且该方法与现有改造的大量高产L-赖氨酸的细菌的染色体改造位点没有冲突，可以叠加提高的效果，从而在实践上可用于细菌发酵生产L-赖氨酸。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供新的发酵生产L-赖氨酸的方法及其相关的方法，包括相对于未改造细菌提高L-赖氨酸的发酵生产量的方法，改造的细菌在发酵生产L-赖氨酸中的应用，改造的细菌在相对于未改造细菌提高L-赖氨酸的发酵生产量的应用，和/或，改造细菌的方法等。另外，本发明还提供了可以用于上述方法中的多核苷酸、载体和/或细菌等。具体而言，在第一方面，本发明提供了发酵生产L-赖氨酸的方法，其包括:(I)改造细菌染色体上的野生型的acnA基因，使改造获得的细菌的乌头酸酶A的表达量和/或酶活性降低但不消失；和，(2)用步骤(I)改造而得到的细菌发酵生产L-赖氨酸。
在本文中，术语“改造”指的是是相应被改造的对象发生变化，从而达到一定的效果。改造位于染色体上的基因的手段包括但是不限于，诱变、定点突变、和/或同源重组，优选是后两者。这些技术手段广泛记载于分子生物学和微生物学文献中，有许多甚至已经商品化了。在本发明的具体实施方式
中，根据同源重组的原理，采用Addgene公司商品化的PKOV质粒系统来进行改造，将未改造细菌染色体上的野生型的acnA基因，改造成能够使改造获得的细菌的乌头酸酶A的表达量和/或酶活性降低但不消失的新的acnA基因。因此，在本文文中，优选改造是通过同源重组进行的改造。本发明人经过长期研究发现，使得acnA基因所编码的乌头酸酶A的表达量消失，或使得acnA基因所编码的乌头酸酶A的酶活性消失，都将造成细菌本身生长困难，甚至无法生长/繁殖。因此，本发明的“改造”要相对于未改造的细菌，使改造获得的细菌的乌头酸酶A的表达量和/或酶活性降低但不消失，优选使改造获得的细菌的乌头酸酶A的表达量和/或酶活性降低20 % 95 %，更优选降低50 % 90 %，如降低65 %、70 %或80 %。相应地，本发明还提供了其他应用或方法。例如，在第二方面，本发明提供了提高L-赖氨酸的发酵量的方法,其包括:(I)改造细菌染色体上的野生型的acnA基因，使改造获得的细菌的乌头酸酶A的表达量和/或酶活性降低但不消失；和，(2)用步骤(I)改造而得到的细菌发酵产生L-赖氨酸。L-赖氨酸作为细菌的重要代谢产物，大多数细菌或多或少都能够发酵产生一定量的L-赖氨酸。尽管低产L-赖氨酸的细菌不适合有经济效益地生产L-赖氨酸，但是通过本发明的方法，仍旧能提高L-赖氨酸的发酵量，仍旧可以供对经济效益不敏感的地方使用。当然，在本文中，优选细菌是高产L-赖氨酸的细菌。通过本发明的方法，可以进一步提高其产量。另外，在本发明的方法或应用中，除了改造细菌染色体上的野生型的acnA基因以外，可以不再进行其他改造。例如，尤其对于高产L-赖氨酸的细菌来说，仅仅改造细菌染色体上的野生型的acnA基因。又如，在第三方面，本发明提供了改造获得的细菌在发酵生产L-赖氨酸中的应用，其中，所述改造获得是改造细菌染色体上的野生型的acnA基因而获得，而且使改造获得的细菌的乌头酸酶A的表 达量和/或酶活性降低但不消失。改造获得的细菌可以单独应用于发酵生产L-赖氨酸中，也可以和其他产L-赖氨酸的细菌混合发酵生产L-赖氨酸，或者以其他方式应用于发酵生产L-赖氨酸中。在本文中，如无特别限定(如未以“改造获得”来限定)，术语“细菌”是未改造或改造前的细菌，其染色体的acnA基因座位上的基因是野生型的acnA基因。还如，在第四方面，本发明提供了改造获得的细菌在提高L-赖氨酸的发酵生产量的应用，其中，所述改造获得是改造细菌染色体上的野生型的acnA基因而获得，而且使改造获得的细菌的乌头酸酶A的表达量和/或酶活性降低但不消失。在本文中，细菌优选是埃希氏菌属细菌,更优选是大肠杆菌,如大肠杆菌K-12菌株的后续菌株，包括W3110衍生的菌株。由于现有技术几乎没有在L-赖氨酸生产/发酵中关注过细菌的acnA基因，改造的染色体的基因大多集中于pnt、dap及ppc等基因位点上，因此现有技术中的细菌(尤其是埃希氏菌属细菌，如大肠杆菌)没有被报道不带有野生型的acnA基因。在本发明的具体实施方式
