专利名称：曲霉属菌株与内切壳聚糖酶的编码基因、制备与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种内切壳聚糖酶CsnW2的基因序列及其制备方法和应用。本发明还提供了该内切壳聚糖酶的重组质粒和重组基因工程菌株。本发明的内切壳聚糖酶CsnW2可广泛应用于化工、农业、食品、饲料添加及医药等领域。
背景技术：
壳聚糖(chitosan)，又名聚氨基葡萄糖、壳多糖、脱乙酰甲壳素、脱乙酰甲壳质、可溶性几丁质、壳糖胺、甲壳多聚糖和聚甲壳糖等，化学名为聚β - (I — 4) -2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖。壳聚糖是几丁质经过脱乙 酰基得到的产物，一般几丁质的脱乙酰度超过50%时被认为是壳聚糖。壳聚糖广泛存在于虾、蟹、昆虫外壳以及藻类和菌类的细胞壁中。由于其分子量较大，水溶性差，使其广泛应用受到了很大限制。但其降解产物，一系列壳寡糖和氨基葡萄糖具有独特的生理活性和功能性质，如调节免疫、抗肿瘤、抗菌、降低胆固醇和促进钙的吸收，且易溶于水，是一种新兴的功能性低聚糖，在食品、医药、农业和化妆品等领域有广泛的应用。目前，制备壳寡糖的方法主要有化学法、物理法和生物法。但化学条件苛刻，反应的稳定性和重复性差，产物聚合度不易控制，污染严重，不易得到聚合度相对均一的低聚壳寡糖。物理法得到的产物聚合度也不易控制，其重复性也较差，所以温和、高效、产物易控制和稳定无污染的生物法逐渐引起了人们的关注。生物法制备壳寡糖是利用自然界中存在的生物，特别是微生物产生的各种壳聚糖酶来降解壳聚糖，如何获得高产壳聚糖酶的微生物菌株和闻酶活的壳聚糖酶的研究备受:关注。壳聚糖酶分布非常广泛，目前已从细菌(如:Bacillus、Myxobacter>Enterobacter)、放线菌(如:Streptomyces、Nocardioides)、霉菌(如:Aspergillus、Penicillium)、病毒(如chlorella virus PBCV_1、CVK_2)及植物的不同组织中检测到壳聚糖酶的存在。目前壳聚糖酶的分类有两种方式。一是根据酶对糖苷键的水解分类，根据酶的底物特异性将壳聚糖酶分为3类:第I类主要是可以水解GlcNAc-GlcN和GlcN-GlcN糖苷键的壳聚糖酶，如来自Bacillus pumilus BN-262和Streptomyces sp.N174的壳聚糖酶；第2类只能水解GIcN-GIcN键，产生这一类酶的菌株目前只有Bacillus sp.N0.7_M ;第3类既可水解GIcN-GIcN键，又可水解GlcN-GlcNAc键，产酶菌株包括S.gmeus HUT6037和B.circulansMH.Kl等。即壳聚糖酶1、I1、III类。二是根据酶的氨基酸序列分类，壳聚糖酶主要分布在糖苷水解酶家族5、8、46、75和80五个家族。其中细菌来源的壳聚糖酶主要属于46家族，真菌来源的壳聚糖酶主要属于75家族。两族壳聚糖酶同源性差，而目前细菌来源的壳聚糖酶研究较多，对于真菌，尤其是来源于棒曲霉的壳聚糖酶研究较少。目前来源于棒曲霉的壳聚糖酶基因的克隆与表达未见报道
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种产壳聚糖酶的曲霉属菌株，其为棒曲霉W-2，分类命名:棒曲霉 Aspergillus clavatus,保藏编号:CGMCC N0.7018。本发明的第二个目的是提供一种新型高效的内切壳聚糖酶CsnW2及其编码基因。本发明的第三个目的是提供一种制备新型高效内切壳聚糖酶CsnW2的方法。本发明的第四个目的是提供含有所述的内切壳聚糖酶CsnW2基因的基因工程表达体系。本发明的第五个目的是提供新型高效内切壳聚糖酶CsnW2在壳聚糖降解中的应用。本发明所提供的内切壳聚糖酶CsnW2，来源于土壤中分离纯化的曲霉属菌株Aspergillus clavatus w_2,其氨基酸序列具有如下特征之一:I)序列表中SEQ ID N0.3从氨基端开始的第1_242或第18-242位氨基酸残基序列；2)将序列表中的SEQ ID N0.3从氨基端开始的第1_242或18-242位氨基酸残基序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加后，具有降解壳聚糖活性的蛋白质；3)与序列表中SEQ ID N0.3所限定的氨基酸序列的同源性达到90%及以上且具有降解壳聚糖活性的蛋白质。