专利名称：一株嗜铅菌的克隆与培养的制作方法
技术领域：
本发明涉及高效吸附铅菌株的筛选，PCR方法进行鉴定，目的菌在体内外环境中吸附效率的测定，动物铅中毒造模，ICP-MS法测定Pb2+含量，所筛选的乳酸菌吸附效率高，检测方法检出限低，灵敏度高。
背景技术：
环境持久性污染物尤其是重金属对空气、水源及土壤的污染日趋严重已成为不争事实。重度污染区域的饮水，蔬菜、水果和粮食等农作物，以及动物源食品中重金属含量超标已在所难免。如何阻抗和减少重金属在动物和人体内的蓄积与危害是亟待解决的重大课题。因此，我们团队开展了本项研究。目的菌的筛选与鉴定采用传统的技术和快速鉴定技术相结合，使用乳酸菌选择性培养基，并在其中添加不同浓度的Pb2+，初步筛选出具有高抗铅性和高吸附性的菌株，经过生化鉴定试剂盒和16SrDNA序列分析法对筛选的菌株进行鉴定。16SrDNA扩增使用通用引物，PCR扩增片段约为1500bp，命名为Q dk/m-1
所筛选的目的菌在体内外吸附试验中，吸附效率高，体外吸附试验模拟胃肠道环境。而体内吸附试验使用家兔作为试验对象，首先是铅中毒造模阶段，造模成功后，按照动物体重饲喂铅清除剂。与原子吸收光谱法、原子荧光光谱法、原子发射光谱法相比，电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)测定Pb2+检出限低、灵敏度和精密度高、选择性好以及可以同时检测多元素，被认为是目前最灵敏的检测方法，已经广泛应用于食品、环境、药品、生物样品等领域的分析研究
发明内容
本发明要解决的技术问题是筛选出一株具有高效吸附铅性能的乳酸菌，为研制一种铅抵抗益生菌制剂，有效减少Pb2+在动物和人体的积累提供技术储备。本发明的技术方案是从动物的体内筛选出铅抗性的乳酸菌，经过一系列的生化鉴定，利用通用引物进行PCR扩增鉴定。通过发酵培养添加到动物饲料中，测定其对动物体内铅的清除作用，用ICP-MS方法测定血液、粪便、肌肉、内脏组织中的Pb2+。
附图是本发明所述的铅抗性乳酸菌的克隆及培养流程图，具体实施方式
:
1.耐铅乳酸菌的筛选
无菌采集动物肠道及粪便样品，利用传统的细菌分离技术在
MRS乳酸菌选择性培养基中进行分离，首先在含有不同Pb2+浓度的MRS液体培养基中尽心耐铅性驯化，选择筛选出耐铅浓度大于400mg/l的菌株。2.铅高效吸附菌株的筛选将筛选的耐铅菌株进行吸附效率测定，将目的菌接种于含Pb2+浓度为100mg/l的MRS液体培养基中37°C，140r/min振荡6h后测定Pb2+含量。3.目的菌株的生化鉴定
采用乳酸菌生化鉴定试剂盒进行生化鉴定，挑取一环活化的菌 株接种于试剂管中，倒插于泡沫板上，37°C温箱中培养24h。4.乳酸菌基因组提取
将保存的目的菌于LB中活化，采用CTAB/NaCl法提取乳酸菌 DNA。通过SDS裂解细胞，蛋白酶降解蛋白，CTAB去除多糖成分。5.扩增引物
16SrDNA扩增采用通用引物，正向引物为27f:
5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';反向引物 1541r:5' -AAGGAGGTGATCCAGCC-3'。6.PCR 扩增
在优化的PCR反应条件下进行PCR扩增，得到一段大小为1500bp的DNA产物。反应条件为预变性94°C，5min ;变性:94°C，lmin，退火:58 °C，lmin，延伸:72°C,2min，30 个循环；延伸:72°C，lOmin，4°C保存。25ul PCR反应体 系，IOXPCR Buffer 2.5 μ L, dNTP 终物质的量为 2pmol，Mg2+ 终物质的量为32.5pmol, 1.25U Taq酶、引物1、引物2引物终物质的量均为5pmol。7.体外吸附试验
模拟人工胃液和人工肠液的吸附环境进行Pb2+吸附试验。8.动物体内试验
选择家兔为试验对象，先进行铅中毒造模试验，造模成功后，
进行铅拮抗试验，每天早上9:00饲喂5ml乳酸菌发酵液，菌体浓度达到109cfu/ml，对照组饲喂相同剂量的饮用水。每3天进行耳动脉采血，测定血铅含量，并采集粪便测定铅的排泄。饲喂结束后，处死采集血液、粪便、肌肉、骨骼、内脏阻组织测定铅的含量，判断乳酸菌发酵液的体内清除效率。9.样品消解
各个样品均采用湿法消解，准确称量样品0.1000-0.5000g，使用 混合酸(硝酸:高氯酸=5:1)进行消解。10.1CP-MS 测定 Pb2+浓度
7700X电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)灵敏度和精确度高、检出限低，被认为是目前最灵敏的检测方法，已经广泛应用于食品、环境、药品、生物样品等领域的分析研究。通过ICP-MS测定染铅前血铅浓度为3.1304mg/l，铅中毒造模成功血铅浓度为
7.2992mg/l，饲喂本实验室筛选的乳酸菌后血铅浓度降低为2.136mg/l，与造模后相比体内清除率为70.74%，而且饲喂拮抗剂后血铅浓度低于染铅前的浓度，因此，此株抗铅菌株可以有效的清除体内的重金属铅。此外，内脏器官铅含量的测定显示，与对照组相比，肝脏中铅含量降低最明显，肾脏中也有所降低，但不明显。