中，无论高产还是低产L-赖氨酸的细菌，只要带有野生型的acnA基因，通过本发明的方法进行改造，就能使得L-赖氨酸的发酵量得到提高。更本质地，在第五方面，本发明提供了改造细菌的方法，其包括改造所述细菌染色体上的野生型的acnA基因，使改造获得的细菌的乌头酸酶A的表达量和/或酶活性降低但不消失。本发明第五方面的方法改造而获得的细菌能够用于发酵生产或产生L-赖氨酸。因此，在第六方面，本发明提供了本发明第五方面的方法改造而获得的细菌。埃希氏菌属细菌(如，大肠杆菌)中绝大多数的野生型的acnA基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，而且本发明的具体实施方式
也证实了在多种染色体上带有如SEQ IDNo:1所示的野生型的acnA基因的细菌上实施本发明的改造，都能提高L-赖氨酸的发酵量。所以优选在本文中，所述野生型的acnA基因的核苷酸序列如SEQ ID No:l所示。经过本发明人研究和证实，更优选地，在本文中，所述改造细菌染色体上的野生型的acnA基因是将所述细菌的野生型的acnA基因的起始密码子突变。例如，将野生型的acnA基因的起始密码子ATG突变，如将如SEQ ID No:1所示的野生型的acnA基因的起始密码子ATG突变为GTG。也经过本发明人研究和证实，更优选地，在本文中，所述改造细菌染色体上的野生型的acnA基因是将所述细菌的野生型的acnA基因缺失1-120个核苷酸，优选缺失1_90个核苷酸，最优选缺失90个核苷酸，如在所述野生型的acnA基因的终止密码子前缺失90个核苷酸。在本发明的具体实施方式
中，在如SEQ ID No:1所示的野生型的acnA基因的终止密码子前缺失90个核苷酸。另外，本发明还提供了可以用于上述方法中的多核苷酸和/或载体等物质。例如，在第七方面，本发明提供了多核苷酸，所述多核苷酸选自，(a)野生型的acnA基因(优选其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示)的起始密码子突变而获得的多核 苷酸，优选所述突变是将ATG突变为GTG ;和，(b)野生型的acnA基因(优选其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示)缺失1_120个核苷酸而获得的多核苷酸，优选野生型的acnA基因缺失1-90个核苷酸而获得的多核苷酸，更优选野生型的acnA基因缺失90个核苷酸而获得的多核苷酸，例如野生型的acnA基因的终止密码子前缺失90个核苷酸而获得的多核苷酸。又如，在第八方面，本发明提供了载体，其包含本发明第七方面的多核苷酸。本发明的有益效果在于，开辟并且实践证明了新的提高L-赖氨酸的发酵量的方式，对于高产和低产L-赖氨酸的细菌都适用，而且与现有改造的大量高产L-赖氨酸的细菌的染色体改造位点没有冲突，观察到了可以叠加提高产量的效果，从而在实践上可用于细菌发酵生产L-赖氨酸，便于推广应用。为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
具体实施例方式以下通过实施例进一步说明本发明的内容。如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《分子克隆实验指南(第3版)》(科学出版社)、《微生物学实验(第4版)》(高等教育出版社)以及相应仪器和试剂的厂商说明书等参考。构建实施例1替换acnA的起始密码子ATG为GTG以抽提的野生型大肠杆菌E.coli K12W3110菌株(可购自日本技术评价研究所生物资源中心(NITE Biological Resource Center, NBRC))基因组染色体为模板，以引物Pl和P2、P3和P4分别进行PCR扩增，获得长度分别为510bp和620bp的两条DNA片段(分别命名为Upl和Downl片段)。其中，PCR按如下方式进行:94°C变性30s (秒)，52°C退火30s (秒)，以及72°C延伸30s (秒)(30个循环)。其中，引物序列如下:Pl:5’ -CGCGGATCCGGAGTCGTCACCATTATGCC-3’ (下划线表明 BamHI 酶切位点)P2:5’ -TCTCGTAGGGTTGACGACASAGCTCCTCCTTAATGACAGG-3’ (下划线表明点突变)P3:5’ -CCTGTCATTAAGGAGGAGCTeTGTCGTCAACCCTACGAGA-3’ (下划线表明点突变)P4:5’ -ATTGCGGCCGCCCATTCACCGTCCTGCAAT-3> (下划线表明 NotI 酶切位点)将上述两条D N A片段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，再以上述两条D N A片段混合为模板，以Pl和P4为引物，通过Overlap PCR扩增长约1200bp的片段(命名为Up-Downl片段)。