本发明还提供了内切壳聚糖酶CsnW2的编码基因(命名为csnW2)，具有下述核苷酸序列特征之一:I)具有序列表中SEQ ID N0.1的核糖核酸(RNA)序列和SEQ ID N0.2的脱氧核糖核酸(DNA)序列；2)编码SEQ ID N0.3氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；3)具有与序列表中SEQ ID N0.2所限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到90%及以上，且能编码降解壳聚糖的蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列。本发明的壳聚糖酶CsnW2的氨基酸序列及其核苷酸编码序列也可以根据预测的Csnff2的氨基酸序列及其核苷酸编码序列人工合成获得。制备重组酶CsnW2的方法，是将编码基因csnW2克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的内切壳聚糖酶。所述的重组表达内切壳聚糖酶CsnW2的表达载体可以是大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体等。 用于重组表达内切壳聚糖酶CsnW2的重组菌或转基因细胞系，可以是大肠杆菌宿主细胞(如 Escherichia coli BL21、Escherichia coli JM109、Escherichiacoli DH5 α 等)、酵母菌宿主细胞(如 Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、Kluyveromyces Iactis 等)、枯草杆菌宿主细胞(如 Bacillus subtilis R25、Bacillussubtilis9920等)、乳酸菌宿主细胞(如Lactic acid bacteria C0CC101等)、放线菌宿主细胞(如 Streptomyces spp.等)、丝状真菌宿主细胞(如 Trichoderma viride, Trichodermareesei, Aspergillus niger、Aspergillus nidulans 等)、昆虫细胞(如 Bombyx mori,Antharaea eucalypti等)或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞CH0，幼小仓鼠肾脏细胞BHK、中国仓鼠肺细胞CHL等)。
本发明的CsnW2来源于土壤中分离纯化的曲霉属菌株Aspergillus clavatusw-2。其基因和氨基酸序列通过Race的方法克隆得到。具体方法:(I)内切壳聚糖酶CsnW2其3’端mRNA序列的克隆。真菌18S及形态观察初步鉴定菌株为棒曲霉。通过对同源性较近的菌株中壳聚糖酶的序列进行同源比对。找出约7个氨基酸的保守序列；再对对应的mRNA进行同源比对，设计一条简并引物。提取棒曲霉w-2的总RNA，按照Takara RNA PCR Kit (Ver.3.0)说明书进行RT-PCR扩增。经过两轮PCR扩增的产物用1%的琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带并与PMD19-T载体连接，转化ToplO，经PCR鉴定后送上海英骏生物技术有限公司北京测序部测序，得到3’端mRNA序列。(2)内切壳聚糖酶CsnW2其5’端mRNA序列的克隆:基于上述方法得到的3’端mRNA,设计两条反向引物。按照 Clontech SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit 说明书进行5’ RACE。