权利要求
1.筛选鉴定的具有重金属铅吸附性的乳酸菌，是通过传统的细菌筛选方法从鸡的肠道及其排泄物中筛选得到的，由于该菌株是从动物肠道中筛选得到的，稳定性好，无致病性，可以在动物肠道内定殖等优点，减少进入肠道内重金属铅被机体吸收而蓄积于体内组织脏器； 方法如下: 步骤一，耐铅菌株的驯化，传统筛选 步骤二，高效吸附铅菌株筛选 步骤三，引物设计 步骤四，PCR扩增 步骤五，吸附液的制备 步骤六，动物体内吸附实验 步骤七，ICP-MS法测定铅含量 该菌株的特点是耐铅浓度高、稳定好、吸附效率高、安全性高。
2.根据权利要求1所述驯化及筛选方法，所筛选的目的菌为乳酸菌，所以选择乳酸菌选择性培养基MRS琼脂，其方法是首先在含低浓度(50mg/l)铅的MRS液体培养基中培养，再依次增加浓度进行驯化100，150，200mg/l，驯化的耐铅菌株在含铅的MRS琼脂平板上为白色圆菌落；分离纯化的耐铅菌株分别接种在含Pb2+ 0，250，300，350，400mg/l的液体培养基中，目的菌株可以耐受的Pb2+彡400mg/l。
3.根据权利要求1所述的筛选方法，通过测定菌株在培养基中 以及模拟胃肠道环境中对铅的吸附，筛选出高效吸附性的目的菌，其方法是筛选抗铅菌株按照1%的接种量接种于MRS液体培养基中培养18-24h达到生长对数期，取2ml培养液12000r/min离心IOmin收集菌体，菌体沉淀分别加入到IOmlMRS液体培养基，IOml模拟胃肠道环境的液体中，37°C，140r/min摇床吸附2h后离心取出菌体，上清液定容至50ml后测定铅的浓度；人工胃液的配制方法:9.5%-10.%的盐酸16.4ml，加水稀释使PH达到3.0 ； 每IOOml溶液中加入1.0g胃蛋白酶，混匀，用0.2um无菌滤膜过滤； 人工肠液的配制方法:称取磷酸二氢钾6.8g，加水500ml溶解，用0.4%的氢氧化钠溶液调PH至6.8，加水稀释至1000ml，每IOOml液体中加入1.0g胰蛋白酶混匀，用0.2um无菌滤膜过滤。
4.根据权利要求1所述的筛选方法，16SrDNA扩增采用通用引物，正向引物为27f:5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';反向引物 1541r:5' -AAGGAGGTGATCCAGCC-3'。
5.根据权利要求1所述的PCR反应条件，其特征是在该反应条件下，目的基因的扩增效果很好，所述反应条件为预变性94°C,5min ;变性:94°C, lmin,退火:58°C, lmin,延伸:72°C，2min，30 个循环；延伸:72°C，lOmin，4°C保存；25ul PCR 反应体系中，IOXPCR Buffer2.5μ L，dNTP终物质的量为2pmol，Mg2+终物质的量为32.5pmol, 1.25U Taq酶、引物1、引物2引物终物质的量均为5pmol。
6.根据权利要求1所述的吸附液的制备，方法是按1%的接种量接种于LB肉汤中，37°C,140r/min摇床培养至菌体的浓度为109cfu/ml，于4°C保存备用。
7.根据权利要求1所述的动物体内吸附实验，由于家兔适应性强，不易生病，价格合理等因素，故选择家兔为实验对象，其体重为2.21 ±0.2kg，饲喂一周观察健康后随机分组，每组6只，进行铅中毒造模，按照3mg/kg体重，饲喂5mg/ml的醋酸铅溶液，造模过程中每3天耳动脉采血测定血铅含量，不造成家兔体重明显变化，不降低其食物利用率，至血铅水平>600ug/l时停止铅染毒； 造模成功后，任然饲喂铅模拟每天通过饮食和饮水摄入体内的铅，同时，每天早上9:00根据家兔采食量的一半，实验组饲喂不同剂量的铅清除剂(乳酸菌吸附液)5ml/d，对照组饲喂相同剂量的饮用水，然后再添加充足的饲料，在清除过程中每一周耳动脉采血测定血铅浓度，并测定粪便铅的含量；3周后每组处死一半，采集血液、粪便、肝脏、心脏、肾脏、脑、肌肉、脂肪测定铅含量。
8.根据权利要求1所述的铅含量测定中，样品经过湿法消解后，采用7700X电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)，ICP-MS方法检出限低、干扰少、灵敏度高；铅元素校正曲线的相关系数R达到0.9 999，方法检出限为0.02205ppb。
全文摘要
本发明是从动物的肠道和排泄物中分离筛选出具有铅抗性和铅吸附性的乳酸菌，通过体外吸附和体内吸附研究，获得一株具有吸附铅性能的益生乳酸菌。获得的乳酸菌具有吸附铅性能，通过家兔体内试验证明该菌能够减少铅在体内的蓄积，具有促进血铅、内脏铅排泄的排铅解毒作用，没有络合副作用，不会造成钙、铁、锌等微量元素的损失。该菌株为乳酸菌，是肠道正常菌群之一，其生理效益比较明显，稳定性好，无致病性，可作为饲料或食品添加剂减少动物和人体内铅的蓄积。
文档编号C12N1/36GK103146633SQ20131007454
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月8日 优先权日2013年3月8日
发明者赵宏坤, 满兆红, 都启晶, 姜彦君, 范颖华, 李凤梅 申请人:青岛农业大学