其中，PCR按如下方式进行:94°C变性30s(秒)，52°C退火30s(秒)，以及72°C延伸60s (秒)(30个循环)。将琼脂糖凝胶电泳分离纯化后的Up-Down I和pKOV质粒(可购自Addgene公司)分别用BamHI/Notl双酶切，经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后连接，获得用于导入的载体pKOV-Up-Downl，并将载体pKOV-Up-Downl送测序公司进行测序鉴定，表明其含有正确点突变(A-G)的acnA基因片段，保存备用。将构建好的pK0V-Up-Downl质粒分别电转化入低产L-赖氨酸的E.coliNRRLB-12185菌株(可购自美国农业菌种保藏中心(Agricultural Research ServiceCulture Collection ；NRRL);其构建方法可参见US4346170A)和高产L-赖氨酸的E.coliK12W3110A3菌株(可购自中科院微生物研究所，其为经E.coli K12W3110诱变突变得到的赖氨酸生产工程菌)(经测序确认这两个菌株染色体上均保留有野生型的acnA基因(即Genbank等录号U00096.2中的1333855至1336530位)及其上下游元件)，于30°C、IOOrpm,在LB培养基中复苏2h后，根据Addgene公司的pKOV质粒的商品指南，挑选出同源重组阳性的单克隆，经测序确认其染色体上的野生型acnA基因的起始密码子由ATG突变为GTG，分别得到acnA起始密码子突变的(低/高产L-赖氨酸)大肠杆菌。经检测，获得的两个菌株的乌头酸酶表达量下降了约75 85% (在不同培养基中略有差异)。构建实施例2acnA基因序列突变降低乌头酸酶活性缺失终止密码子前90bp碱基以降低乌头酸酶活性。具体而言，以抽提的野生型大肠杆菌E.coli K12W3110基因组染色体为模板，以引物P5和P6、P7和P8分别进行PCR扩增，获得长度分别为752bp和657bp的两条DNA片段(Up3和Down3片段)。其中，PCR按如下方式进行:94°C变性30s (秒)，52°C退火30s (秒)，以及72°C延伸30s (秒)(30个循环)。其中，引物序列如下:P5:5’ -CGCGGATCCCGTCACACGATCCGATACCT-3’ (下划线表明 BamHI 酶切位点)P6:5’ -CGGCAAGCAAATAGTTGTTATACGACTTCCTGGCTACCAT-3’ (下划线表明点突变)P7:5’ -ATGGTAGCCAGGAAGTCGTATAACAACTAITTGCTTGCCG-3’ (下划线表明点突变)P8:5’ -ATTGCGGCCGCCATGGGGCGATTTCCTGATG-3> (下划线表明 NotI 酶切位点)
将上述两条D N A片段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，再以上述两条D N A片段混合为模板，以P5和P8为引物，通过Overlap PCR扩增长约1400bp的片段(命名为Up-Down2片段)。其中，PCR按如下方式进行:94°C变性30s(秒)，52°C退火30s(秒)，以及72°C延伸60s (秒)(30个循环)。将琼脂糖凝胶电泳分离纯化后的Up_Down2和pKOV质粒(可购自Addgene公司)分别用BamHI/Notl双酶切，经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后连接，获得用于导入的载体pK0V-Up-Down2,并将载体pK0V-Up-Down2送测序公司进行测序鉴定，表明其含有终止密码子前90bp碱基缺失的acnA基因片段，保存备用。