经过两轮PCR扩增的产物用1%的琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带并与pMD19-T载体连接，转化ToplO，经PCR鉴定后送上海英骏生物技术有限公司北京测序部测序，得到5’端mRNA序列。(3)将3’和5’ Race结果进行拼接，并进行生物信息学分析。在NCBI上对开放阅读框分析，进而推导出内切壳聚糖酶CsnW2的氨基酸序列。设计相应的引物，以mRNA为模板进行反转录和PCR，PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带并与pMD19-T载体连接，转化ToplO，经PCR鉴定后送上海英骏生物技术有限公司北京测序部测序，得到全长序列。上述内切壳聚糖酶基因编码区长729bp，编码了 262个氨基酸，分子量约29kD，属于壳聚糖酶家族75。毕赤酵母重组表达获得的CsnW2，以壳聚糖为底物时，在40°C _60°C、pH3.5-5.0的条件下具有较高活性。本发明提供的壳聚糖酶CsnW2可广泛应用于化工、农业、食品、饲料添加和医药等领域，具有较大的生产潜力和 经济价值。序列表SEQ ID N0.1 AUGCGCUAUCUUGCAACUGCUGCCGUUUUGGCUGGAGCAGGCCUGGCCUCGGCCUAUAGUGUCCCAGCCAACCUACAGCAAAUCUAUAACAAACACAAGACCGGAACAUGCCAGAACAAGCUGCAAGACGGUUUUUCCGAUGGCAUCAGCGGCCCCGGCACCUCCGCCUACUGCGGCGACAUCCAGGGGGCGAUCUUCCUUCUAGCUCCGCCAAUGGCGGCCA⑶AUGAUAACAUGGACAUUGACUGCGAUGGAGCGAACAACAGCGGCGGCGACUGUGCGAAUGAUCCCUCCGGCCAGAGCAUGACGGC⑶UCAUGGAUACGGUGAAGCAAUACGGCAUUUCGGAUCUGGACGCCAACAUCCACCCGUACGUGGUGUUUGGUAACUCGGGCAGCUCGCCG
ACCUUUGAUCCUCAGCA⑶AUGGAAUGCAGCC⑶UAAGCGUGAUGGCUGUGGUGUGCAAUAAUCAGCUGUUCUAUGGUGUCUGGG⑶GACACCAACG⑶GAUAUCGCUACUGGGGAGGCUUCCAUCUCGCUGGCCAAAU 腳⑶ UUCCCCAAUGAUG ⑶ A
UCACCG ⑶ GACAAUGGCCAUGACCAGGACGA 腳 ACUCUACAUUGGGUUUACGGGGCAGGAUACUGUCCCCGGUGCUAGUGCUGCCUGGACUGCUAGCGACACUUCAACCUUUGAGGAGA⑶AUCAAGG ⑶ CUCG ⑶ GAUCGCCU 腳 UGCUAAGCUUAGCGCUUAASEQ ID N0.2ATGCGCTATCTTGCAACTGCTGCCGTTTTGGCTGGAGCAGGCCTGGCCTCGGCCTATAGTGTCCCAGCCAACCTACAGCAAATCTATAACAAACACAAGACCGGAACATGCCAGAACAAGCTGCAAGACGGTTTTTCCGATGGCATCAGCGGCCCCGGCACCTCCGCCTACTGCGGCGACATCCAGGGGGCGATCTTCCTTCATAGCTCCGCCAATGGCGGCCAGTATGATAACATGGACATTGACTGCGATGGAGCGAACAACAGCGGCGGCGACTGTGCGAATGATCCCTCCGGCCAGAGCATGACGGCGTTCATGGATACGGTGAAGCAATACGGCATTTCGGATCTGGACGCCAACATCCACCCGTACGTGGTGTTTGGTAACTCGGGCAGCTCGCCGACCTTTGATCCTCAGCAGTATGGAATGCAGCCGTTAAGCGTGATGGCTGTGGTGTGCAATAATCAGCTGTTCTATGGTGTCTGGGGTGACACCAACGGTGATATCGCTACTGGGGAGGCTTCCATCTCGCTGGCCAAATTGTGTTTCCCCAATGATGGTATCACCGGTGACAATGGCCATGACCAGGACGATGTACTCTACATTGGGTTTACGGGGCAGGATACTGTCCCCGGTGCTAGTGCTGCCTGGACTGCTAGCGACACTTCAACCTTTGAGGAGAGTATCAAGGGTCTCGGTGATCGCCTTGTTGCTAAGCTTAGCGCTTAASEQ ID N0.3MRYLATAAVLAGAGLASAYSVPANLQQIYNKHKTGTCQNKLQDGFSDGISGPGTSAYC⑶IQGAIFLHSSANGGQYDNMDIDCDGANNS
GGDCANDPSGQSMTAFMDTVKQYGISDLDANIHPYVVFGNSGSSPTFDPQQYGMQPLSVMAVVCNNQLFYGVWGDTNGDIATGEASISLAKLCFPNDGITCDNGHDQDDVLYIGFTGQDTVPGASAAWTASDTSTFEESIKGLGDRLVAKLSA
图1:重组内切壳聚糖酶CsnW2表达及纯化的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(SDS-PAGE)。各泳道加入的样品分别是:M:蛋白质标识物(marker),条带自上至下大小为170kD, 130kD,IOOkD, 70kD, 55kD, 40kD, 35kD, 25kD ;泳道 1:发酵液上清，上样量 20 μ 1，泳道 2:1OOmmol 的咪唑洗脱收集液，上样量20 μ I。图2:ρΗ值对内切壳聚糖酶CsnW2的活性影响曲线。图3:温度对内切壳聚糖酶CsnW2的活性影响曲线。 图4:壳聚糖酶CsnW2降解壳聚糖所得产物的HPLC图
曲霉属的菌株,其为棒曲霉W-2,分类命名:棒曲霉Aspergillus clavatus,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号=CGMCC N0.7018，保藏日期2012年12月18日。
具体实施例方式本发明制备该新型壳聚糖酶的方法，即利用基因工程的技术方法，将该新壳聚糖酶的基因克隆到毕赤酵母表达载体上，获得可异源表达该酶的毕赤酵母重组菌株，用该菌株异源表达制备的壳聚糖酶CsnW2在pH3.5-5.0和40°C _60°C下有较高活性，具有降解壳聚糖制备壳寡糖的功能。实施例1曲霉属菌株Aspergillus clavatus W-2的培养及生产壳聚糖酶所米用的菌种为棒曲霉，挑取Aspergillus clavatus W-2 菌株(CGMCC N0.7018)的单克隆接种到30ml液体培养基中，接着放入温度为30°C、转数为150rpmin的摇床培养4
天后，将培养液离心收集上清培养基。使用的液体培养基配方为(g/L):壳聚糖5.0g、酵母浸粉0.5g、NaCl0.5g、MgS04.7Η201.44g、CaC120.lg、KC10.5g、K2HP042.0g、KH2P041.0g，pH 值为 7.0，余量为水。酶活力单位(U)定义:每分钟催化壳聚糖产生I μ mol还原糖所需要的酶量。根据DNS法测得Aspergillus clavatus ff-2菌株的液体培养基上清中酶活为0.53U/ml。实施例2Aspergillus clavatus ff-2 菌株总 RNA 的提取将菌株进行4天 培养，用纱布过滤，将菌体直接放入液氮保存。从中取约40mg菌体，在液氮下研磨三次。之后加Iml Trizol试剂，待融解后移入1.5ml离心管。向体系中加入200ul氯仿,剧烈震荡，静置5min, 12000rpm离心15min。小心取上清到新离心管中，加入等体积的异丙醇，静置5min, 12000rpm离心lOmin。倒掉上清，向沉淀中加体积浓度为75%的乙醇lml，7500rpm离心5min。最后将沉淀用无核糖核酶活性的水20_50ul融解。放-80°C保存待用。