根据Addgene公司的pKOV质粒的商品指南,将构建好的pK0V_Up-Down2质粒分别电转化入低产L-赖氨酸的E.coli NRRL B-12185菌株(可购自美国农业菌种保藏中心(Agricultural Research Service Culture Collection ；NRRL);其构建方法可参见US4346170A)和高产L-赖氨酸的E.coli K12W3110A3菌株(可购自中科院微生物研究所，其为经E.coli K12W3110诱变突变得到的赖氨酸生产工程菌)(经测序确认这两个菌株染色体上均保留有野生型的acnA基因及其上下游元件)，挑选出同源重组阳性的单克隆，经测序确认其染色体上的野生型acnA基因的终止密码子前90bp碱基缺失，分别得到acnA酶活性降低的(低/高产L-赖氨酸)大肠杆菌。经检测，获得的两个菌株的乌头酸酶酶活性下降了约60 80% (在不同培养基中略有差异)。效果实施例赖氨酸发酵实验将E.coli K12W3110 Δ 3 菌株、E.coli NRRL B-12185 菌株以及实施例1 和 2 的菌株分别接种在25mL表I所述的种子培养基中，于37°C、220rpm培养9h。然后取ImL种子培养基的培养物接种在25mL表I所述的发酵培养基中，于37°C、220rpm培养培养48h。当培养完成时，通过HPLC测定L-赖氨酸的产生。`表I培养基配方
权利要求
1.发酵生产L-赖氨酸的方法，其包括: (1)改造细菌染色体上的野生型的acnA基因，使改造获得的细菌的乌头酸酶A的表达量和/或酶活性降低但不消失；和， (2)用步骤(I)改造而得到的细菌发酵生产L-赖氨酸。
2.提高L-赖氨酸的发酵量的方法，其包括: (1)改造细菌染色体上的野生型的acnA基因，使改造获得的细菌的乌头酸酶A的表达量和/或酶活性降低但不消失；和， (2)用步骤(I)改造而得到的细菌发酵产生L-赖氨酸。
3.改造获得的细菌在发酵生产L-赖氨酸中的应用，其中，所述改造获得是改造细菌染色体上的野生型的acnA基因而获得，而且使改造获得的细菌的乌头酸酶A的表达量和/或酶活性降低但不消失。
4.改造获得的细菌在提高L-赖氨酸的发酵量的应用，其中，所述改造获得是改造细菌染色体上的野生型的acnA基因而获得，而且使改造获得的细菌的乌头酸酶A的表达量和/或酶活性降低但不消失。
5.改造细菌的方法，其包括改造所述细菌染色体上的野生型的acnA基因，使改造获得的细菌的乌头酸酶A的表达量和/或酶活性降低但不消失。
6.权利要求1-5之任一所述的方法或应用，其中，所述野生型的acnA基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1 所示。
7.权利要求1-6之任一所述的方法或应用，其中，所述改造细菌染色体上的野生型的acnA基因是， (a)将所述细菌的野生型的acnA基因的起始密码子突变，优选将所述起始密码子ATG突变为GTG ;和/或， (b)将所述细菌的野生型的acnA基因缺失1-120个核苷酸，优选缺失1_90个核苷酸，最优选缺失90个核苷酸，如在所述野生型的acnA基因的终止密码子前缺失90个核苷酸。
8.权利要求1-7之任一所述的方法或应用，其中，所述细菌是埃希氏菌属细菌，优选是大肠杆菌。
9.权利要求5所述的方法改造而得到的细菌。
10.多核苷酸或包含其的载体，所述多核苷酸选自， (a)野生型的acnA基因的起始密码子突变而获得的多核苷酸，优选所述突变是将ATG突变为GTG ;和， (b)野生型的acnA基因缺失1_120个核苷酸而获得的多核苷酸，优选野生型的acnA基因缺失1-90个核苷酸而获得的多核苷酸，更优选野生型的acnA基因缺失90个核苷酸而获得的多核苷酸，例如野生型的acnA基因的终止密码子前缺失90个核苷酸而获得的多核苷酸。
全文摘要
本发明提供了发酵生产L-赖氨酸的方法，其包括改造细菌使其乌头酸酶A的表达量和/或酶活性降低但不消失；和，用改造的细菌发酵生产L-赖氨酸。另外，本发明还提供了由该方法衍生的方法和应用，以及可以用在这些方法和应用中的多核苷酸、载体和细菌。
文档编号C12N1/21GK103146772SQ20131005014
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月8日 优先权日2013年2月8日
发明者马吉银, 温廷益, 陈金龙, 梁勇, 刘树文, 魏爱英, 杨立鹏, 孟刚, 任瑞 申请人:宁夏伊品生物科技股份有限公司