实施例3csnW2基因3’端mRNA序列的克隆按宝生物工程(大连)有限公司3’ -Full RACE Core Set Ver.2.0 (TakaraCode:D314)说明书中操作步骤，以其中的3’ RACEAdaptor为引物，Aspergillusclavatus ff-2菌株总RNA为模板反转录合成cDNA的第一条链；以3’ RACE OuterPrimer(TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT)和 SP Primer(ATGGAYATCGACTGYGAYGG)为引物进行第一轮 PCR，其反应条件为:94°C 3min,30 个循环(94°C 30sec,55°C 30sec,72°C 1.2min),72°C IOmin ;#3’RACE Inner Primer (CGCGGATCCTACCGTCGTTCCACTAGTGATTTCACTATAGG)和SP Primer(ATGGAYATCGACTGYGAYGG)为引物进行第二轮 PCR，反应条件为:94°C 3min，30 个循环(94°C 30sec，58°C 30sec，72°C 1.2min),72°C IOmin0 将两轮 PCR 产物用 1% 琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带并与PMD19-T载体连接，转化入ToplO，经菌落PCR验证后送上海英骏生物技术有限公司测序。实施例4csnW2基因5’端mRNA序列的克隆按照Clontech SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit 说明书要求，对Aspergillus clavatus W-2菌株总RNA的进行前处理；以3’端序列为参照，设计两条弓丨物，5RACE Outer sp Wl (GGACACGAACGTATCAAATCGACTA)和 5RACE Inner sp Wl(TCCTGCCCCGTAAACCCAA);以5RACE Outer sp Wl为引物，前处理总RNA为模板进行反转录合成cDNA的第一条链；以5RACE0uter sp Wl和试剂盒中UPMlOX引物，以上述cDNA第一条链为模板进行第一轮PCR，反应条件为:94°C 3min，25个循环(94°C 30sec，68°C 30sec,72°C 1.5min)，72°C IOmin ;以 5RACE Inner sp Wl 和UPMlOX为引物，以一轮PCR产物为模板进行第二轮PCR，反应条件为:94°C 3min，30 个循环(94°C 30sec,58°C 30sec,72°C 1.5min),72°C IOmin0将两轮PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带与pMD19_T载体(Takara:D102A)连接构成重组质粒pMD19-T_csnW2，转化入大肠杆菌(ToplO)，经菌落PCR验证后送上海英骏生物技术有限公司测序。实施例5csnW2基因在大肠杆菌中的重组表达以上述实施例4中的重组质粒pMD19-T_csnW2为模板，用下述引物对进行PCR扩增。引物对如下:正向引物 Nde1-SignalP-F (GCCCATATGTATAGTGTCCCAGCCAACC)，反向引物Xho1-SignalP+ATG-R (AATGAGCTCCACGAACGTATCAATCGACTA),正向引物下划线标注的是限制性内切酶Ned I位点，反向引物下划线标注的是限制性内切酶Xho I位点。DNA聚合酶(DRR200A)购自宝生物公司，PCR反应体系按照公司提供的产品说明操作。PCR反应条件:94°C预变性5分钟，然后94°C变性30sec-50°C退火30sec_72°C延伸lmin，30个循环，最后72°C延伸IOmin。将PCR产物用Ned I和Xho I双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收酶切的PCR产物。将购于美国Novagen公司的产物pET_23b载体用Ned I和Xho I双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收酶切载体。Ned I和Xho I均购于宝生物公司，酶与底物反应的体系、温度和时间均按照公司提供的产品说明操作。将经过双酶切的PCR产物与同样经过双酶切pET_23b载体连接，连接产物转化大肠杆菌(ToplO)菌株后涂布于含有50 μ g/ml氨节西林的Luria-Bertani培养基(胰蛋白胨1%，氯化钠0.5%，酵母粉0.5%，琼脂2%)固体平板上，37°C培养12h，挑取单克隆；将单克隆接入含有50 μ g/ml氨节西林的液 体Luria-Bertani培养基中培养,提取质粒；将质粒用上述正向引物Nde1-SignalP-F和反向引物Xho1-SignalP+ATG-R进行菌落PCR验证，结果得到大小正确的扩增产物，初步证明构建的重组质粒正确；接着将该重组质粒送去上海英骏生物技术有限公司测序，结果表明，在pET-23b的Ned I和Xho I酶切位点之间插入SEQ IDN02所示的csnW2基因，且插入方向正确，所以进一步证明构建的重组质粒正确。将上述重组质粒转化大肠杆菌菌株BL21 (DE3)(购自美国Novagen公司),然后按照该公司提供的操作步骤进行壳聚糖酶CsnW2诱导表达及纯化。实施例6csnW2基因在毕赤酵母X33中的重组表达以实施例4中的重组质粒pMD19-T_csnW2为模板，用下述引物对进行PCR扩增。引物对如下:正向引物 Xho 1-S i g-F: (GACCTCGAGAAAAGATATAGTGTCCCTGCCAACC )，反向引物Xbal-Sig+His-R: (GACTCTAGAAGCGCTAAGTTTAGCAAC)，正向引物下划线标注的是限制性内切酶Xho I位点，反向引物下划线标注的是限制性内切酶Xba I位点。DNA聚合酶(DRR200A)购自宝生物公司，PCR反应体系按照公司提供的产品说明操作。PCR反应条件:94°C预变性5分钟，然后94°C变性30sec-5(TC退火30sec_72°C延伸lmin，30个循环，最后72°C延伸IOmin0将PCR产物用Xho I和XbaI双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收酶切的PCR产物。将购于美国Invitrogen公司的产物pPICZ a A载体用Xho I和Xba I双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收酶切载体。Xho I和Xba I均购于宝生物公司，酶与底物反应的体系、温度和时间均按照公司提供的产品说明操作。将经过双酶切的PCR产物与同样经过双酶切pPICZ a A载体连接，连接产物转化大肠杆菌ToplO菌株后涂布于含有50 μ g/ml氨节西林的Luria-Bertani培养基固体平板上，37°C培养12h，挑取单克隆；将单克隆接入含有50 μ g/ml氨苄西林的液体Luria-Bertani培养基中培养，提取质粒；将质粒用正向引物Xho1-Sig-F (GACCTCGAGAAAAGATATAGTGTCCCTGCCAACC)和反向引物 Xbal-Sig+His-R (GACTCTAGAAGCGCTAAGTTTAGCAAC)进行菌落 PCR 验证，结果得到大小正确的扩增产物，初步证明构建的重组质粒正确；接着将该重组质粒送去上海英骏生物技术有限公司测序，结果表明，在pPICZ a A的Xho I和Xba I酶切位点之间插入SEQ IDN02所示的csnW2基因，且插入方向正确，所以进一步证明构建的重组质粒正确。将上述重组质粒用 SacI进行线性化,然后按照Invitrogen公司毕赤酵母表达手册进行电转入X33和筛选，得到高拷贝的转化株。用该公司提供的操作步骤进行壳聚糖酶CsnW2诱导表达及纯化，结果如图1所示，纯化后的壳聚糖酶CsnW2在电泳胶上呈单一条带，且位置与预测的分子量相吻合。实施例7壳聚糖酶CsnW2的酶学性质分析(I) pH和温度对酶活性的影响将质量为Ig的壳聚糖(脱乙酰度90%)底物溶于IOOml不同pH值的50mM醋酸钠-醋酸缓冲液(pH范围为3.6-6.0),配制成质量浓度为1%底物，并与纯化的CsnW2酶液按1000:1 (体积比)的比例混合后，在40°C反应30分钟，按前述的DNS法测酶活力。结果显示CsnW2在pH4.0时达到最大活力，表明CsnW2的最适反应pH为4.0 (如图2)在最适pH下，将质量浓度为1%壳聚糖底物与纯化的CsnW2酶液按1000:1 (体积t匕)的比例混合，分别在不同温度(30°C -70°C)反应30分钟，按前述的DNS法测酶活力。结果显示CsnW2在50°C时达到最大活力，表明CsnW2的最适反应温度为50°C (如图3)。在最适pH和最适温度下，将质量浓度为1%壳聚糖底物与纯化的CsnW2酶液按1000:1 (体积比)的比例混合后反应30分钟，按前述的DNS法测酶活力。用购于北京索莱宝公司的蛋白质定量试剂盒测定CsnW2酶液的蛋白含量，结果表明重组CsnW2对壳聚糖的比活为1852U/g。(2) pH和温度对酶稳定性的影响将在不同温度(30°C -70°C )下热处理30分钟后的CsnW2酶液与质量浓度为1%的壳聚糖底物溶液(PH4.0)按1000:1(体积比)的比例混合，然后在最适温度下测定剩余酶活，以不经过热处理的酶液酶活定义为100%相对活力(relativie activity),结果表明CsnW2在低于40°C的温度下具有较好的热稳定性。将在30°C，不同的pH (PH3-10)预孵育24h后的CsnW2酶液与质量浓度为1%壳聚糖底物溶液(PH4.0)按1000:2(体积比)的比例混合，然后在最适温度下测定剩余酶活，以不经过pH处理的酶液酶活定义为100%相对活力(relativie activity),结果显示在pH4
10的范围内，Csnff2酶活仍保持60%以上，表明CsnW2对pH值耐受范围较广。(3) Csnff2的底物偏好性将纯化的CsnW2分别与质量浓度为1%的壳聚糖、胶体几丁质和羧甲基纤维素三种不同底物按1000:1 (体积比)的比例混合，然后在50°C，pH5.0条件下反应30分钟，按前述DNS法测反应液中是否有还原糖产生来确定其活性。结果表明以羧甲基纤维素为底物没有明显的活性。实施例8金属离子对CsnW2活性的影响向质量浓度为1%壳聚糖底物(pH4.0)中添加终浓度IOmM的不同的金属离子，如:Na+，K+，Mg2+，Ca2+，Co2+，Mn2+，Fe3+，Cu2+or Ag+ (AgN03)，然后与纯化的 CsnW2 酶液按1000:1 (体积比)的比例混合，并在40°C反应30分钟，按前述的DNS法测酶活力。对照组为不加任何金属离子时CsnW2的活性(设定为100%)。结果显示Mg2+和Mn2+能增加CsnW2活性(约1-2倍)；Fe3+, Cu2+和Ag+对酶活呈现抑制作用。实施例9CsnW2降解壳聚糖所得产物的高效液相色谱(HPLC)分析将质量浓度为1%的壳聚糖(ρΗ4.0)与纯化的CsnW2按1000:1 (体积比)的比例混合，然后在50°C下反应，选取不同酶解时间(111，211，511，1011)的产物进行高效液相色谱分析。高效液相色谱采用离子交换色谱柱:CarboPac PAl (DIONEX, ColumnN0.35391，4X250mm, 1.D.with particle size of10 μ m);检测器:Coulochem
II(ESA, USA);柱温:30 °C ;流动相:90mM NaOH ;流速:0.4mL/min。其中酶解10小时的高效液相色谱图如图4所示。色谱图显示CsnW2降解壳聚糖10小时的产物中有一系列不同聚合度的壳寡糖，该结果充分证明了 CsnW2属于内切壳聚糖酶。因此，内切壳聚糖酶CsnW2可被用于壳寡糖的制备以及与壳聚糖降解相关的领域，包括化工、农业、食品、饲料添加 、医药及海藻遗传工程等。
权利要求
1.曲霉属的菌株，其为棒曲霉W-2,分类命名:棒曲霉Aspergillusclavatus,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号=CGMCC N0.7018，保藏日期2012年12月18日。
2.—种来源于权利要求1所述菌株(Aspergillus clavatus)的内切壳聚糖酶基因csnW2，其核苷酸序列具有如下特征之一: 1)具有序列表中SEQID N0.1的核糖核酸(RNA)序列或SEQ ID N0.2的脱氧核糖核酸(DNA)序列； 2)编码SEQID N0.3氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列； 3)具有与序列表中SEQID N0.2所限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到90%及以上，且能编码降解壳聚糖的蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列。
3.按照权利要求2所述的内切壳聚糖酶基因编码的内切壳聚糖酶，其编码的氨基酸序列具有如下特征之一: 1)序列表中SEQID N0.3从氨基端开始的第1_262或第18-262位氨基酸残基序列； 2)将序列表中的SEQID N0.3从氨基端开始的第1-262或18-262位氨基酸残基序列经过氨基酸残基的取代、缺失、添加中的一种或二种以上后，具有降解壳聚糖活性的蛋白质； 3)与序列表中SEQID N0.3所限定的氨基酸序列的同源性达到90%及以上且具有降解壳聚糖活性的蛋白质。
4.一种制备如权利要求3所述的内切壳聚糖酶的方法，其特征在于:是将权利要求2所述的内切壳聚糖酶基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的内切壳聚糖酶； 所述的重组表达内切壳聚糖酶的表达载体，是指大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体； 所述的重组表达内切壳聚糖酶的宿主细胞，是指大肠杆菌宿主细胞(如Escherichiacoli BL21、Escherichia coli JM109、Escherichia coli DH5 α 等)、酵母菌宿主细胞(如Saccharomyces cerevisiae>Pichia pastoris>Kluyveromyces Iactis 等)、枯草杆菌宿主细胞(如Bacillus subtilis R25、Bacillus subtilis9920等)、乳酸菌宿主细胞(如Lacticacid bacteria C0CC101等)、放线菌宿主细胞(如Streptomyces spp.等)、丝状真菌宿主细胞(如 Trichoderma viride, Trichoderma reesei, Aspergillus niger、Aspergillusnidulans等)、昆虫细胞(如Bombyx mori, Antharaea eucalypti等)，哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞CH0，幼小仓鼠肾脏细胞BHK、中国仓鼠肺细胞CHL等)中的一种。
5.一种如权利要求3所述的内切壳聚糖酶在壳聚糖降解中的应用，其特征在于:具有如下用途之一或二种以上； 1)用于断裂壳聚糖或几丁质的糖苷键，获得壳寡糖或几丁寡糖； 2)用于降解虾蟹壳或昆虫外壳中的几丁质和壳聚糖组分，抽提色素或其中的蛋白，色素和其中的蛋白可以应用于食品及其他研究。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于:所述内切壳聚糖酶CsnW2与其他壳聚糖酶、脱乙酰酶及几丁质结合蛋白混合后，用于协同断裂壳聚糖糖苷键方面的应用。
全文摘要
本发明公开了一种内切壳聚糖酶CsnW2的基因序列及其制备方法与应用。本发明所涉及的内切壳聚糖酶CsnW2来源土壤新分离菌株Aspergillus clavatus。本发明还提供了一种制备该新型壳聚糖酶的方法，即利用基因工程的技术方法，将该新壳聚糖酶的基因克隆到毕赤酵母表达载体上，获得可异源表达该酶的毕赤酵母重组菌株，用该菌株异源表达制备的壳聚糖酶CsnW2在pH3.5-5.0和40℃-60℃下有较高活性，具有降解壳聚糖制备壳寡糖的功能。本发明提供的壳聚糖酶CsnW2可广泛应用于化工、农业、食品、饲料添加和医药等领域，具有较大的生产潜力和经济价值。
文档编号C12P19/26GK103215192SQ20131007471
公开日2013年7月24日 申请日期2013年3月8日 优先权日2013年3月8日
发明者杜昱光, 张建平, 曹海龙, 岳敏, 黄李淑馨, 李曙光, 赵勇, 刘航 申请人:中国科学院大连化学物理研究所